專利名稱：嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌蛋白酶、其發(fā)酵制備方法及發(fā)酵培養(yǎng)基的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌蛋白酶、其發(fā)酵制備方法及發(fā)酵培養(yǎng)基。
背景技術：
家蠶作為ー種重要的經(jīng)濟動物與鱗翅目昆蟲研究模型，具有生長快、繁殖周期短的特點。在幼蟲期20多天時，家蠶除了自身腸道分泌的消化酶具有消化食物的能力之外，腸道中種類繁多、數(shù)量巨大的微生物群體也對其食物的消化和營養(yǎng)的吸收起重要作用。同吋，由于長期家庭飼養(yǎng)的結(jié)果，家蠶防病能力極其脆弱；腸道內(nèi)有益菌群的存在，能夠有效地幫助家蠶抵制內(nèi)源性細菌病害的侵襲。因此，腸道里的微生物對家蠶具有重要意義。國內(nèi)研究者曾采用傳統(tǒng)的培養(yǎng)手段初步調(diào)查了家蠶腸道微生物種類。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的家蠶腸道主要菌群有腸球菌、葡萄球菌、陰溝腸桿菌和臘樣芽孢桿菌。張劍飛等的研究發(fā)現(xiàn)了豐富的細菌種類和動態(tài)變化，其中微球菌和芽孢桿菌占優(yōu)勢。從這些研究中可以看出，雖然人們對家蠶腸道細菌有一定的認識，但可能是由于蠶種質(zhì)資源及其腸道細菌的多祥性或者研究手段的差異，目前尚沒有較為一致的意見。目前關于嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌(Stenotrophomnas maltophilia)的報道多集中于其臨床分布特點及其耐藥性的研究，并且大多數(shù)學者認為該菌為非發(fā)酵菌。嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌為革蘭氏陰性菌，廣泛存在于自然界中，也可寄居于人或動物的呼吸道和腸道。2003年楊麗等首次從環(huán)節(jié)動物雙齒圍沙蠶的消化道中發(fā)現(xiàn)了該菌，但對該菌發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶的條件以及所產(chǎn)酶的酶學性質(zhì)的研究還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明在不同發(fā)酵條件下對嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌進行培養(yǎng)，將得到的含蛋白酶粗提取液用硫酸銨進行鹽析，得到的固體溶于稀鹽中，控制不同酶促反應條件，研究酶學性質(zhì)，在微生態(tài)制劑的研究方面有一定的實際意義。本發(fā)明的目的在于公開了嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌蛋白酶。本發(fā)明的第二個目的在于公開了嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌蛋白酶的發(fā)酵制備方法。本發(fā)明的第三個目的在于公開了嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌蛋白酶的發(fā)酵培養(yǎng)基。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌蛋白酶，所述嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌蛋白酶通過下述方法制備所得(I)、以嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌為菌種，在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，35°C下培養(yǎng)36h ;其中發(fā)酵培養(yǎng)基中各物質(zhì)的質(zhì)量體積分數(shù)為玉米粉I. 0% (即IOOml水溶液中含有玉米粉的量為I. Og)、黃豆粉1.0%、MgSO4 0.04%, NaCl I. 5%和K2HPO4 0.1%，發(fā)酵培養(yǎng)基的PH值為7. 0，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量60% ；(2)、將步驟(I)中培養(yǎng)36h的的發(fā)酵液4°C下4000r/min高速冷凍離心IOmin,取上清液，在上清液中緩慢地加入固體硫酸銨至80%飽和度，4°C下沉淀12h，待蛋白酶析出，冷凍離心，取沉淀加入去離子水稀釋即為含蛋白酶的酶液。上述技術方案中所述的嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌蛋白酶，其中，所述嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌蛋白酶的酶促反應溫度為45°C -55°C ;酶促反應pH值為9. O。上述技術方案中所述的嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌蛋白酶，其中，所述嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌蛋白酶的酶促反應溫度為50°C。上述技術方案中任一技術方案所述的嗜麥寡養(yǎng)食單胞菌蛋白酶，其中，嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵步驟之前還包括將嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌接種于富集培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)6h的富集培養(yǎng)步驟，所述富集培養(yǎng)基的制備方法為稱取胰化蛋白胨lg，酵母提取物O. 5g，NaCl lg，溶解并定容于IOOmL容量瓶中，高壓滅菌。 嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌蛋白酶的發(fā)酵制備方法，所述制備方法包括下述步驟(I)、以嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌為菌種，在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，35 °C下培養(yǎng)36h ;其中發(fā)酵培養(yǎng)基中各物質(zhì)的質(zhì)量體積分數(shù)為玉米粉I. 0%，黃豆粉I. 0%，MgS04
O.04%, NaCl I. 5%, K2HPO4 O. I%，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為7. O，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量60% ;(2)、將步驟(I)中培養(yǎng)36h的的發(fā)酵液4°C下4000r/min高速冷凍離心IOmin,取上清液，在上清液中緩慢地加入固體硫酸銨至80%飽和度，4°C下沉淀12h，待蛋白酶析出，冷凍離心，取沉淀加入去離子水稀釋即為含蛋白酶的酶液。嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌蛋白酶的發(fā)酵制備方法，所述發(fā)酵制備方法包括下述步驟(I)、將嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌接種于富集培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)6h的富集培養(yǎng)步驟，所述集培養(yǎng)基的制備方法為稱取胰化蛋白胨lg，酵母提取物O. 5g, NaCl lg,溶解并定容于IOOmL容量瓶中，高壓滅菌；(2)、以富集培養(yǎng)的嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌為菌種，在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，35 0C下培養(yǎng)36h;其中發(fā)酵培養(yǎng)基中各物質(zhì)的質(zhì)量體積分數(shù)為玉米粉1.0%，黃豆粉1.0%, MgSO4O. 04%, NaCl I. 5%, K2HPO4 O. I %，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為7. O，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量60% ；(3)、將步驟(2)中培養(yǎng)36h的的發(fā)酵液4°C下4000r/min高速冷凍離心lOmin，取上清液，在上清液中緩慢地加入固體硫酸銨至80%飽和度，4°C下沉淀12h，待蛋白酶析出，冷凍離心，取沉淀加入去離子水稀釋即為含蛋白酶的酶液。嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌蛋白酶的發(fā)酵培養(yǎng)基，其中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中各物質(zhì)的質(zhì)量體積分數(shù)為玉米粉1.0%，黃豆粉1.0%，MgSO4 O. 04%, NaCl I. 5%, K2HPO4 0.1%，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為7.0。本發(fā)明具有以下有益效果I、本發(fā)明在從家蠶腸道分離出嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌的基礎上，進ー步公開了嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌的發(fā)酵培養(yǎng)條件及其所產(chǎn)蛋白酶的酶學性質(zhì)。2、本發(fā)明在優(yōu)化了難以發(fā)酵產(chǎn)酶的的嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌的發(fā)酵條件，獲得了其最佳發(fā)酵參數(shù)，為其發(fā)酵エ業(yè)應用提供了基本參數(shù)。3、本發(fā)明所獲得的嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌蛋白酶具有較強的降解動物源蛋白質(zhì)能力，特別是在降解動物毛發(fā)方面具有較強的應用潛力。


I、圖I為培養(yǎng)溫度對嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌產(chǎn)蛋白酶的影響；2、圖2為培養(yǎng)時間對嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌產(chǎn)蛋白酶的影響；3、圖3為pH值對嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌產(chǎn)蛋白酶的影響；4、圖4為溫度對蛋白酶活力的影響；5、圖5為pH值對蛋白酶活力的影響；6、圖6為蛋白酶的熱穩(wěn)定性；7、圖7為蛋白酶的pH穩(wěn)定性。
具體實施例方式為使本發(fā)明的技術方案便于理解，以下結(jié)合具體試驗例對本發(fā)明作進ー步的說明，本發(fā)明實施例和試驗例所采用的材料和方法如下一、材料和方法I、材料與試劑分離自5齡家蠶腸道內(nèi)容物的嗜麥寡養(yǎng)食單胞菌株，由安徽農(nóng)業(yè)大學生命科學學院生理學教研室提供，也可從市場購買；福林-酚試劑，酪蛋白，三氯こ酸，碳酸鈉，Imol/LNaOH溶液，pH7. 4磷酸緩沖液。2、主要儀器分光光度計722S，臺式電子天平，可調(diào)恒溫水浴鍋HH-2，高速冷凍離心機，精密pH計，高溫蒸汽滅菌鍋，恒溫搖床，IOOOul微量移液器。3、培養(yǎng)基的制備(I)、富集培養(yǎng)基稱取胰化蛋白胨lg，酵母提取物O. 5g，NaCl lg，溶解并定容于IOOmL容量瓶中，高壓滅菌，即得富集培養(yǎng)基。(2)、發(fā)酵培養(yǎng)基稱取玉米粉1.08，黃豆粉1.(^，1%304 0 . 048，恥(1 I. 5g, K2HPO4
O.lg，置于IOOml錐形瓶中混合加水至IOOml煮沸，冷卻后，高壓滅菌，即得發(fā)酵培養(yǎng)基。4、1%酪蛋白溶液的配制；稱取O. 25g酪蛋白置于小燒杯中，用少量Imol/LNaOH溶液慢慢溶解酪素，加適量磷酸緩沖液(0.2mol/L NaH2PO4 39mL+0. 2mol/LNa2HP04 61mL。)，于容量瓶中定容至 25mL。放于4°C冰箱中冷藏保存(有效期3d)。5、酶活力的測定取發(fā)酵培養(yǎng)液，4000r/m離心lOmin，反應時取上清液1ml，I %酪蛋白溶液1ml，恒溫水浴15min,加2ml三氯こ酸終止反應,過濾反應液,取濾液依次加5ml Na2C03> Iml倍比稀釋(加水按照I : I比例稀釋)的福林酚試劑，顯色IOmin ;對照組先加2ml三氯こ酸，恒溫水浴15min，再加酪蛋白，過濾，其余步驟同反應組。酶活力単位定義在一定溫度和pH條件下，一定時間內(nèi)從酪蛋白中降解釋放I μ mo I酪氨酸所需要酶量為I個酶活力單位(U)。實施例I :嗜麥寡養(yǎng)食單胞菌所產(chǎn)蛋白酶的制備:(I)、以嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌為菌種，在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，35 °C下培養(yǎng)36h ;其中發(fā)酵培養(yǎng)基中各物質(zhì)的質(zhì)量體積分數(shù)為玉米粉1.0%，黃豆粉1.0%，MgSO4O.04%, NaCl I. 5%, K2HPO4 O. I%，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為7. O，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量60% ;(2)、將步驟(I)中培養(yǎng)36h的的發(fā)酵液4°C下4000r/min高速冷凍離心IOmin,取上清液，在上清液中緩慢地加入固體硫酸銨至80%飽和度，4°C下沉淀12h，待蛋白酶析出，冷凍離心，取沉淀加入去離子水稀釋即為含蛋白酶的酶液。本實施例的參數(shù)通過以下方法得到一、培養(yǎng)條件的優(yōu)化選取L9(34)正交設計表，以發(fā)酵上清液蛋白酶活力值為考察指標，以培養(yǎng)溫度(A)、培養(yǎng)時間(B)、pH值(C)、裝液量(D)為實驗因素，每個因素設計3個實驗水平，因素水平設計如表I。表I L9 (34)正交實驗設計表
水平[A(°C ) F B(h) Γ C T D(ml)
13536 7 60
24248 8 80
3Γ 50 ] 60 I 9 [ 100實驗結(jié)果如表2所示表2 L9 (34)正交實驗結(jié)果
_ 處理 _ABCD酶活/U
1I11175.108
2I222 35.914
3I33.322.420
42123 39.911
52231 69.014
62312 23.548
73132 24.785
83213 18.968
93321 38.943 Til133.442139.804117.624 183.065
Ti2132.473123.896114.768 84.247Til82.69684.911116.219 81.299Xil44.48146.60139.208 61.022Xa44.15841.29938.256 28.082_ Xa __27.565 _28.304_ 38.740 _ 27.100 __由表2可以看出裝液量對菌的產(chǎn)酶量的影響最大，其次為培養(yǎng)時間和溫度，pH值的影響較小，最優(yōu)培養(yǎng)條件為A1B1C1D1,即培養(yǎng)溫度35°C、培養(yǎng)時間36h、pH7. O和裝液量60mL。再分別設計了培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、pH值三個單因素條件來研究該菌的最適產(chǎn)酶條件的穩(wěn)定性。ニ、對培養(yǎng)條件的穩(wěn)定性進行驗證按照本技術領域的一般方法，產(chǎn)酶量大、酶活力高，產(chǎn)酶量小、則酶活力低，產(chǎn)酶量與酶活力成正比，所以產(chǎn)酶量的大小是通過酶活力高低的測定來確定，以下各條件對產(chǎn)酶的影響均通過酶活力的高低來說明。(I)、培養(yǎng)溫度對菌產(chǎn)酶的影響將發(fā)酵培養(yǎng)基pH均調(diào)至7. 0，裝液量60mL，在30°C、35°C、40°C、45°C下分別搖床培養(yǎng)36h，測定上清液酶活力，結(jié)果如圖I所示圖I顯示，隨著溫度的升高，酶活力先上升再下降，當培養(yǎng)溫度為35°C時酶活力最強，超過或低于35°C都不利于產(chǎn)酶，因此實驗中均將培養(yǎng)溫度設為35°C，以保證嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌處于最佳的產(chǎn)酶狀態(tài)。
(2)、培養(yǎng)時間對菌產(chǎn)酶的影響將發(fā)酵培養(yǎng)基的pH調(diào)至7. 0，培養(yǎng)溫度設為35°C，裝液量60mL，分別搖床培養(yǎng)24h、36h、48h、60h，測定上清液酶活力，結(jié)果如圖2。圖2顯示，隨著培養(yǎng)時間的増加，酶活力變化曲線呈現(xiàn)出鐘形曲線，在36h是酶活最大，因此實驗中均將培養(yǎng)時間設為36h。(3)、pH值對菌產(chǎn)酶的影響將菌搖床培養(yǎng)36h，培養(yǎng)溫度為30°C，裝液量60mL，在pH6. 0,7. 0,8. 0,9. 0,10. O的條件下分別培養(yǎng)，測定上清液酶活力，結(jié)果如圖3所示。圖3顯示，pH為7時酶活力最大，過酸或過堿都不利于菌的產(chǎn)酶，因此要控制發(fā)酵培養(yǎng)基的PH為7。三、最適發(fā)酵培養(yǎng)基I、不同碳、氮源對產(chǎn)酶的影響(I)、配置發(fā)酵培養(yǎng)基吋，只改變所加碳源的種類，分別為蔗糖，淀粉，葡萄糖，玉米粉，而控制其他成分均不變，接種后搖床培養(yǎng)，研究不同碳源條件對嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如表3所示；(2)、配置發(fā)酵培養(yǎng)基吋，只改變所加氮源的種類，分別為牛肉膏，蛋白胨，玉米粉，黃豆粉，而控制其他成分均不變，接種后搖床培養(yǎng)，研究不同氮源條件對嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如表3所示；2、不同碳、氮源配比對產(chǎn)酶的影響配置發(fā)酵培養(yǎng)基取三只錐形瓶，分別編號為I，2，3 ;控制其它成分不變，在I號錐形瓶中加入O. 5g碳源，I. 5g氮源；2號錐形瓶中加入O. Ig碳源,0. Ig氮源；3號錐形瓶中加入O. 15g碳源，O. 5g氮源；接種后搖床培養(yǎng)，分別測定各個條件下的酶活，得出最適碳、氮比，結(jié)果如表3所不；3、金屬離子對產(chǎn)酶的影響在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別加入不同的金屬離子(Cu2+、Mg2+、K+、Ca2+等)，對照組加等量的去離子水。分別測酶活，通過與對照組的比較，判斷各金屬離子對產(chǎn)酶的影響，結(jié)果如表3所示。表3 單因素作為培養(yǎng)基成分對菌株產(chǎn)蛋白酶能力的影響
權(quán)利要求
1.嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌蛋白酶，所述嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌蛋白酶通過下述方法制備所得 (1)、以嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌為菌種，在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，35°C下培養(yǎng)36h;其中發(fā)酵培養(yǎng)基中各物質(zhì)的質(zhì)量體積分數(shù)為玉米粉I. 0%、黃豆粉I. OMgSO4 0. 04%,NaClI. 5%和K2HPO4 0. I %，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為7.0，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量60% ； (2)、將步驟(I)中培養(yǎng)36h的發(fā)酵液4°C下4000r/min高速冷凍離心IOmin,取上清液，在上清液中緩慢地加入固體硫酸銨至80%飽和度，4°C下沉淀12h，待蛋白酶析出，冷凍離心，取沉淀加入去離子水稀釋即為含蛋白酶的酶液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌蛋白酶，其特征在于所述嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌蛋白酶的酶促反應溫度為45°C -55°C ;酶促反應pH值為9. O。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的嗜麥寡養(yǎng)食單胞菌蛋白酶，其特征在于所述嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌蛋白酶的最適酶促反應溫度為50°C。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任ー權(quán)利要求所述的嗜麥寡養(yǎng)食單胞菌蛋白酶，其特征在干，嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵步驟之前還包括將嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌接種于富集培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)6h的富集培養(yǎng)步驟，所述富集培養(yǎng)基的制備方法為稱取胰化蛋白胨lg，酵母提取物0. 5g，NaCl lg，溶解并定容于IOOmL容量瓶中，高壓滅菌。
5.嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌蛋白酶的發(fā)酵制備方法，所述發(fā)酵制備方法包括下述步驟 (1)、以嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌為菌種，在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，35°C下培養(yǎng)36h;其中發(fā)酵培養(yǎng)基中各物質(zhì)的質(zhì)量體積分數(shù)為玉米粉I. 0%，黃豆粉I. 0%,MgSO4 0. 04%,NaClI.5%, K2HPO4 0. I%，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為7.0，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量60% ； (2)、將步驟(I)中培養(yǎng)36h的的發(fā)酵液4°C下4000r/min高速冷凍離心IOmin,取上清液，在上清液中緩慢地加入固體硫酸銨至80%飽和度，4°C下沉淀12h，待蛋白酶析出，冷凍離心，取沉淀加入去離子水稀釋即為含蛋白酶的酶液。
6.嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌蛋白酶的發(fā)酵制備方法，所述發(fā)酵制備方法包括下述步驟 (1)、將嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌接種于富集培養(yǎng)機中搖床培養(yǎng)6h的富集培養(yǎng)步驟，所述集培養(yǎng)基的制備方法為稱取胰化蛋白胨lg，酵母提取物0. 5g,NaCl lg,溶解并定容于IOOmL容量瓶中，高壓滅菌； (2)、以富集培養(yǎng)的嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌為菌種，在液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵，35°C下培養(yǎng)36h;其中發(fā)酵培養(yǎng)基中各物質(zhì)的質(zhì)量體積分數(shù)為玉米粉1.0%，黃豆粉1.0%，MgSO4O. 04%, NaCl 1.5%, K2HPO4 0. I%，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為7. 0，發(fā)酵培養(yǎng)基的裝液量60% ； (3)、將步驟(2)中培養(yǎng)36h的的發(fā)酵液4°C下4000r/min高速冷凍離心lOmin，取上清液，在上清液中緩慢地加入固體硫酸銨至80%飽和度，4°C下沉淀12h，待蛋白酶析出，冷凍離心，取沉淀加入去離子水稀釋即為含蛋白酶的酶液。
7.嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌蛋白酶的發(fā)酵培養(yǎng)基，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基中各物質(zhì)的質(zhì)量體積分數(shù)為玉米粉1.0%，黃豆粉1.0%，MgSO4 0. 04%, NaCl I. 5%, K2HPO4 0.1%，發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為7.0。
全文摘要
本發(fā)明嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌蛋白酶、其發(fā)酵制備方法及發(fā)酵培養(yǎng)基，屬于生物技術領域。所述蛋白酶通過下述方法制備所得(1)以嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌為菌種，在含有玉米粉、黃豆粉、MgSO4、NaCl和K2HPO4的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵；(2)將步驟(1)中培養(yǎng)36h的發(fā)酵液高速冷凍離心10min，取上清液，在上清液中緩慢地加入固體硫酸銨至80％飽和度，4℃下沉淀12h，待蛋白酶析出，冷凍離心，取沉淀加入少量去離子水稀釋即為含蛋白酶的粗酶液。本發(fā)明具有優(yōu)化了難以發(fā)酵產(chǎn)酶的嗜麥寡養(yǎng)食單孢菌的發(fā)酵條件，為其發(fā)酵工業(yè)應用提供了基本參數(shù)的優(yōu)點。
文檔編號C12N9/52GK102864133SQ201210310200
公開日2013年1月9日 申請日期2012年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月25日
發(fā)明者王在貴, 李阿敏, 劉朝良, 劉金陽, 李大輝, 劉華霞, 曹雙鳳 申請人:安徽農(nóng)業(yè)大學