專利名稱：一種細(xì)胞色素P450基因dsRNA及其在抑制蚜蟲生長中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種細(xì)胞色素P450基因dsRNA及其在抑制蚜蟲生長中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
麥蚜(尤其是麥長管蚜)是危害中國小麥生產(chǎn)的主要害蟲之一，據(jù)統(tǒng)計，中國每年小麥蚜蟲危害面積可高達(dá)O. 17億公頃，占小麥總種植面積的62%，造成減產(chǎn)15% — 30%，嚴(yán)重時可高達(dá)50%。桃蚜是廣食性害蟲，寄主約有350多種，主要危害煙草、桃、李、梅、梨等果樹和白菜、蘿卜、辣椒、菠菜等蔬菜，造成了很大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來，由于全球氣候變暖、耕作制度變化等因素，使蚜蟲的繁殖能力和適應(yīng)性顯著增強(qiáng)，其危害日趨嚴(yán)重。目前，蚜蟲防治以噴灑農(nóng)藥為主，但大量使用農(nóng)藥，不僅對人畜有害，而且造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。培育抗 蚜蟲小麥和蔬菜品種是防止蚜蟲危害的最有效途徑，但由于現(xiàn)有種質(zhì)資源中缺乏有效的抗蚜基因，抗性機(jī)制尚不明確，常規(guī)育種難以奏效。挖掘和利用新型抗蚜基因并通過基因工程培育小麥和蔬菜抗蚜新種質(zhì)具有重要意義。植物介導(dǎo)的RNAi技術(shù)已成為農(nóng)作物抗蟲基因工程的熱點(diǎn)之一，通過寄主植物表達(dá)相應(yīng)昆蟲特異基因的dsRNA，昆蟲取食植物后沉默其相應(yīng)的基因從而達(dá)到控制害蟲危害的目的。RNAi現(xiàn)象其作用過程是雙鏈RNA( dsRNA)進(jìn)入生物體內(nèi)，被Dicer酶切割成2l_23nt的siRNA，siRNA與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物結(jié)合，與互補(bǔ)序列的靶mRNA結(jié)合，被Dicer識別，造成靶基因表達(dá)量的下降。近年來，利用dsRNA體外飼喂或注射來篩選RNA靶標(biāo)基因，導(dǎo)致靶標(biāo)基因表達(dá)和沉默，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于昆蟲生長發(fā)育關(guān)鍵基因的鑒定和功能分析。孟山都公司通過植物介導(dǎo)的昆蟲腸道特異基因RNAi技術(shù)成功獲得了抗玉米根螟的轉(zhuǎn)基因玉米，有效緩解了長期應(yīng)用Bt轉(zhuǎn)基因玉米誘發(fā)昆蟲產(chǎn)生抗性等問題，目前已完成生產(chǎn)性試驗(yàn)。棉鈴蟲腸道中特異P450基因可提高棉鈴蟲幼蟲對棉花次生代謝物質(zhì)和棉酚的耐受性，試驗(yàn)表明，利用表達(dá)棉鈴蟲P450基因dsRNA的轉(zhuǎn)基因煙草和棉花葉片飼喂棉鈴蟲幼蟲，可導(dǎo)致幼蟲體內(nèi)P450基因的表達(dá)量下降，同時幼蟲發(fā)育受阻，表現(xiàn)出抗棉鈴蟲性能；Zha等從褐飛虱中腸中克隆了 3個高度表達(dá)的基因N1HT1、Nlcar和Nltry，構(gòu)建載體，轉(zhuǎn)化水稻，褐飛虱取食轉(zhuǎn)基因水稻后，體內(nèi)3種基因的mRNA表達(dá)水平下降了 40%到70%，并且在水稻的篩管部發(fā)現(xiàn)了 dsRNA和siRNA的存在。Pitino等將桃蚜的MpC002 (主要在唾液腺中表達(dá))和Rack-I(主要在腸道中表達(dá))2個基因分別導(dǎo)入煙草和擬南芥中，用轉(zhuǎn)基因植物飼喂桃蚜，導(dǎo)致桃蚜體內(nèi)的MPC002或Rack-I的表達(dá)量降低了高達(dá)60%，蚜蟲的產(chǎn)仔數(shù)目減少。小麥和蔬菜抗蚜蟲種質(zhì)資源缺乏，抗性機(jī)制尚不明確，常規(guī)育種難以奏效，每年給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。迫切需要挖掘和鑒定新型抗蚜基因并通過基因工程育種提高小麥和蔬菜抗蚜特性
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供了一種dsRNA。本發(fā)明提供的dsRNA，為如下I)或2):I)由序列表中序列4所示的核苷酸和其反向互補(bǔ)序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA ；2)由序列表中序列5所示的核苷酸和其反向互補(bǔ)序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA。上述dsRNA的編碼基因也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；所述編碼基因具體為如下I)或2):1)為序列表中序列I所示的核苷酸；2)為序列表中序列2所示的核苷酸。上述dsRNA或上述的編碼基因在防治蚜蟲和/或制備防治蚜蟲產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。 上述應(yīng)用中，所述防治蚜蟲體現(xiàn)在促進(jìn)蚜蟲死亡和/或抑制蚜蟲生長。上述應(yīng)用為將上述dsRNA導(dǎo)入蚜蟲，實(shí)現(xiàn)促進(jìn)蚜蟲死亡和/或抑制蚜蟲生長；所述導(dǎo)入具體為飼喂；所述蚜蟲具體為麥長管蚜或桃蚜；所述促進(jìn)蚜蟲死亡和/或抑制蚜蟲生長具體通過抑制蚜蟲體內(nèi)細(xì)胞色素P450的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。上述dsRNA或上述的編碼基因在促進(jìn)蚜蟲死亡和/或抑制蚜蟲生長中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；所述蚜蟲具體為麥長管蚜或桃蚜。上述dsRNA或上述的編碼基因在抑制蚜蟲體內(nèi)細(xì)胞色素P450的表達(dá)中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；所述蚜蟲具體為麥長管蚜或桃蚜。含有上述dsRNA或上述的編碼基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。上述重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒在如下1)-5)中至少一種中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍1)防治蚜蟲；2)制備防治蚜蟲產(chǎn)品；3)促進(jìn)蚜蟲死亡；4)抑制蚜蟲生長；5)抑制蚜蟲體內(nèi)細(xì)胞色素P450的表達(dá)；所述蚜蟲具體為麥長管蚜或桃蚜。本發(fā)明的另一個目的是提供一種防治蚜蟲的產(chǎn)品或一種抑制蚜蟲體內(nèi)細(xì)胞色素P450表達(dá)的物質(zhì)或所述抑制蚜蟲體內(nèi)細(xì)胞色素P450表達(dá)的物質(zhì)的應(yīng)用。本發(fā)明提供的產(chǎn)品，其活性成分為如下A-C A、上述 dsRNA;B、上述的編碼基因；C、上述重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒。本發(fā)明提供的一種抑制蚜蟲體內(nèi)細(xì)胞色素P450表達(dá)的物質(zhì)為上述A-C ；本發(fā)明提供的所述抑制蚜蟲體內(nèi)細(xì)胞色素P450表達(dá)的物質(zhì)在如下I) -5)中至少一種中的應(yīng)用1)防治蚜蟲；2)制備防治蚜蟲產(chǎn)品；3)促進(jìn)蚜蟲死亡；4)抑制蚜蟲生長；5)抑制蚜蟲體內(nèi)細(xì)胞色素P450的表達(dá)；所述蚜蟲具體為麥長管蚜或桃蚜。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明得到麥長管蚜和桃蚜的細(xì)胞色素P450cDNA的保守序列的dsRNA，采用體外飼喂dsRNA方法，進(jìn)行了利用RNAi技術(shù)沉默麥長管蚜和桃蚜體內(nèi)細(xì)胞色素P450，導(dǎo)致麥長管蚜和桃蚜產(chǎn)生致死效應(yīng)，并且隨著dsRNA濃度增大和飼喂時間延長，麥長管蚜和桃蚜的死亡率均逐漸增大。對飼喂后存活蚜蟲體內(nèi)P450的實(shí)時熒光定量PCR研究表明，細(xì)胞色素P450的表達(dá)明顯受到抑制。表明蚜蟲細(xì)胞色素P450的保守序列可應(yīng)用于通過植物介導(dǎo)的RNAi技術(shù)提高小麥和蔬菜抗蚜性的研究。


圖I為細(xì)胞色素P450和GFP的PCR擴(kuò)增圖2為細(xì)胞色素P450和GFP的體外合成dsRNA圖3為飼喂8天后麥長管蚜和桃蚜的生長發(fā)育情況圖4為熒光定量PCR結(jié)果圖
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中麥長管蚜(錢幼亭，周廣和，張淑香，張向才.麥長管蚜有性世代的研究.植物保護(hù)，1982，01, 14-15.，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供，飼養(yǎng)蚜蟲的小麥品種為科農(nóng)199，將蚜蟲接種到小麥幼苗上，放入人工氣候箱中(溫度(20±2) °C，濕度60%-80%，光周期L D=16 8)進(jìn)行繁殖。下述實(shí)施例中桃蚜(蔣玉文.瓜蚜與桃蚜.新農(nóng)業(yè)，2001，11,40-41.，公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得)采自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所溫室種植的煙草上。質(zhì)粒提取試劑盒購自Biomega公司，內(nèi)切酶BamH I、EcoR V及Hiscribe T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒購自NEB公司，大腸桿菌菌株DH5 α、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金公司，rTaqDNA 聚合酶購自 TaKaRa 公司，MinElute PCR Cleaning Kit、MinElute Gel ExtractionKit、RNACleaningKit購自Qiagen公司，各種氨基酸及其它試劑均購自北京拜爾迪公司。實(shí)施例I、細(xì)胞色素P450dsRNA的獲得I、麥長管蚜總RNA的提取和cDNA的合成分別取約20頭麥長管蚜與桃蚜，按照北京全式金公司的Trizol試劑盒說明書提取總RNA,用RNACleaningKit進(jìn)行純化,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈,操作步驟均參考試劑盒說明書。2、引物設(shè)計與基因克隆根據(jù)豌豆蚜和棉蚜細(xì)胞色素P450的序列(GenBank登錄號分別為NM_001163211. 2和JQ246416. I),用DNAman5. O進(jìn)行比對,選擇保守序列，利用Primer Primer5. O軟件設(shè)計引物Pl (表1)，由北京華大基因公司合成。綠色熒光蛋白基因(GFP)片段從國家小麥改良中心實(shí)驗(yàn)室保存的GFP質(zhì)粒上擴(kuò)增,利用Primer Primer5. O軟件設(shè)計引物P4 (表I)。PCR 反應(yīng)體系為 10XPCR Buffer 5μ L.dNTP (2. 5mmol Γ1) 4μ L.rTaq O. 5 μ L,Forward primer (20 μ mol · L-1) I μ L> Reverse primer (20 μ mol · L-1) I μ L> cDNA/GFP M粒 I μ L，用 ddH20補(bǔ)足至 50 μ L。PCR 的反應(yīng)條件為 94。。4min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 30s,39 個循環(huán)；72°C IOmin ;4°C保存。
以麥長管蚜的cDNA為模板，用Pl作為引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到412bp PCR產(chǎn)物(含40bp的T7啟動子序列)，經(jīng)過測序，該412bp PCR產(chǎn)物具有序列表中的序列1(可人工合成)所示的核苷酸；序列表中的序列I所示的核苷酸編碼122個氨基酸。以桃蚜的cDNA為模板，用Pl作為引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到422bp PCR產(chǎn)物(含40bp的T7啟動子序列)，經(jīng)過測序，該422bp PCR產(chǎn)物具有序列表中的序列2 (可人工合成)所示的核苷酸；；序列表中的序列2所示的核苷酸編碼126個氨基酸。以GFP質(zhì)粒為模板，用P4作為引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到324bp PCR產(chǎn)物(含40bp的T7啟動子序列)，其具有序列表中的序列3 (可人工合成)所示的核苷酸。將上述PCR電泳結(jié)果如圖I所不，M Trans2K DNA marker ；1 :麥長管ife牙Sitobionavenae ；2 :桃姆Myzus persicae ；3 :GFP,可以看出得到目的片段。將上述412bp PCR產(chǎn)物(麥長管蚜)編碼的氨基酸序列和422bp PCR產(chǎn)物(桃蚜)編碼的氨基酸序列提交到ExPASy數(shù)據(jù)庫(http://www. uniprot. org/uniprot/)進(jìn)行BLAST 比對分析，ExPASy數(shù)據(jù)庫BLAST得到250條序列信息，均為細(xì)胞色素P450的部分氨基酸序列，且核苷酸同源性為90. 1% ;因此認(rèn)為序列表中序列I所示的核苷酸編碼的氨基酸和序列表中序列2所示的核苷酸編碼的氨基酸為細(xì)胞色素P450中的保守序列。表I為細(xì)胞色素P450與GFP的PCR擴(kuò)增引物
權(quán)利要求
1.一種dsRNA，為如下I)或2): O由序列表中序列4所示的核苷酸和其反向互補(bǔ)序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA ； 2)由序列表中序列5所示的核苷酸和其反向互補(bǔ)序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA。
2.權(quán)利要求I所述dsRNA的編碼基因；所述編碼基因具體為如下I)或2):1)為序列表中序列I所示的核苷酸；2)為序列表中序列2所示的核苷酸。
3.權(quán)利要求I所述dsRNA或權(quán)利要求2所述的編碼基因在防治蚜蟲和/或制備防治蚜蟲產(chǎn)品中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述防治蚜蟲體現(xiàn)在促進(jìn)蚜蟲死亡和/ 或抑制蚜蟲生長。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為將權(quán)利要求I所述dsRNA導(dǎo)入蚜蟲，實(shí)現(xiàn)促進(jìn)蚜蟲死亡和/或抑制蚜蟲生長；所述導(dǎo)入具體為飼喂； 所述蚜蟲具體為麥長管蚜或桃蚜； 所述促進(jìn)蚜蟲死亡和/或抑制蚜蟲生長具體通過抑制蚜蟲體內(nèi)細(xì)胞色素P450的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。
6.權(quán)利要求I所述dsRNA或權(quán)利要求2所述的編碼基因在促進(jìn)蚜蟲死亡和/或抑制蚜蟲生長中的應(yīng)用；所述蚜蟲具體為麥長管蚜或桃蚜。
7.權(quán)利要求I所述dsRNA或權(quán)利要求2所述的編碼基因在抑制蚜蟲體內(nèi)細(xì)胞色素P450的表達(dá)中的應(yīng)用；所述蚜蟲具體為麥長管蚜或桃蚜。
8.含有權(quán)利要求I所述dsRNA或權(quán)利要求2所述的編碼基因的重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒。
9.權(quán)利要求8重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒在如下I)-5)中至少一種中的應(yīng)用1)防治蚜蟲；2)制備防治蚜蟲產(chǎn)品；3)促進(jìn)蚜蟲死亡；4)抑制蚜蟲生長；5)抑制蚜蟲體內(nèi)細(xì)胞色素P450的表達(dá)； 所述蚜蟲具體為麥長管蚜或桃蚜。
10.一種防治蚜蟲的產(chǎn)品，其活性成分為如下A-C A、權(quán)利要求I所述dsRNA； B、權(quán)利要求2所述的編碼基因； C、權(quán)利要求8重組表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、重組菌或表達(dá)盒。
或一種抑制蚜蟲體內(nèi)細(xì)胞色素P450表達(dá)的物質(zhì)為所述A-C ； 或所述抑制蚜蟲體內(nèi)細(xì)胞色素P450表達(dá)的物質(zhì)在如下I)-5)中至少一種中的應(yīng)用O防治蚜蟲；2)制備防治蚜蟲產(chǎn)品；3)促進(jìn)蚜蟲死亡；4)抑制蚜蟲生長；5)抑制蚜蟲體內(nèi)細(xì)胞色素P450的表達(dá)； 所述蚜蟲具體為麥長管蚜或桃蚜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種dsRNA及其在抑制蚜蟲生長中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的dsRNA，為如下1)或2)1)由序列表中序列4所示的核苷酸和其反向互補(bǔ)序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA；2)由序列表中序列5所示的核苷酸和其反向互補(bǔ)序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA。本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明得到麥長管蚜和桃蚜的細(xì)胞色素P450cDNA的保守序列的dsRNA，采用體外飼喂dsRNA方法，進(jìn)行了利用RNAi技術(shù)沉默麥長管蚜和桃蚜體內(nèi)細(xì)胞色素P450，導(dǎo)致麥長管蚜和桃蚜生長發(fā)育受阻并產(chǎn)生致死效應(yīng)。
文檔編號C12N15/63GK102776189SQ20121020560
公開日2012年11月14日 申請日期2012年6月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月18日
發(fā)明者夏蘭琴, 張岷, 王暉 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所