專利名稱：新型狂犬病病毒疫苗ctn181株反向遺傳系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明通過(guò)對(duì)原有狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遺傳系統(tǒng)進(jìn)行改造，構(gòu)建新型的反向遺傳系統(tǒng)，為研制安全、穩(wěn)定、高效的新型狂犬病病毒疫苗奠定基礎(chǔ)。
背景技術(shù)：
狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus)引起的ー種急性、動(dòng)物源性人獸共患傳染病，病毒感染人或動(dòng)物后，病死率幾乎達(dá)100 %，是迄今為止人類病死率最高的急性傳染病。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報(bào)告顯示，全世界毎年因狂犬病死亡人數(shù)達(dá)55000人，其中99%發(fā)生于亞洲和非洲，僅亞洲每年大約死亡35000 40000人。目前，狂犬病尚無(wú)有效的治療手段，接種疫苗仍是預(yù)防狂犬病唯一有效的方法。因此，在我國(guó)需要對(duì)犬進(jìn)行大規(guī)模的免疫接種及加強(qiáng)對(duì)人暴露前和暴露后預(yù)防免疫，這是降低我國(guó)狂犬病的發(fā)病率的ー項(xiàng) 有效措施[參見(jiàn)俞永新.中國(guó)預(yù)防控制狂犬病降低發(fā)病率的思考[J].中國(guó)計(jì)劃免疫，2007，13 (4):391-397.]。目前，狂犬疫苗主要以細(xì)胞培養(yǎng)疫苗和減毒活疫苗為主。由于人用狂犬疫苗價(jià)格和產(chǎn)量的原因，狂犬病的預(yù)防免疫需要的費(fèi)用較高，而且往往需要多次接種，一般家庭難以承受。對(duì)于獸用疫苗，普遍應(yīng)用的為減毒活疫苗，數(shù)量嚴(yán)重不足而且質(zhì)量往往的不到保證，注射后還存在發(fā)生狂犬病的潛在危險(xiǎn)，WHO狂犬病專家并不主張用減毒活疫苗注射免疫動(dòng)物(參見(jiàn)WH0. Expert Committee on Rabies[M]. 1st report, Geneva: WHO. 2005. 931.) 因此，非常有必要研發(fā)ー種安全、穩(wěn)定、高效和廉價(jià)的新型狂犬疫苗。CTN株狂犬病病毒的親代病毒為1956年在山東省淄博市ー個(gè)感染狂犬病的病人腦組織中分離得到，經(jīng)鼠腦和人二倍體細(xì)胞連續(xù)多次傳代得到的減毒疫苗株，并于1983年和2005被世界衛(wèi)生組織(WHO)批準(zhǔn)作為中國(guó)狂犬病疫苗生產(chǎn)用毒株?；蛐蛄蟹治霰砻?，CTN株與我國(guó)各病毒株的核苷酸同源性為82% 93%，大于其他疫苗株與街毒代表株間的同源性，表明該疫苗能有效預(yù)防我國(guó)目前流行的狂犬病[參加盂勝利，徐葛林，明平剛，等.狂犬病毒疫苗株CTN-I八代次N和G基因序列測(cè)定及分析[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2007，23 (4) : 327-332.]。RNA病毒反向遺傳技術(shù)的核心是構(gòu)建RNA病毒的全長(zhǎng)cDNA分子，在DNA水平上可對(duì)該cDNA可進(jìn)行各種修飾或改造，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄過(guò)程可再次得到病毒RNA，將這些經(jīng)改造的RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞，即可獲得改造后的新病毒。這項(xiàng)新技術(shù)為RNA病毒分子生物學(xué)研究開(kāi)辟了新途徑，也為新型疫苗的研發(fā)提供了有力的工具。近年來(lái)，狂犬病病毒的反向遺傳學(xué)研究進(jìn)展迅速，相繼有六株狂犬病病毒株SAD B19, RC-HL, HEP-Flury, SHBRV, HNlO和CTN的感染性克隆構(gòu)建成功，狂犬病病毒反向遺傳體系構(gòu)建策略不斷完善，為研發(fā)新型的狂犬病減毒活疫苗奠定了基礎(chǔ)。研究表明G蛋白是狂犬病病毒顆粒的表面膜蛋白，是誘發(fā)中和抗體的唯一抗原，對(duì)狂犬病病毒致病性和免疫原性起關(guān)鍵作用。G蛋白上的333位精氨酸或賴氨酸是狂犬病病毒致病決定因子，這個(gè)殘基被選為產(chǎn)生減毒株的靶位點(diǎn)(參見(jiàn)=Tuffereau C，Leblois H，Benejean J，et al. Arginine or lysine in position 333 of ERA and CVSglygoprotein is necessary for rabies virulence in adult mice [J]. Virology, 1989,172(1):206-212.);而6蛋白中194位的天冬氨酸替換為絲氨酸可以增加狂犬病病毒的遺傳穩(wěn)定性(參見(jiàn)Faber M, Faber M L，Papaneri A，et al. A single amino acidchange in rabies virus glycoprotein increases virus spread and ennances viruspathogenicity[J]. J. Virol. 2005，79:14141 - 14148.)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的任務(wù)是提供ー種新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遺傳系統(tǒng)。本專利申請(qǐng)?jiān)谝延械目袢〔《疽呙鏑TN181株反向遺傳系統(tǒng)(以下簡(jiǎn)稱CTN181反向遺傳系統(tǒng))的達(dá)礎(chǔ)上(參見(jiàn)Huang Y，Tang Q, bus an A, et al. Development of a reverse geneticssystem for a human rabies virus vaccine strain employed in China[J] . VirusRes，2010, 149 :28-35.),首先應(yīng)用基因定點(diǎn)突變技術(shù)，分別對(duì)CTN反向遺傳系統(tǒng)中G蛋白第194位和第333位氨基酸進(jìn)行突變(194位天冬酰胺一絲氨酸；333位谷氨酰胺一谷氨酸)，將突變后的G蛋白基因替換CTN181反向遺傳系統(tǒng)中的G蛋白基因；并對(duì)突變后的G蛋白基 因進(jìn)行拷貝將其插入到CTN181反向遺傳系統(tǒng)中G-L基因間的非編碼區(qū)，分別構(gòu)建含有兩個(gè)和三個(gè)突變后G蛋白基因的全長(zhǎng)感染性克隆(構(gòu)建示意圖見(jiàn)圖7)，隨后將其與輔助質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染BSR細(xì)胞，拯救出經(jīng)改造的新型狂犬病病毒疫苗株。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案是本發(fā)明提供的這種新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遺傳系統(tǒng)，是對(duì)狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遺傳系統(tǒng)中G蛋白第194位和第333位氨基酸位點(diǎn)實(shí)施定點(diǎn)突變，使G蛋白第194位氨基酸由原來(lái)的天冬酰胺突變?yōu)榻z氨酸，第333位氨基酸由原來(lái)的谷氨酰胺突變?yōu)楣劝彼帷１景l(fā)明提供的這種新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遺傳系統(tǒng)含有ー個(gè)、兩個(gè)或/和三個(gè)突變后G蛋白基因的全長(zhǎng)感染性克隆。利用本發(fā)明提供的這種新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遺傳系統(tǒng)，可拯救出經(jīng)改造的新型狂犬病病毒疫苗株。本發(fā)明的另ー個(gè)任務(wù)是提供ー種新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遺傳系統(tǒng)的構(gòu)建方法。本發(fā)明提供的新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遺傳系統(tǒng)的構(gòu)建方法，包括以下步驟步驟ー應(yīng)用基因定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遺傳系統(tǒng)中的G蛋白基因進(jìn)行突變，使G蛋白第194位氨基酸由原來(lái)的天冬酰胺突變?yōu)榻z氨酸，第333位氨基酸由原來(lái)的谷氨酰胺突變?yōu)楣劝彼?，具體方法是將要突變的G蛋白基因擴(kuò)增后克隆到pGEM-T載體，利用以下引物m-Fl :5’ -TGTGATATTTTCACCM2AGCAGAGGGAAGAGA-3，m-Rl :5’ -TCTCTTCCCTCTGCTGCTGGTGAAAATATCACA-3’m-F2 :5， -TCACTACAAATCGGTCGAAACTTGGGATGAGAT-3，m-R2 :5’ - ATCTCATCCCAAGTTTCGACCGATTTGTAGTGA -3’對(duì)G蛋白基因中194位和333位的氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，將突變后的G蛋白基因命名為GAS基因，將得到的突變后的重組質(zhì)粒命名為pGEM-GAS ；
步驟ニ 利用以下引物分別擴(kuò)增GAS基因G-Fl :5，-GAATTCTAGAACATGTCAACTATGG-3’ 與 G-R3 5’-GCTAGCTTTTTTTGGACTTGAAATATGAAGG-3，；G-F4 :5’ -GCGCGCCTTTTAACATCCCTCAAAAGAC -3，與 G-R35，- GCTAGCTTTTTTTGGACTTGAAATATGAAGG-3’ ；G-F2 5，-GCGATCGCCTTTTAACATCCCTCAAAAGAC-3，G-R25，-GGCGCGCCTTTTTTTGGACTTGAAATATGAAGG-3，；G-F3 :5，-GGCGCGCCCTTTTAACATCCCTCAAAAGAC -3，與 G-R3 :5，- GCTAGCTTTTTTTGGACTTGAAATATGAAGG-3’ ；將PCR產(chǎn)物切膠回收后與pGEM-T載體進(jìn)行連接，構(gòu)建成重組質(zhì)粒PGEM-GAS1、 PGEM-GAS2、PGEM-GAS3、pGEM_GAS4；步驟三人工合成含有BssH II、AsiS I、Asc I、Asc I酶切位點(diǎn)的linker并與PMD18-T載體連接，得到中間載體pMD-MCS ；步驟四利用內(nèi)切酶BsiW I、Nhe I分別對(duì)pCTN_GFP和PGEM-GAS1進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物切膠回收后進(jìn)行連接構(gòu)建成重組質(zhì)粒PCTN-GAS。步驟五利用內(nèi)切酶BsiW I、BssH II分別對(duì)pCTN_GFP和pGEM_GAS進(jìn)行雙酶切后連接構(gòu)建pCTN-GAS-GFP ;隨后，利用內(nèi)切酶BssH II、Nhe I分別對(duì)pCTN-GAS_GFP和PGEM-GAS2進(jìn)行雙酶切后連接構(gòu)建成重組質(zhì)粒pCTN-GASGAS。步驟六利用內(nèi)切酶Asc I ,Nhe I分別對(duì)pMD_MCS和pGEM_GAS4進(jìn)行雙酶切后連接構(gòu)建重組質(zhì)粒PMD-GAS4 ;隨后，利用內(nèi)切酶AsiS I ,Asc I雙酶切pMD_GAS4和pGEM_GAS3后連接構(gòu)建PMd-GAS3GAS4 ;將PMd-GAS3GAS4利用內(nèi)切酶Asc I單酶切后切膠回收，再利用SI核酸酶處理去掉突出的堿基，經(jīng)T4 DNA連接酶連接以去除Asc I酶切位點(diǎn)，處理后的PMd-GAS3GAS4與pCTN-GAS-GFP經(jīng)BssH II、Nhe I雙酶切后連接構(gòu)建成重組質(zhì)粒pCTN-GASGASGASo實(shí)驗(yàn)資料I材料與方法I. I細(xì)胞與質(zhì)粒BSR 細(xì)胞與 MNA 細(xì)胞購(gòu)于 ATCC ;pVAX_l 購(gòu)于 Invitrogen 公司；pCTN-GFP為含有狂犬病病毒CTN181株全基因組的重組質(zhì)粒，是將狂犬病病毒CTN181株全基因組按順序分四段克隆在pVAX-1之中，同時(shí)將綠色熒光蛋白(GFP )基因插入到CTN181株G-L間隔區(qū)；輔助質(zhì)粒pVAX-N、pVAX-P、pVAX-L是分別將CTN181株N、P和L基因插入到pVAX_l之中(具體方法參見(jiàn)Huang Y，Tang Q, Susan A, et al. Development of a reversegenetics system for a human rabies virus vaccine strain employed in China[J].VirusRes ， 2010,149 :28-35.)。pGEM-T 購(gòu)于 Promega 公司；pMD18-T 購(gòu)于 Takara 公司。I. 2其它試劑GoTaq Green Master Mix 購(gòu)于 Promega 公司；
DH5a 感受態(tài)細(xì)胞、DL15000 DNA Marker、DL2000 DNA Marker、反轉(zhuǎn)錄酶 MMLV、dNTP mixture 購(gòu)于 Takara 公司；Easy-A High Fidelity cloning enzyme 、 QuikChange Site-DiretedMutagenesis Kit 為 Stratagene 公司產(chǎn)品；各種限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購(gòu)于NEB公司；質(zhì)粒小量與大量提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購(gòu)于Qiagen公司；Lipofectamine 2000 Reagent、TRIzol LS 購(gòu)自 Invitrogen 公司；FITC標(biāo)記的抗狂犬病病毒N蛋白抗體購(gòu)自Millipore公司。I. 3實(shí)驗(yàn)方法 1.3.1引物設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)中所用到引物序列及含有的酶切位點(diǎn)見(jiàn)表I。表I引物序列和所含有的酶切位點(diǎn)
引物名稱引物序列<5’-3')備注
Primer namesPnmer sequencesRemarks
G-Fl5,-GAAIICTAGAACATGTCAACTATGG-3'EcoR I 酶切位點(diǎn)
G-RiS5-Gcgcgctttttttggacttg-S ,BssH Ii 酶切位點(diǎn)
m-Fl5，-TGTGATATTTTCACCAGCAGCAGAGGGAAGAGA-3 ’194突變位點(diǎn)
m-Rl5，-TCTCTTCCCTCTCCTCCTCGTGAAAATATCACA-3，194 突變位點(diǎn)
m-F25'-TCACTACAAATCGGTCGAAACTTGGGATGAGAT-3'333 突變位點(diǎn)
m-R25’- ATCTCATCCCAAGTTTCGACCGATTTGTAGTGA -3’333突變位點(diǎn)
MCS-Fl5 -GCGCGCAAAGCGATCGCAAGGCGCGCCAAAGCTAGCA -3'BssH II> AsiS I、Ase I、
MCS-Rl5 -GCTAGCTTTGGCGCGCCTTGCGATCGCTTTGCGCGCA -3，Nhe I 酶切位點(diǎn)
G-F2s^gcgatcgccttttaacatccctcaaaagac -3’AsiS I 酶切位點(diǎn)
G-R2s^ggcgcgcctttttttggacttgaaatatgaagg-s,Asc I 酶切位點(diǎn)
G-F35,-GGCGCGCCCTTTTAACATCCCTCAAAAGAC -3’Asc I 酶切位點(diǎn)
G-R35’- GCTAGCTTTTTTTGGACTTGAAATATGAAGG-3 ’Nhe I 酶切位點(diǎn)
G-F45,-GCGCGCCTTTTAACATCCCTCAAAAGAC -3’BssH II 酶切位點(diǎn)
nest-F5’-CGTACGATAAATCACTTCATTCGAG-3’鑒定引物
nest-R5; -TCCAGGC AC AAGCTTCCTC AAGGGA-35鑒定引物1.3.2 G蛋白基因的定點(diǎn)突變分析含有狂犬病病毒CTN181株全基因組pCTN-GFP質(zhì)粒的序列，考慮到在全長(zhǎng)質(zhì)?；A(chǔ)上進(jìn)行定點(diǎn)突變，序列太長(zhǎng)，突變難度大而且效率。所以，首先設(shè)計(jì)引物將要突變的G蛋白基因擴(kuò)增后克隆到pGEM-T載體。按照QuikChange Site-Direted Mutagenesis Kit 的操作說(shuō)明，利用引物 m_Fl、m_Rl 和 m_F2、m-R2對(duì)G蛋白基因中194位和333位的氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，將突變后的G蛋白基因命名為GAS基因，突變后的重組質(zhì)粒命名為pGEM-GAS。1.3.3中間載體pMD-MCS的構(gòu)建與鑒定在構(gòu)建含有多個(gè)GAS基因的過(guò)程中需要用到中間載體PMD18-T，并在中間載體中插入含有多個(gè)酶切位點(diǎn)的人工接頭。首先人工合成含有BssH IKAsiS I、Asc I、Asc I酶切位點(diǎn)的linker，按照一定比例與pMD18_T載體連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5 a后，通過(guò)測(cè)序的方法鑒定重組質(zhì)粒。I. 3. 4 連接 T 載體利用引物 G-Fl 與 G_R3、G_F4 與 G_R3、G_F2 與 G_R2、G_F3 與G-R3分別擴(kuò)增GAS基因，將PCR產(chǎn)物切膠回收后與pGEM_T載體按照一定比例進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒PGEM-GAS1、PGEM-GAS2、PGEM-GAS3、pGEM-GAS4，并通過(guò)PCR、雙酶切和測(cè)序的方法對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。1.3.5重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 (I)利用內(nèi)切酶BsiW I、Nhe I分別對(duì)pCTN-GFP和PGEM-GAS1進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物切膠回收后按照一定比例進(jìn)行連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pCTN-GAS ；(2)先利用內(nèi)切酶BsiW I ,BssH II分別對(duì)pCTN-GFP和pGEM-GAS進(jìn)行雙酶切后連接構(gòu)建pCTN-GAS-GFP。隨后，利用內(nèi)切酶BssH II、Nhe I 分別對(duì)pCTN-GAS-GFP 和 pGEM_GAS2
進(jìn)行雙酶切后連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pCTN-GASGAS ；(3)先利用內(nèi)切酶Asc I ,Nhe I分別對(duì)pMD_MCS和pGEM_GAS4進(jìn)行雙酶切后連接構(gòu)建重組質(zhì)粒PMD-GAS4。隨后，利用內(nèi)切酶AsiS I、Asc I雙酶切pMD_GAS4和pGEM_GAS3后連接構(gòu)建PMd-GAS3GAS4。實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)Asc I識(shí)別位點(diǎn)中含有BssH II酶切位點(diǎn)，會(huì)對(duì)后續(xù)酶切產(chǎn)生影響。故先將PMd-GAS3GAS4利用內(nèi)切酶Asc I單酶切后切膠回收，再利用SI核酸酶處理去掉突出的堿基，經(jīng)T4 DNA連接酶連接以去除Asc I酶切位點(diǎn)。處理后的pMD_GAS3GAS4與pCTN-GAS-GFP經(jīng)BssH II、Nhe I雙酶切后連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pCTN_GASGASGAS。各重組質(zhì)粒都通過(guò)PCR、雙酶切和測(cè)序的方法對(duì)進(jìn)行鑒定，具體構(gòu)建示意圖見(jiàn)圖7。1.3.6病毒的拯救將BSR細(xì)胞在6孔板中培養(yǎng)過(guò)夜，待其長(zhǎng)成單層，細(xì)胞密度約為80% 90% (約4 6X105個(gè)細(xì)胞/孔)時(shí)用于轉(zhuǎn)染。分別將1.5iig pCTN-GAS，pCTN-GASGAS, pCTN-GASGASGAS 與 0.75iig pVAX-N, 0. 375 u g pVAX-P,0. 375 u g pVAX-L 與適量的Lipofectamine 2000 Reagent混合后加入6孔板，置于37°C 5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)6h后，更換新鮮配制的含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)3天。將轉(zhuǎn)染細(xì)胞及上清混合物反復(fù)凍融3次收獲重組病毒。1.3.7 DFA鑒定重組病毒在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入100耵新鮮制備的BSR細(xì)胞懸液，然后加入50耵收獲的重組病毒混合均勻，37°C 5% C02培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。去除細(xì)胞上清液，用PBS洗滌I次，加預(yù)冷的80%丙酮4°C固定30min。棄去丙酮，加入I :50稀釋的FITC標(biāo)記的抗狂犬病病毒N蛋白抗體和1:2000稀釋的伊文思藍(lán)，37 %孵育30min，PBS洗滌3次，加入60%甘油避光存放，在熒光顯微鏡下觀察。1.3.8 RT-PCR鑒定重組病毒取250 感染重組病毒上清液加入750 ylTRIzol LS提取病毒RNA，以G-Fl引物為反轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA，由G-Fl和G-Rl擴(kuò)增病毒基因組中G蛋白的序列。同時(shí)，為了提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和靈敏度,再以nest-F和nest-R進(jìn)行巢氏PCR擴(kuò)增G蛋白中的部分序列。體外定點(diǎn)突變技術(shù)是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能之間復(fù)雜關(guān)系的有力工具，也是我們改造/優(yōu)化基因常用的手段。本研究中，我們利用體外定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)狂犬病病毒G蛋白上的兩個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行改造。其中，333位的氨基酸是狂犬病病毒致病決定因子，這個(gè)殘基被選為產(chǎn)生減毒株的靶位點(diǎn)；而將194位的天冬氨酸替換為絲氨酸，可以增加狂犬病病毒的遺傳穩(wěn)定性。研究中，我們選用的是Stratagene公司的QuikChange Site-directedMutagenesis kit,它通過(guò)設(shè)計(jì)ー對(duì)包含突變位點(diǎn)的引物(正、反向)和模板質(zhì)粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循環(huán)延伸”，延伸產(chǎn)物形成帶缺刻的開(kāi)環(huán)質(zhì)粒。DpnI酶切延伸產(chǎn)物，由于原來(lái)的模版質(zhì)粒來(lái)源于常規(guī)大腸桿菌，是經(jīng)dam甲基化修飾的,對(duì)DpnI敏感而被切碎(DpnI識(shí)別序列為甲基化的GATC，GATC在幾乎各種質(zhì)粒中都會(huì)出現(xiàn))，而體外合成的帶突變序列的質(zhì)粒由于沒(méi)有甲基化而不被切開(kāi)，因此在隨后的轉(zhuǎn)化中得以成功轉(zhuǎn)化，通過(guò)篩選、測(cè)序鑒定我們得到了突變質(zhì)粒的克隆。研究表明[參見(jiàn)MiloszF，Rojjanaporn P，Suchita S H，etal.Overexpression of the RaDies Virus (aiycoprotein Results in Ennancement 01Apoptosis and Antiviral Immune Response[J]. J. Virol. 2002, 76 (7):3374-3381.]提高狂犬病病毒G蛋白的表達(dá)量可以促進(jìn)感染細(xì)胞的凋亡及增強(qiáng)機(jī)體的抗病毒免疫。因此，為了増加G蛋白在感染細(xì)胞中的表達(dá)水平和增強(qiáng)減毒活疫苗毒株的免疫原性，我們?cè)诜聪蜻z傳系統(tǒng)全長(zhǎng)質(zhì)粒病毒基因組中利用特定的酶切位點(diǎn)，將突變后的GAS基因替換原有的GFP基因，以構(gòu)建含有兩個(gè)GAS的全長(zhǎng)質(zhì)粒。同吋，為了構(gòu)建含有三個(gè)GAS基因的全長(zhǎng)質(zhì) 粒，我們利用添加了含有合適酶切位點(diǎn)Linker的中間載體，將兩個(gè)GAS基因串聯(lián)到Linker中后再酶切下來(lái)插入原有質(zhì)粒從而構(gòu)建含有三個(gè)GAS基因的全長(zhǎng)質(zhì)粒。在拯救實(shí)驗(yàn)中，本研究將改造后分別含有ー個(gè)、兩個(gè)和三個(gè)GAS基因全長(zhǎng)感染性克隆和輔助質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染BSR細(xì)胞，采用DFA和RT-PCR的方法篩選重組病毒。我們?cè)?孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行轉(zhuǎn)染拯救重組病毒，經(jīng)DFA檢測(cè)中在部分細(xì)胞中可見(jiàn)發(fā)現(xiàn)散在綠色熒光，通過(guò)巢氏PCR檢測(cè)可以擴(kuò)增出預(yù)期的DNA片段，表明重組病毒拯救成功?？傊?，我們對(duì)狂犬病病毒疫苗株CTN181反向遺傳系統(tǒng)進(jìn)行了改造，拯救出了新型的重組病毒，為研制安全、穩(wěn)定和高效的新型狂犬病病毒減毒活疫苗提供合格的疫苗候選株。


圖I :突變體pGEM-GAS的鑒定。G蛋白基因定點(diǎn)突變結(jié)果突變后的質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，G蛋白基因成功的發(fā)生定點(diǎn)突變，638位堿基由A突變?yōu)镚，1054位堿基由C突變?yōu)镚，表明G蛋白基因已突變成功。圖2 :重組質(zhì)粒pCTN-GAS的鑒定。重組質(zhì)粒pCTN_GAS鑒定結(jié)果重組質(zhì)粒pCTN-GAS通過(guò)PCR和酶切鑒定可見(jiàn)1132bp條帶，結(jié)果與預(yù)期一致，表明重組質(zhì)粒pCTN-GAS構(gòu)建成功。圖3 :重組質(zhì)粒pCTN-GASGAS的鑒定。重組質(zhì)粒pCTN_GASGAS鑒定結(jié)果重組質(zhì)粒pCTN-GAS-GFP通過(guò)PCR和酶切鑒定可見(jiàn)1132bp條帶，結(jié)果與預(yù)期一致。重組質(zhì)粒pCTN-GASGAS經(jīng)酶切鑒定可見(jiàn)1657bp條帶，結(jié)果與預(yù)期一致，表明重組質(zhì)粒pCTN-GASGAS構(gòu)建成功。圖4 :重組質(zhì)粒pCTN-GASGASGAS的鑒定。重組質(zhì)粒pCTN_GASGASGAS鑒定結(jié)果重組質(zhì)粒PMD-GAS4通過(guò)PCR、經(jīng)雙酶切鑒定可見(jiàn)1659bp條帶。重組質(zhì)粒pMD_GAS3GAS4經(jīng)雙酶切鑒定可見(jiàn)3320bp條帶。重組質(zhì)粒pCTN-GASGASGAS經(jīng)雙酶切鑒定，可見(jiàn)3320bp條帶，結(jié)果與預(yù)期一致，表明重組質(zhì)粒pCTN-GASGASGAS構(gòu)建成功。圖5 :重組病毒的DFA鑒定。重組病毒DFA鑒定結(jié)果拯救病毒感染BSR細(xì)胞后，經(jīng)丙酮固定，熒光素標(biāo)記抗狂犬病病毒N蛋白抗體染色，在熒光顯微鏡下均可見(jiàn)部分細(xì)胞胞漿內(nèi)有散在熒光點(diǎn)而正常的BSR細(xì)胞不顯示熒光，表明已拯救出重組病毒。圖6 :重組病毒的RT-PCR鑒定。重組病毒的RT-PCR鑒定結(jié)果提取重組病毒RNA，以G-Fl為反轉(zhuǎn)錄引物合成cDNA。由G-Fl和G-Rl進(jìn)行擴(kuò)增，再以其PCR產(chǎn)物為模板，以nest-F和nest-R為引物進(jìn)行巢氏PCR擴(kuò)增出約500bp的條帶，表明已拯救出重組病毒。圖7 :含有突變后G蛋白基因的全長(zhǎng)感染性克隆的構(gòu)建示意圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例II材料與方法 I. I細(xì)胞與質(zhì)粒BSR細(xì)胞與MNA細(xì)胞購(gòu)于ATCC ;pVAX-l購(gòu)于Invitrogen公司；pCTN-GFP為含有狂犬病病毒CTN181株全基因組的重組質(zhì)粒，是將狂犬病病毒CTN181株全基因組按順序分四段克隆在PVAX-I之中，同時(shí)將綠色熒光蛋白(GFP )基因插入到CTN181株G-L間隔區(qū)；輔助質(zhì)粒pVAX-N、pVAX-P, pVAX-L是分別將CTN181株N、P和L基因插入到 pVAX-1 之中(具體方法參見(jiàn)Huang Y，Tang Q, Susan A, et al. Development ofa reverse genetics system for a human rabies virus vaccine strain employed inChina [J] . VirusRes，2010,149 :28-35.) ;pGEM_T 購(gòu)于 Promega 公司；pMD18_T 購(gòu)于Takara 公司。I. 2 其它試劑 GoTaq Green Master Mix 購(gòu)于 Promega 公司；DH5 a 感受態(tài)細(xì)胞、DL15000 DNA Marker、DL2000 DNA Marker、反轉(zhuǎn)錄酶MMLV、dNTP mixture購(gòu)于Takara公 ロJ ；Easy-A High Fidelity cloning enzyme > QuiKChange Site-Direted MutagenesisKit為Stratagene公司產(chǎn)品；各種限制性內(nèi)切酶和T4 DNA連接酶購(gòu)于NEB公司；質(zhì)粒小量與大量提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購(gòu)于Qiagen公司；Lipofectamine 2000 Reagent、TRIzol LS購(gòu)自Invitrogen公司；FITC標(biāo)記的抗狂犬病病毒N蛋白抗體購(gòu)自Millipore公司。I. 3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1引物設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)中所用到引物序列及含有的酶切位點(diǎn)見(jiàn)表I。表I引物序列和所含有的酶切位點(diǎn)
權(quán)利要求
1.一種新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遺傳系統(tǒng)，其特征在于，該反向遺傳系統(tǒng)是對(duì)狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遺傳系統(tǒng)中G蛋白第194位和第333位氨基酸位點(diǎn)實(shí)施了定點(diǎn)突變，使G蛋白第194位氨基酸由原來(lái)的天冬酰胺突變?yōu)榻z氨酸，第333位氨基酸由原來(lái)的谷氨酰胺突變?yōu)楣劝彼帷?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遺傳系統(tǒng)，其特征在于，含有一個(gè)、兩個(gè)或/和三個(gè)突變后G蛋白基因的全長(zhǎng)感染性克隆。
3.權(quán)利要求I或2所述的新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遺傳系統(tǒng)在拯救狂犬病病毒疫苗株中的應(yīng)用。
4.一種新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遺傳系統(tǒng)的構(gòu)建方法，包括以下步驟 步驟一應(yīng)用基因定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遺傳系統(tǒng)中的G蛋白基因進(jìn)行突變，使G蛋白第194位氨基酸由原來(lái)的天冬酰胺突變?yōu)榻z氨酸，第333位氨基酸由原來(lái)的谷氨酰胺突變?yōu)楣劝彼?，具體方法是將要突變的G蛋白基因擴(kuò)增后克隆到pGEM-T載體，利用以下引物m-Fl :5’ -TGTGATATTTTCACCMSAGCAGAGGGAAGAGA-3，m-Rl :5’ -TCTCTTCCCTCTGCTGCTGGTGAAAATATCACA-3’m-F2 :5， -TCACTACAAATCGGTCGAAACTTGGGATGAGAT-3，m-R2 :5’ - ATCTCATCCCAAGTTTCGACCGATTTGTAGTGA -3’ 對(duì)G蛋白基因中194位和333位的氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變，將突變后的G蛋白基因命名為GAS基因，將得到的突變后的重組質(zhì)粒命名為pGEM-GAS ； 步驟二 利用以下引物分別擴(kuò)增GAS基因G-Fl5，-GAATTCTAGAACATGTCAACTATGG-3，與 G-R3 ^y-GCTAGCTTTTTTTGGACTTGAAATATGAAGG-3，；G-F4 :5’ -GCGCGCCTTTTAACATCCCTCAAAAGAC -3’ 與 G-R35’ - GCTAGCTTTTTTTGGACTTGAAATATGAAGG-3，；G-F2 :5’-GCGATCGCCTTTTAACATCCCTCAAAAGAC-3，G-R25，-GGCGCGCCTTTTTTTGGACTTGAAATATGAAGG-3，；G-F3 :5，-GGCGCGCCCTTTTAACATCCCTCAAAAGAC -3，與 G-R3 :5，- GCTAGCTTTTTTTGGACTTGAAATATGAAGG-3，； 將PCR產(chǎn)物切膠回收后與pGEM-T載體進(jìn)行連接，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pGEM-GASpPGEM-GAS2、PGEM-GAS3、pGEM_GAS4； 步驟三:人工合成含有BssH II、AsiS I、Asc I、Asc I酶切位點(diǎn)的linker并與pMD18_T載體連接，得到中間載體pMD-MCS ； 步驟四利用內(nèi)切酶BsiW I、Nhe I分別對(duì)pCTN-GFP和PGEM-GAS1進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物切膠回收后進(jìn)行連接構(gòu)建成重組質(zhì)粒PCTN-GAS。
步驟五利用內(nèi)切酶BsiW I ,BssH II分別對(duì)pCTN-GFP和pGEM-GAS進(jìn)行雙酶切后連接構(gòu)建 pCTN-GAS-GFP ;隨后，利用內(nèi)切酶 BssH II、Nhe I 分別對(duì) pCTN_GAS_GFP 和 pGEM_GAS2進(jìn)行雙酶切后連接構(gòu)建成重組質(zhì)粒pCTN-GASGAS。
步驟六利用內(nèi)切酶Asc I、Nhe I分別對(duì)pMD-MCS和pGEM_GAS4進(jìn)行雙酶切后連接構(gòu)建重組質(zhì)粒PMD-GAS4 ;隨后，利用內(nèi)切酶AsiS I、Asc I雙酶切pMD_GAS4和pGEM_GAS3后連接構(gòu)建PMd-GAS3GAS4 ;將PMd-GAS3GAS4利用內(nèi)切酶Asc I單酶切后切膠回收，再利用SI核酸酶處理去掉突出的堿基，經(jīng)T4 DNA連接酶連接以去除Asc I酶切位點(diǎn)，處理 后的PMd-GAS3GAS4與pCTN-GAS-GFP經(jīng)BssH II、Nhe I雙酶切后連接構(gòu)建成重組質(zhì)粒pCTN-GASGASGASo
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新型狂犬病病毒疫苗CTN181株反向遺傳系統(tǒng)，首先采用基因定點(diǎn)突變技術(shù)分別對(duì)狂犬病病毒CTN 株G蛋白194位和333位氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，將突變后的G蛋白基因替換原有反向遺傳系統(tǒng)中的G蛋白基因，同時(shí)對(duì)突變后的G蛋白基因進(jìn)行拷貝，構(gòu)建含有兩個(gè)和三個(gè)改造后G蛋白基因的全長(zhǎng)感染性克隆，并將其分別與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BSR細(xì)胞，拯救出了分別含有一個(gè)、兩個(gè)和三個(gè)突變后G 蛋白基因的重組狂犬病病毒，為研制安全、穩(wěn)定、高效的新型狂犬病病毒疫苗奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/47GK102796753SQ20121031020
公開(kāi)日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年8月28日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月17日
發(fā)明者解庭波, 明平剛, 唐芳, 黃思佳, 徐葛林, 嚴(yán)家新 申請(qǐng)人:武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司