芍藥3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶(PLHMGR)基因及其編碼產(chǎn)物和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種芍藥3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶(PLHMGR)基因及其編碼蛋白與用途，該基因為首次利用構(gòu)建cDNA文庫從芍藥中克隆而得，填補了從我國傳統(tǒng)中藥材芍藥中分離克隆出3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶基因的空白。本發(fā)明所提供的芍藥3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶(PLHMGR)基因具有SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所述基因編碼的蛋白質(zhì)具有SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸的同源序列。本發(fā)明提供的芍藥3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶(PLHMGR)基因可以通過生物技術(shù)提高芍藥中3-羥基-3-甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)代謝產(chǎn)物的含量，在藥材芍藥的品質(zhì)改良、活性成分合成生物學等方面，具有很好的應用前景。
【專利說明】芍藥3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶(PLHMGR)基因及
其編碼產(chǎn)物和應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，主要涉及利用芍藥cDNA文庫克隆3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶基因及其編碼產(chǎn)物與應用，尤其涉及生物合成有藥理活性成分的有機酸、萜類酶基因及其編碼產(chǎn)物與應用，屬于藥用植物基因工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】 [0002]藥用植物活性成分的形成是植物次生代謝途徑中特有基因群的產(chǎn)物。隨著植物功能基因組研究的廣泛與深入，獨具特色又有廣闊應用前景的藥用植物次生代謝合成相關(guān)功能基因的研究逐漸成為研究的熱點，這些基因的克隆將為解析藥用植物有效成分的生物合成途徑及其調(diào)控機制和解釋藥材品質(zhì)的形成提供理論基礎(chǔ)，同時為利用生物技術(shù)提高目標成分含量或直接生產(chǎn)有效成分或中間體帶來廣闊的應用空間。藥用植物的化學成分復雜，種類繁多，其中主要含有有機酸類、黃酮類、揮發(fā)油、萜類、二萜類、微量元素等多種成分，芍藥Paeonialactiflora不僅是名花,還是一味常用中藥，其根可供藥用。其中白茍具有鎮(zhèn)痙、鎮(zhèn)痛、通經(jīng)等作用。芍藥根中含有芍藥苷、安息香酸等活性成分，其中芍藥苷屬于單萜類化合物，具有顯著的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗驚厥、解痙、解熱、抗炎、抗?jié)?、抗過敏、降血糖、調(diào)節(jié)免疫、保護肝臟等作用(楊俊，方紅編。芍藥[M]。北京:中國中醫(yī)藥出版社，2001，113)。
[0003]3-羥基 _3_ 甲基戍二酸 CoA 還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoAreducase,HMGR)可催化3_羥基_3_甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)生成甲羥戊酸(MVA)，由于該過程不可逆，故HMGR被視作MVA途徑的第一個限速酶，是萜類化合物代謝中的重要調(diào)控點，其表達量可能與芍藥苷等萜類成分的含量密切相關(guān)。而甲羥戊酸經(jīng)過甲羥戊酸激酶(MK)、磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)等酶的作用生成異戊烯基焦磷酸(IPP)，再進一步合成各種不同的萜類化合物(張長波，孫紅霞，鞏中軍，祝增榮。植物萜類化合物的天然合成途徑及其相關(guān)合酶[J]。植物生理學通訊，2007，43 (4) =779-786) 0芍藥3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶(PLHMGR)基因的克隆，為利用基因工程提高芍藥活性成分含量提供重要基礎(chǔ)，在藥材芍藥的品質(zhì)改良、活性成分合成生物學等方面，具有很好的應用前景。在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開或報道過本專利申請中所提及的芍藥中3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶基因及其氨基酸序列。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種芍藥3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶(PLHMGR)基因。
[0005]本發(fā)明第二個目的是提供該基因編碼的蛋白質(zhì)。
[0006]本發(fā)明還提供了含有該基因的重組載體和宿主細胞。
[0007]本發(fā)明的另一個目的在于提供該基因的應用。
[0008]本發(fā)明所提供的芍藥3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶(PLHMGR)基因，為以下核苷酸序列之一:
[0009](I)具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；
[0010](2) SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
[0011]該基因所編碼的蛋白質(zhì)為芍藥3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶(PLHMGR)基因，是以下氨基酸序列之一:
[0012](I)具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列；
[0013](2) SEQ ID N0.2添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸的同源序列。
[0014]本發(fā)明所提供的3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶(PLHMGR)基因是首次從芍藥中克隆制備的，體外實驗表明，PLHMGR具有催化3-羥基-3-甲基戊二酰CoA(HMG-CoA)生成甲羥戊酸(MVA)的活性。利用本發(fā)明可以通過基因工程技術(shù)來提高芍藥等植物中萜類物
質(zhì)含量。 【專利附圖】

【附圖說明】:
[0015]圖1:PLHMGR功能域預測分析(來源于NCBI數(shù)據(jù)庫)；
[0016]圖2 =PLHMGR系統(tǒng)進化樹(鄰接法)；
[0017]圖3:表達載體pYES2-PLHMGR構(gòu)建；
【具體實施方式】
[0018]實施例1、芍藥cDNA文庫的構(gòu)建
[0019]1、芍藥總RNA的分離和檢測
[0020]取茍藥(Paeonia Iactiflora)的根2g,在研缽中用液氮快速研磨成粉末,快速轉(zhuǎn)移至 65°C預熱的 IOmL 提取緩沖液中(CTAB (ff/V)2%, Tris-HCl (pH8.0) IOOmmol.1，EDTA25mmol.?Λ NaCl 2.0mol.?Λ PVP402%，亞精胺 0.5g/L，巰基乙醇 2% )，充分振蕩混勻；用等體積氯仿抽提兩次，7500g離心15分鐘。上清液加入1/4體積的IOM LiCl，混勻后放置 4°C沉淀過夜；7500g 離心 20 分鐘，沉淀用 500yL SSTE (SDS 0.5%, NaCl Imol.?ΛTris-HCl (ρΗ8.0) IOmmol.?Λ EDTA lmmol.?Λ 在 65°C溶解 5 分鐘。用等體積氯仿抽提，13000g離心5分鐘；上清液加入2倍體積無水乙醇，_70°C放置2小時；4°C 13000g離心20分鐘，沉淀室溫干燥10分鐘后溶于IOOy L DEPC處理的水中，用1.0%瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性，用GenQuant核酸定量儀測定Α260、Α280比值和濃度。置于_80°C冰箱備用。
[0021]2、cDNA文庫的構(gòu)建
[0022]米用mRNA 純化試劑盒(QuichprepTM Micro mRNA Purification Kit,Pharmacia公司)分離 mRNA 后，米用 Clontech 公司的 Creator Smart cDNA Library ConstructionKit (Cat.N0.634903)進行建庫，原理為 SMART (switch mechanism at 5 ' end of mRNAtemplate)。
[0023]實施例2:芍藥相關(guān)基因的克隆
[0024]隨機挑取5000個單克隆進行菌落PCR鑒定。取適量PCR薄壁管，置于冰上，每管先加入17.3ul的滅菌水。用滅過菌的IOul小槍頭挑取單克隆白斑至滅菌水中，振蕩混勻。依次加入:Taq buffer 2.5 μ L，MgCl2 (25mM) 1.8 μ L，dNTP (2.5mM) I μ L，M13+引物(IOpmol) I μ L，Μ13-引物(IOpmol) I μ L，Taq SI 0.4 μ L0 PCR 反應條件為 94°C預變性 5 分鐘后，94°C 40秒，54°C 40秒，72°C 4分鐘，35個循環(huán)后72°C延伸10分鐘，4°C保存。待PCR反應進入4°C后，取下PCR薄壁管，取7ul PCR產(chǎn)物加入3ul溴芬蘭進行瓊脂糖凝膠電泳，半小時后照相，觀察膠圖，根據(jù)膠圖粗略鑒定插入片段的大小及小片段率。選擇條帶單一擴增產(chǎn)物送至華大基因公司進行測序，獲得芍藥相關(guān)基因序列。[0025]實施例3、PLHMGR基因的生物信息學分析
[0026]本發(fā)明涉及的芍藥3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶基因全長cDNA的長度為1398bp，詳細序列見序列表中的序列1，其中開放讀碼框位于l_1398bp。將芍藥全長cDNA 序列用 BLAST 程序在 Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB 和 Non-redundantGenBank CDStransIation+PDB+Swissprot+Superdate+PIR 數(shù)據(jù)庫中進行核苷酸同源性檢索。該基因在氨基酸水平上與其它物種中的HMGR有較高的同源性，同時具有典型的hydroxymethylglutary1-CoA synthase 結(jié)構(gòu)域。如圖1。
[0027]實施例4、PLHMGR基因功能的研究
[0028]1.表達載體的構(gòu)建
[0029]以PLHMGR cDNA 為模板，利用引物 Pl:5' -AAGCTTATGGCCAAGAATGTAGGAATTCTCG-
3' , P2:5/ -TCTAGATCAATGACCATTAGCAACCAAACCA-3 '進行 PCR 反應，反應體系同實驗例
2。取5ul擴增產(chǎn)物加入3ul溴芬蘭進行瓊脂糖凝膠電泳，半小時后照相，觀察膠圖，擴增片段為1410bp。用Hind III和Xba I在37°C下雙酶切擴增產(chǎn)物2小時，利用回收試劑盒(Takara公司，中國)純化酶切產(chǎn)物。同時利用Hind III和Xba I在37°C下酶切pMD19_T載體2小時，加入5ul溴芬蘭進行瓊脂糖凝膠電泳，觀察膠圖，并利用回收試劑盒回收片段。
[0030]回收片段經(jīng)T4連接酶在8°C連接過夜。電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，在含有氨芐青霉素的LB平板上篩選重組子。含PLHMGR克隆的pMD19質(zhì)粒經(jīng)PCR和限制性內(nèi)切酶酶切電泳鑒定和DNA序列分析，保存具有正確目標序列的重組質(zhì)粒pMD-PLHMGR。
[0031]Hind III 和 Xba I 雙酶切攜帶 PLHMGR 的 pMD_19T Vector 質(zhì)粒和 pYES2 質(zhì)粒，分別回收目標片段HMGR和開環(huán)的pYES2，于16°C連接回收片段，獲得重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR和限制性內(nèi)切酶酶切電泳鑒定和DNA序列分析，證明含有正確序列的PLHMGR，該表達載體命名為pYES2-PLHMGR(圖 3)。
[0032]2.工程酵母構(gòu)建
[0033]pYES2-PLHMGR 連接轉(zhuǎn)化 DH5 α，在 LB 平板(100mg/L Ampicillin)篩得攜帶PYES2-PLHMGR的單斑，然后在LB液體培養(yǎng)基(25mg/L Ampicillin)中培養(yǎng)，經(jīng)質(zhì)粒提取，PCR檢測以及酶切驗證之后，采用醋酸鋰法將pYES2-PLHMGR轉(zhuǎn)化酵母JRY2394 ;同時用PYES2空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化JRY2394作為對照。
[0034]3.PLHMGR基因功能分析
[0035]由于 JRY2394 (MATa, ade2, his3, met-, ura3, hmgl, hmg2)是一個缺乏 HMGR 活性、生長需要甲羥戊酸的酵母突變菌株，可以通過轉(zhuǎn)入外源HMGR基因，使其在JRY2394中表達，通過遺傳功能互補，從而恢復酵母自身失去的HMGR功能來驗證外源HMGR基因的功能。
[0036]將JRY2394，JRY2394+pYES2, JRY2394+pYES2_PLHMGR 分別在含有 YM (0.67% 氨基酸缺失的酵母氮源，30mg/L腺嘌呤,組氨酸和甲硫氨酸)+2% galactose (半乳糖)+5mg/LMVA(甲輕戍酸)+30mg/L uracil (尿嘧唳)即 YM galatose+MVA+Uracil, ΥΜ(0.67%氨基酸缺失的酵母氮源，30mg/L腺嘌呤,組氨酸和甲硫氨酸)+2% galactose (半乳糖)+5mg/LMVA(甲輕戍酸)即YMgalatose+MVA-Uracil,和ΥΜ(0.67%氛基酸缺失的酵母氣源,30mg/L腺嘌呤，組氨酸和甲硫氨酸)十2% galactose (半乳糖)即YM galatose-MVA-Urac平板上劃線培養(yǎng)，并于30°C培養(yǎng)3天后觀察菌落形態(tài) 。
[0037]結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化的含有pYES2-PLHMGR的JRY2394能在選擇培養(yǎng)基(YMgalaetose-MVA-uracil)上生長，但是JRY2394和含有pYES2的JRY2394卻由于不能合成生長所必需的甲羥戊酸而無法在選擇培養(yǎng)基上生長。含有pYES2-PLHMGR和pYES2的JRY2394能在另一選擇培養(yǎng)基(YM galactose, +MVA and-uracil)上生長,而JRY2394卻始終不能生長。三種工程菌都能在非選擇培養(yǎng)基(YM galactose, +MvAand+uracil)上生長。以上實驗結(jié)果證明，PLHMGR具有HMGR基因功能，可以參與酵母甲羥戊酸的生物合成。
[0038]5.突變HMGR活性測定
[0039]以PLHMGR cDNA 為模板，利用突變引物 P3:5' -AAGCTTATGGCTAAGAATGTAGGAATTCTCG-3/ ,P4:5/ -TCTAGATCAATGACCATTAGCAACCAAACCA-3'進行 PCR 反應，表達載體的構(gòu)建、工程酵母的構(gòu)建及PLHMGR基因功能分析方法同上，結(jié)果表明突變PLHMGR轉(zhuǎn)基因工程酵母與正常PLHMGR酵母沒有顯著差異。
【權(quán)利要求】
1.一種芍藥3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶(PLHMGR)基因，其特征在于，它是下列核苷酸序列之一:
(1)SEQID N0.1 的 DNA 序列； (2)SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一個或多個核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
2.—種芍藥3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶(PLHMGR)，其特征在于，是以下氨基酸序列之一:
(1)具有SEQID N0.2所不的氣基酸序列； (2)SEQ ID N0.2添加、取代、插入或缺失一個或多個氨基酸的同源序列。
3.重組載體，其特征在于:含有權(quán)利要求1所述的芍藥3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶(PLHMGR)基因全序列或部分序列。
【文檔編號】C12N15/53GK103571855SQ201210262201
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年7月27日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月27日
【發(fā)明者】黃璐琦, 袁媛, 汪周勇 申請人:中國中醫(yī)科學院中藥研究所