專利名稱：組織型纖溶酶原激活劑的組合突變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥領(lǐng)域中的重組蛋白質(zhì)藥物。
組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)是目前應(yīng)用廣泛的溶栓藥物。但天然型t-PA存在著半衰期短，有出血副作用，使用劑量高，成本價格高，臨床使用條件苛刻等缺陷，因此科學(xué)界一直對其進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改造。為提高t-PA的溶栓活性，并克服上述缺陷，我們從改造天然型t-PA的分子結(jié)構(gòu)入手，通過蛋白質(zhì)工程改造，得到了t-PA的重組衍生物-組合突變體(簡稱rPA)。
根據(jù)t-PA的結(jié)構(gòu)分析和分子設(shè)計，我們在將t-PA分子中的EGF區(qū)、Finger區(qū)和Kringle I區(qū)刪除的基礎(chǔ)上，保留了具有溶栓作用的Kringle II和蛋白酶二個功能區(qū)(176-527氨基酸)，同時將t-PA分子中的PAI-1結(jié)合位點的氨基酸進(jìn)行定點突變，構(gòu)建了能夠顯著延長t-PA半衰期、提高特異活性，且其活性不被PAI-1抑制的，諸多優(yōu)勢特征組合的新型t-PA突變體。該新型t-PA溶栓劑，其多種特性均有顯著改善。經(jīng)檢索我們的這種t-PA突變體氨基酸序列是首創(chuàng)性工作，國際上沒有類似的突變體發(fā)表。
技術(shù)方案首先擴增出天然t-PA的176-527位氨基酸的cDNA。將該cDNA中的PAI-1結(jié)合位點核苷酸序列376-384的CAC AGG AGG改變?yōu)镚CCGCG GCG，使相應(yīng)的氨基酸HRR突變?yōu)锳AA，構(gòu)建了新的t-PA突變體，并克隆于大腸桿菌表達(dá)載體pET22b。在大腸桿菌中得到高效表達(dá)。表達(dá)蛋白占總菌體蛋白的40％，以包涵體形式存在。經(jīng)蛋白質(zhì)變性、復(fù)性，得到了有天然活性的t-PA突變體。為了獲得更高的t-PA突變體的表達(dá)，保證其生物活性，我們將新的t-PA突變體，克隆于畢赤酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9k，用畢赤酵母進(jìn)行表達(dá)，在培養(yǎng)上清中經(jīng)分離純化，得到高活性的t-PA突變體。對用大腸桿菌和畢赤酵母表達(dá)的新的t-PA突變體進(jìn)行性質(zhì)研究表明，新的t-PA突變體在具有天然t-PA的優(yōu)點，如血栓特異性的同時，在藥理藥代上優(yōu)于t-PA。突變體的半衰期為18至25分鐘，而t-PA只有3.5分鐘。新的t-PA突變體還表現(xiàn)出顯著增強的血纖蛋白刺激性，并實質(zhì)性地增加酶原性；與PAI-1反應(yīng)后t-PA活性無抑制。說明我們的分子改構(gòu)提高了纖溶酶原水解活性，大幅度增加了血纖蛋白輔因子的差別，核苷酸序列376-384相對應(yīng)的氨基酸序列影響PAI-1結(jié)合活性，而不影響其纖溶酶原水解活性，這樣的氨基酸突變顯著提高了對PAI-1抑制的耐受性。上述突變特征的組合增加了該t-PA突變體的臨床治療應(yīng)用的優(yōu)勢。該工作使其成為治療活性好、用量少、臨床使用方便的治療心肌梗塞和腦血栓、肺栓塞等血栓性疾病的新型生物工程藥物。
當(dāng)然，亦可依不同方法來制備rPA，如可在細(xì)菌或昆蟲細(xì)胞及動物細(xì)胞等較高等真核細(xì)胞中表達(dá)，但最好是在酵母系統(tǒng)中表達(dá)。由于rPA分子包含9對二硫鍵，若用大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)必需經(jīng)過變性和復(fù)性步驟，復(fù)性率很低，純化困難，其產(chǎn)量和應(yīng)用受到限制。為了提高rPA的表達(dá)產(chǎn)率，我們用甲醇營養(yǎng)型的畢赤酵母來分泌表達(dá)rPA。由酵母細(xì)胞中表達(dá)的優(yōu)點不僅因為可以分泌rPA，而且還因為它在實際上是呈準(zhǔn)確折迭形式的并具有高度活性的。
優(yōu)選采用的酵母載體是所謂的穿梭載體，其具有的細(xì)菌質(zhì)粒和酵母質(zhì)粒的復(fù)制原點，以及在兩種宿主系統(tǒng)中分泌的基因。此外，該類型載體還含有表達(dá)外來基因所必需的啟動子順序，以及最好有可改善產(chǎn)率的終止順序，從而即可使利于同分泌信號融合的異源基因定位于啟動子和終止密碼子之間。
具體工藝簡述如下rPA表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建→轉(zhuǎn)化畢赤酵母→高密度發(fā)酵表達(dá)→上清液分離→超濾濃縮→陽離子交換層析純化→脫鹽→除菌過濾→制劑分裝→成品凍干。經(jīng)上述步驟，即可制備得到純度大于99％，生物比活性高于500，000IU/mg蛋白的rPA。
實施例1首先用PCR擴增和定點突變的方法獲得rPA的全長cDNA。經(jīng)DNA序列測定證實其序列正確后，插入我們已改建過的酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-Y。所構(gòu)建成的表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)DNA序列測定分析正確后，用Sal I酶切成線性質(zhì)粒，用電穿孔的方法轉(zhuǎn)化入畢赤酵母，經(jīng)過篩選即得到rPA的高表達(dá)酵母工程菌。該工程菌在酵母培養(yǎng)基中生長、誘導(dǎo)、分泌，再將發(fā)酵液離心后，取上清液，超濾至十分之一體積，經(jīng)脫鹽后，過CM-Sepharose陽離子交換層析柱純化，即得到純度＞99％，比活性高于500，000IU/mg的rPA純品。
本發(fā)明的優(yōu)點本發(fā)明提供了一種t-PA的新型重組衍生物-組合突變體rPA以及用酵母分泌表達(dá)具天然蛋白結(jié)構(gòu)和生物活性的rPA的新型工藝方法。rPA在具有天然t-PA的優(yōu)點，如血栓特異性的同時，還具有以下優(yōu)點顯著增強的血纖蛋白刺激性，延長的半衰期，增加的酶原性以及提高的對PAI-1抑制的耐受性。因而可能成為具有諸多臨床優(yōu)勢的新一代溶栓藥物。
權(quán)利要求
1.組織型纖溶酶原激活劑(簡稱t-PA)的組合突變體(簡稱rPA)。其特征在于將t-PA分子中的EGF區(qū)、Finger區(qū)和Kringle I區(qū)刪除，保留了具有溶栓作用的Kringle II和蛋白酶二個功能區(qū)(176-527位氨基酸)，同時將t-PA分子中的126-128位氨基酸HRR突變?yōu)锳AA。
2.如權(quán)利要求1所述的rPA用酵母工程菌進(jìn)行表達(dá)。其特征在于rPA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母構(gòu)建成rPA表達(dá)工程酵母，可表達(dá)rPA并有效地分泌至培養(yǎng)基中。
3.rPA的分離和純化。其特征在于經(jīng)過酵母發(fā)酵、培養(yǎng)液分離、超濾濃縮、陽離子交換層析等步驟，獲得高純度、高比活的rPA。
全文摘要
本發(fā)明從改造組織型纖溶酶原激活劑(簡稱t－PA)的天然分子結(jié)構(gòu)入手，通過蛋白質(zhì)工程改造，得到了t－PA的重組衍生物－組合突變體(簡稱rPA)。將t－PA分子中的EGF區(qū)、Finger區(qū)和Kringle I區(qū)刪除，保留了具有溶栓作用的Kringle II和蛋白酶二個功能區(qū)(176－527位氨基酸)，同時將t－PA分子中的126－128位氨基酸HRR突變?yōu)锳AA，構(gòu)建成新的t－PA組合突變體rPA。將rPA的cDNA插入酵母表達(dá)質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化畢赤酵母后經(jīng)篩選得到高表達(dá)酵母工程菌，再經(jīng)過表達(dá)和一系列純化步驟，可以制備得到高純度、高比活性的rPA。rPA在具有天然t－PA的優(yōu)點，如血栓特異性的同時，還表現(xiàn)出顯著增強的血纖蛋白刺激性，延長的半衰期，增加的酶原性以及提高的對PAI－1抑制的耐受性。因而可能成為具有諸多臨床優(yōu)勢的新一代溶栓藥物。
文檔編號C12N15/81GK1441056SQ0311203
公開日2003年9月10日 申請日期2003年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月26日
發(fā)明者王革 申請人:王革