芍藥2-甲基-D-赤蘚醇-2,4-環(huán)二磷酸合酶(PLIspF)基因及其編碼產(chǎn)物和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種2-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環(huán)二磷酸合酶(PLIspF)基因及其編碼蛋白與用途，該基因?yàn)槭状卫脴?gòu)建cDNA文庫從芍藥中克隆而得，填補(bǔ)了從我國傳統(tǒng)中藥材芍藥中分離克隆出2-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環(huán)二磷酸合酶基因的空白。本發(fā)明所提供的2-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環(huán)二磷酸合酶(PLIspF)基因具有SEQ?IDNO.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所述基因編碼的蛋白質(zhì)具有SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸的同源序列。本發(fā)明提供的2-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環(huán)二磷酸合酶(PLIspF)基因可以通過生物技術(shù)提高芍藥中4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚醇-2-磷酸代謝產(chǎn)物的含量，在藥材芍藥的品質(zhì)改良、活性成分合成生物學(xué)等方面，具有很好的應(yīng)用前景。
【專利說明】芍藥2-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環(huán)二磷酸合酶(PLIspF)基因及其編碼產(chǎn)物和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，主要涉及利用芍藥cDNA文庫克隆2-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環(huán)二磷酸合酶基因及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用，尤其涉及生物合成有藥理活性成分的有機(jī)酸、萜類酶基因及其編碼產(chǎn)物與應(yīng)用，屬于藥用植物基因工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]藥用植物活性成分的形成是植物次生代謝途徑中特有基因群的產(chǎn)物。隨著植物功能基因組研究的廣泛與深入，獨(dú)具特色又有廣闊應(yīng)用前景的藥用植物次生代謝合成相關(guān)功能基因的研究逐漸成為研究的熱點(diǎn)，這些基因的克隆將為解析藥用植物有效成分的生物合成途徑及其調(diào)控機(jī)制和解釋藥材品質(zhì)的形成提供理論基礎(chǔ)，同時(shí)為利用生物技術(shù)提高目標(biāo)成分含量或直接生產(chǎn)有效成分或中間體帶來廣闊的應(yīng)用空間。藥用植物的化學(xué)成分復(fù)雜，種類繁多，其中主要含有有機(jī)酸類、黃酮類、揮發(fā)油、萜類、二萜類、微量元素等多種成分，芍藥Paeonia lactif 1ra不僅是名花,還是一味常用中藥,其根可供藥用。其中白茍具有鎮(zhèn)痙、鎮(zhèn)痛、通經(jīng)等作用。芍藥根中含有芍藥苷、安息香酸等活性成分，其中芍藥苷屬于單萜類化合物，具有顯著的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗驚厥、，解痙、解熱、抗炎、抗?jié)儭⒖惯^敏、降血糖、調(diào)節(jié)免疫、保護(hù)肝臟等作用(楊俊，方紅編。芍藥[M]。北京:中國中醫(yī)藥出版社，2001，113)。
[0003]2_ 甲基-D-赤蘚醇-2,4-環(huán)二憐酸合酶(2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase, IspF)是位于質(zhì)體中的職類化合物的脫氧木酮糖_5_磷酸途徑(DXP)中的關(guān)鍵酶基因，其表達(dá)量可能與芍藥苷等萜類成分的含量密切相關(guān)。IspF能催化4-二憐酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚醇-2-憐酸(2-Phospho_4-(cytidine 5' -diphospho)-2-C-methyl-D-e·rythritol, CDP-ME2P)生成 2_C_ 甲基-D-赤蘚醇 2,4 環(huán)二憐酸(2-C-Methyl-D-erythri to 12,4-cyclodiphosphate, ME_2,4CPP)和 CMP,再經(jīng)過 1-輕基-2-甲基-2-(E)_ 丁烯基4-二磷酸合酶(HDS)、異戊烯基單磷酸激酶(IPK)的作用生成異戊烯基焦磷酸(IPP)或二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)，再進(jìn)一步合成各種不同的萜類化合物(張長波，孫紅霞，鞏中軍，祝增榮。植物萜類化合物的天然合成途徑及其相關(guān)合酶[J]。植物生理學(xué)通訊，2007，43 (4):779-786)。芍藥2-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環(huán)二磷酸合酶(PLIspF)基因的克隆，為利用基因工程提高芍藥活性成分含量提供重要基礎(chǔ)，在藥材芍藥的品質(zhì)改良、活性成分合成生物學(xué)等方面，具有很好的應(yīng)用前景。在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開或報(bào)道過本專利申請中所提及的芍藥2-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環(huán)二磷酸合酶基因及其氨基酸序列。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于提供一種芍藥2-甲基-D-赤蘚醇-2，4_環(huán)二磷酸合酶(PLIspF)基因。
[0005]本發(fā)明第二個(gè)目的是提供該基因編碼的蛋白質(zhì)。[0006]本發(fā)明還提供了含有該基因的重組載體和宿主細(xì)胞。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供該基因的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明所提供的芍藥2-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環(huán)二磷酸合酶(PLIspF)基因，為以下核苷酸序列之一:
[0009](I)具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；
[0010](2) SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
[0011]該基因所編碼的蛋白質(zhì)為芍藥2-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環(huán)二磷酸合酶(PLIspF)基因，是以下氣基酸序列之一:
[0012](I)具有SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列；
[0013](2) SEQ ID N0.2添加、取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸的同源序列。
[0014]本發(fā)明所提供的2-甲基-D-赤蘚醇-2，4_環(huán)二磷酸合酶(PLIspF)基因是首次從芍藥中克隆制備的，體外實(shí)驗(yàn)表明，I spF能催化4- 二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚醇-2-憐酸(2-Phospho_4-(cytidine 5 1 -diphospho) -2-C-methyl-D-erythritol,CDP-ME2P)生成 2-C-甲基-D-赤蘚醇 2，4 環(huán)二磷酸(2-C-Methyl-D-erythritol 2，4-cyclodiphosphate,ME-2,4CPP)和CMP的活性。利用本發(fā)明可以通過基因工程技術(shù)來提高芍藥等植物中萜類物質(zhì)含量。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0015]圖1:PLIspF功能 域預(yù)測分析(來源于NCBI數(shù)據(jù)庫)；
[0016]圖2 =PLIspF系統(tǒng)進(jìn)化樹(鄰接法)；
[0017]圖3:表達(dá)載體pTrc-PLIspF構(gòu)建；
【具體實(shí)施方式】
[0018]實(shí)施例1、芍藥cDNA文庫的構(gòu)建
[0019]1、芍藥總RNA的分離和檢測
[0020]取茍藥(Paeonia Iactiflora)的根2g,在研缽中用液氮快速研磨成粉末,快速轉(zhuǎn)移至 65°C預(yù)熱的 IOmL 提取緩沖液中(CTAB (ff/V)2%, Tris-HCl (pH8.0) IOOmmol ? L' EDTA25mmol ? L' NaCl 2.0mol ? I71，PVP402%，亞精胺 0.5g/L，巰基乙醇 2% )，充分振蕩混勻；用等體積氯仿抽提兩次，7500g離心15分鐘。上清液加入1/4體積的IOM LiCl，混勻后放置 4°C沉淀過夜；7500g 離心 20 分鐘，沉淀用 500iiL SSTE (SDS 0.5%, NaCl Imol ? I71，Tris-HCl (pH8.0) IOmmol ? L' EDTA lmmol ? I71，在 65°C溶解 5 分鐘。用等體積氯仿抽提，13000g離心5分鐘；上清液加入2倍體積無水乙醇，_70°C放置2小時(shí)；4°C 13000g離心20分鐘，沉淀室溫干燥10分鐘后溶于IOOiI L DEPC處理的水中，用1.0%瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性，用GenQuant核酸定量儀測定A260、A280比值和濃度。置于_80°C冰箱備用。
[0021]2、cDNA文庫的構(gòu)建
[0022]米用mRNA 純化試劑盒(QuichprepTM Micro mRNA Purification Kit,Pharmacia公司)分離 mRNA 后，米用 Clontech 公司的 Creator Smart cDNA Library ConstructionKit (Ca.N0.634903)進(jìn)行建庫，原理為 SMART (switch mechanism at 5 ' end of mRNAtemplate)。
[0023]實(shí)施例2:芍藥相關(guān)基因的克隆
[0024]隨機(jī)挑取5000個(gè)單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定。取適量PCR薄壁管，置于冰上，每管先加入17.3ul的滅菌水。用滅過菌的IOul小槍頭挑取單克隆白斑至滅菌水中，振蕩混勻。依次加入:Taq buffer 2.5 y L，MgCl2 (25mM) 1.8 y L，dNTP (2.5mM) I y L，M13+引物(IOpmol) I u L，M13-引物(IOpmol) I u L，Taq SI 0.4 u L0 PCR 反應(yīng)條件為 94°C預(yù)變性 5 分鐘后，94°C 40秒，54°C 40秒，72°C 4分鐘，35個(gè)循環(huán)后72°C延伸10分鐘，4°C保存。待PCR反應(yīng)進(jìn)入4°C后，取下PCR薄壁管，取7ul PCR產(chǎn)物加入3ul溴芬蘭進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，半小時(shí)后照相，觀察膠圖，根據(jù)膠圖粗略鑒定插入片段的大小及小片段率。選擇條帶單一擴(kuò)增產(chǎn)物送至華大基因公司進(jìn)行測序，獲得芍藥相關(guān)基因序列。
[0025]實(shí)施例3、PLIspF基因的生物信息學(xué)分析
[0026]本發(fā)明涉及的芍藥2-甲基-D-赤蘚醇_2，4-環(huán)二磷酸合酶基因全長cDNA的長度為696bp，詳細(xì)序列見序列表中的序列I,其中開放讀碼框位于l_696bp。將芍藥全長cDNA序列用 BLAST 程序在 Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB 和 Non-redundant GenBankQ)S translation+PDB+Swissprot+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行核苷酸同源性檢索。該基因在氨基酸水平上與其它物種中的IspF有較高的同源性，同時(shí)具有典型的MEraP_synthase (2-C-methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphate synthase, IspF)結(jié)構(gòu)域。如圖1。
[0027]實(shí)施例4、PLIspF基因功能的研究
[0028]1.表達(dá)載體的構(gòu)建
[0029]以PLIspFcDNA為模板，利用引物Pl:5' -GGATCCATGGCCACGGCGACTCCGCTATA-3'
，P2:5' -TCTAGACTACTTCTTCATAAGA`AGAACCACA-3'進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，反應(yīng)體系同實(shí)驗(yàn)例 2。取5ul擴(kuò)增產(chǎn)物加入3ul溴芬蘭進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，半小時(shí)后照相，觀察膠圖，擴(kuò)增片段為708bp。用Bamh I和Xba I在37°C下雙酶切擴(kuò)增產(chǎn)物2小時(shí)，利用回收試劑盒(Takara公司，中國)純化酶切產(chǎn)物。同時(shí)利用BamH I和Xba I在37°C下酶切pMD19_T載體2小時(shí)，加入5ul溴芬蘭進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，觀察膠圖，并利用回收試劑盒回收片段。
[0030]回收片段經(jīng)T4連接酶在8°C連接過夜。電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，在含有氨芐青霉素的LB平板上篩選重組子。含PLIspF克隆的pMD19質(zhì)粒經(jīng)PCR和限制性內(nèi)切酶酶切鑒定和DNA序列分析，保存具有正確目標(biāo)序列的重組質(zhì)粒pMD-PLIspF。
[0031]BamH I 和 Xba I 雙酶切攜帶 PLIspF 的 pMD_19T Vector 質(zhì)粒和 pTrc-AtlPI 質(zhì)粒，分別回收目標(biāo)片段708bp和3700bp，于16 °C連接回收片段，獲得重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR和限制性內(nèi)切酶酶切鑒定和DNA序列分析，證明含有正確序列的PLIspF，該表達(dá)載體命名為pTrc-PLIspF(圖 3)。
[0032]2.工程菌構(gòu)建
[0033]將pTrc-PLIspF轉(zhuǎn)化攜帶pAC_BETA質(zhì)粒的大腸桿菌XLl-Blue，并在含有Amp (150 u g/ml)和Cm(50 u g/ml)的LB培養(yǎng)基上篩選陽性克隆。
[0034]3.PLIspF基因功能分析
[0035]由于在大腸桿菌中存在MEP途徑，菌株XLl-Blue中含有質(zhì)粒pAC_BETA可以制造和積累(6-胡蘿卜素，并形成黃色菌落。當(dāng)PTrc-PLIspF被轉(zhuǎn)化到這種能夠積累(6-胡蘿
卜素的大腸桿菌XLl-Blue中后，細(xì)菌的顏色變成黃色或橙黃色，表明PLIspF能加速(6-胡蘿卜素的積累。
[0036]本發(fā)明挑取分別含有XLl-Blue+pTrc-PLIspF、XLl-Blue+pTrc-PLIspF+pAC-BETA的大腸桿菌單克隆，在含有Amp (150 ii g/ml)和Cm(50 y g/ml)的LB培養(yǎng)基上，于28°C倒置暗培養(yǎng)，2~3天后觀察菌落顏色變化情況。以含有XLl-Blue、XLl-Blue-+pAC-BETA、XLl-BIue+pTrc+pAC-BETA大腸桿菌單克隆為對(duì)照。
[0037]實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2-3天培養(yǎng)后，與對(duì)照菌株相比，含有PLIspF的大腸桿菌克隆顏色變成了黃色，從而證明了在PLIspF可以加速(6-胡蘿卜素的積累。
[0038]4.突變IspF驗(yàn)證
[0039]以PLIspFcDNA為模板，利用突變引物P3:5' -GGATCCATGGCCACGGCAACTCCGCTATA-3'，P45' -TCTAGACTACTTCTTCATAAGAAGAACCACA-3'進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，表達(dá)載體的構(gòu)建及功能驗(yàn)證方法同上，結(jié)果表明突·變PLIspF轉(zhuǎn)基因工程菌株與正常PLIspF沒有顯著差異。
【權(quán)利要求】
1.一種2-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環(huán)二磷酸合酶(PLIspF)基因，其特征在于，它是下列核苷酸序列之一:
(1)SEQID N0.1 的 DNA 序列； (2)SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列添加、取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸的同源序列或者其等位基因及其衍生的核苷酸序列。
2.—種2-甲基-D-赤蘚醇-2，4-環(huán)二磷酸合酶(PLIspF)，其特征在于，是以下氨基酸序列之一: (1)具有SEQID N0.2所不的氣基酸序列； (2)SEQ ID N0.2添加、取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸的同源序列。
3.重組載體，其特征在于:含有權(quán)利要求1所述的2-甲基-D-赤蘚醇-2，4-壞二磷酸合酶(PLIspF)基因全序列或部分序列。
【文檔編號(hào)】C12N9/12GK103571860SQ201210262095
【公開日】2014年2月12日 申請日期:2012年7月27日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月27日
【發(fā)明者】黃璐琦, 袁媛, 汪周勇 申請人:中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所