專利名稱：一種抗p21Ras蛋白的單鏈抗體KGH-R1-ScFv及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種抗p21Ras蛋白的單鏈抗體KGH-RI-ScFv及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤，尤其是惡性腫瘤，嚴(yán)重危害著人類的生命健康。開展惡性腫瘤的防治研究，對于預(yù)防腫瘤的發(fā)生、降低腫瘤發(fā)生率、減少死亡率、指導(dǎo)臨床治療等，都具有十分重要的現(xiàn)實意義。Ras基因是一種重要的原癌基因，參與多種腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。其表達產(chǎn)物Ras蛋白作為重要的分子開關(guān)，參與細胞的增生、生長、分化、凋亡。研究表明，ras基因突變和(或)Ras蛋白過表達與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展關(guān)系非常密切，在多種腫瘤的病變過程中起著非常重 要的作用。因此，人們對Ras基因、Ras蛋白及其參與的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進行了較為深入的研究。Ras基因是最早發(fā)現(xiàn)的原癌基因之一,最早發(fā)現(xiàn)于Harvery鼠肉瘤病毒和Kirsten鼠肉瘤病毒。Ras基因在進化中相對保守，廣泛存在于各種真核生物中。哺乳動物的Ras基因家族有三個成員，即H-ras, K-ras, N_ras,在人染色體中，它們分別定位于llpl4. I,12pl2. 1/I2q24. 2，lpl3. 2染色體上。Ras基因具有相似的結(jié)構(gòu)，均由四個外顯子組成，分布于全長約30kb的DNA上，編碼由188-189個氨基酸組成的分子量為21KD的蛋白質(zhì)，故稱為p21Ras 蛋白。p21Ras蛋白為膜結(jié)合型的GTP/⑶P結(jié)合蛋白，定位于細胞膜內(nèi)側(cè)。p21Ras蛋白有較弱的GTP酶活性，與GTP和⑶P有很強的親和性。正常情況下，p21Ras與⑶P結(jié)合并沒有活性。當(dāng)細胞外的生長分化因子把信號傳導(dǎo)到胞膜內(nèi)側(cè)的p21Ras蛋白時，可增強p21Ras蛋白與GTP的結(jié)合活性，使p21Ras蛋白成為激活狀態(tài)，信號系統(tǒng)開放。因為GTP酶活性的存在，p21Ras蛋白可使GTP水解成⑶P，p21Ras蛋白成為失活狀態(tài)，信號系統(tǒng)關(guān)閉。p21Ras蛋白和GDP結(jié)合后，可以激活鳥苷酸釋放蛋白(GNRP)，GNRP使p21Ras蛋白釋放GDP而結(jié)合GTP。因此，通過GTP和⑶P的相互轉(zhuǎn)換可以有節(jié)制地調(diào)節(jié)p21Ras蛋白對信號系統(tǒng)的開啟和關(guān)閉，完成對細胞因子信號傳導(dǎo)過程的調(diào)節(jié)。Ras原癌基因被激活后成為有致癌活性的癌基因。Ras基因激活的方式有3種基因點突變、基因大量表達、基因插入和轉(zhuǎn)位。Ras基因被激活后，其表達產(chǎn)物Ras蛋白的構(gòu)型也發(fā)生改變，與GDP的結(jié)合能力減弱，與GTP結(jié)合后不需外界生長信號的刺激即可活化；同時Ras蛋白內(nèi)在的GTP酶活性降低，導(dǎo)致Ras蛋白與GTP/GDP結(jié)合、調(diào)節(jié)的異常，活化狀態(tài)的Ras蛋白持續(xù)地激活下游信號通路，導(dǎo)致細胞不可控制地增殖、惡變，同時細胞凋亡減少。隨著分子生物學(xué)技術(shù)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，腫瘤形成的生物學(xué)過程得到進一步闡明，腫瘤治療的新的生物治療模式被逐漸應(yīng)用于臨床并顯示了良好的療效。腫瘤生物治療又分為腫瘤免疫治療和腫瘤基因治療?；蛑委熓侵笇⑼庠椿?qū)氚屑毎约m正或補償因基因缺陷、異常引起的疾病，達到治療目的。隨著細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和抗體工程技術(shù)的發(fā)展，還誕生了細胞內(nèi)抗體技術(shù)。細胞內(nèi)抗體是指在細胞內(nèi)表達并被定位于亞細胞區(qū)室(如胞核、胞漿或某些細胞器)，與特定的靶分子作用(干擾或阻斷靶分子的加工、分泌或功能)從而發(fā)揮其生物學(xué)功能的一類新的工程抗體。用于腫瘤生物治療的完整抗體由于分子量較大，其血管通透性弱、擴散入腫瘤內(nèi)能力差、半衰期長、免疫原性強，而限制了其靶向傳遞及腫瘤拮抗應(yīng)用效果。細胞內(nèi)抗體細胞內(nèi)表達的特點提供了一種有效的拮抗p21Ras蛋白這類定位于細胞膜內(nèi)側(cè)的蛋白的方法。制備出一種細胞內(nèi)抗體，能夠在腫瘤細胞內(nèi)表達抗p21Ras蛋白產(chǎn)物，阻斷腫瘤細胞中p21Ras蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，限制腫瘤的生長和擴散，有望達到治療Ras蛋白引起的各類腫瘤的目的。

發(fā)明內(nèi)容
·
本發(fā)明提供了一種抗p21Ras蛋白的單鏈抗體編碼基因序列，以及該序列的應(yīng)用。本發(fā)明的一種抗p21Ras蛋白的單鏈抗體KGH-Rl-ScFv,其特征在于該抗體編碼基因序列如SEQ ID NOl所示。SEQ ID NOl
>KGH-Rl-ScFv (DNA)
GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGAAGCTGCAGGAGTCTGGGGAAGGCTTAGTGAAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTGACTATTACATGTATTGGGTTCGCCAGACTCCGGAAAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCAATCATTAGTGATGGTGGTAGTTACACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGGCGATTCACCATCTCCAGAGACAATACCAAGAAAAACCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAGGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGAGATCCCCATTACTCCGGTAGTAGCCGCCTGTTTGTTAACTGGGGCCAAGGCACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGGACATCGAGCTCACTCAGTCTCCAGCTTCCTTAGCTGTATCTCTGGGGCAGAGGGCCACCATCTCATACAGGGCCAGCAAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGAACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAGACTCCTCATCTATCTTGTATCCAACCTAGAATCTGGGGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATCCATCCTGTGGAGGAGGAGGATGCTGCAACCTATTACTGTCAGCACATTAGAGAGCTTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGCAAATCAAACGGGCGGCCGCAGGTGCGCCGGTGCCGTATCCGGATCCGCTGGAACCGCGTGCCGCATAG>KGH-Rl-ScFv (Amino acid)
AAQPAMAQVKLQESGEGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSDYYMYWVRQTPEKRLEWVAIISDGGSYTYYPDSVK
GRFTISRDNTKKNLYLQMSSLRSEDTAMYYCARDPHYSGSSRLFVNWGQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELT
QSPASLAVSLGQRATISYRASKSVSTSGYSYMHWNQQKPGQPPRLLIYLVSNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPV
EEEDAATYYCQHIRELTRSEGGPSWQIKRAAAGAPVPYPDPLEPRAA-
所述的單鏈抗體基因被插入PMD19-T (D102A,從Takara公司獲得)載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5a，獲得的大腸桿菌 DH5a KGH-Rl-ScFv (Escherichia coli DH5 aKGH-Rl-ScFv)，于2011年9月18日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址為中國武漢武漢大學(xué))，保藏號 CCTCC NO M2011322o所述的單鏈抗體基因插入人腺病毒Ad5并轉(zhuǎn)染HEK293細胞后獲得重組人腺病毒載體八(1-1^6 -50 于2012年5月3日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址為中國武漢武漢大學(xué))，保藏號CCTCC N0:V201219。為了實現(xiàn)發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案
I、單鏈抗體編碼基因輕、重鏈可變區(qū)的擴增
以抗p21Ras蛋白的雜交瘤細胞株KGH-Rl (于2011年9月23日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址為中國武漢武漢大學(xué)，保藏號CCTCC NO :C201197)的cDNA為模板，使用小鼠特異的抗體基因擴增引物分別擴增抗體編碼基因的輕、重鏈可變區(qū)，并通過重疊延伸PCR使用柔性寡核苷酸將擴增的輕、重鏈可變區(qū)片段連接成完整的單鏈抗體編碼基因。2、重組噬菌體質(zhì)粒文庫的構(gòu)建
通過PCR的方法對擴增得到的單鏈抗體編碼基因引入酶切位點，再通過酶切酶連的方式將單鏈抗體編碼基因連接入帶有同樣酶切位點的噬菌體載體P CANTAB-5E (從 Pharmacia公司獲得)，從而構(gòu)建得到重組曬菌體質(zhì)粒文庫。3、噬菌體單鏈抗體展示文庫的構(gòu)建
將重組噬菌體質(zhì)粒文庫轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl (從Lucigen公司獲得)，得到單鏈抗體初始文庫。加入輔助噬菌體M13K07 (27-1524，從GE healthcare公司獲得)，收集培養(yǎng)液上清，得到噬菌體單鏈抗體展示文庫。4、陽性噬菌體的分離
通過間接ELISA的方法，以p21Ras蛋白為抗原包被細胞培養(yǎng)板，以噬菌體單鏈抗體展示文庫為抗體對包被細胞培養(yǎng)板的抗原進行結(jié)合。加入大腸桿菌TGl對與抗原結(jié)合的噬菌體進行釋放，加入輔助噬菌體M13K07，培養(yǎng)后分離上清，得到富集篩選的陽性噬菌體。重復(fù)富集篩選過程2遍，得到陽性噬菌體。陽性噬菌體重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl后，對所提取質(zhì)粒進行測序，得到插入片段序列，即單鏈抗體KGH-Rl-ScFv編碼基因序列。5、單鏈抗體的可溶性表達
轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl的陽性克隆經(jīng)IPTG (從Sigma公司獲得)誘導(dǎo)后，加入溶菌酶對菌體進行裂解，所得上清即為可溶性表達的單鏈抗體。6、單鏈抗體抗原結(jié)合特性的檢測
收集19株不同的腫瘤細胞株，分別是人胃癌細胞株BGC-853、MKN28，人肝癌細胞株QGY-7703、SMMC-7721、H印G2，人乳腺癌細胞株 MDA-MB-231、MDA-MB-435、MCT-7，人白血病細胞株 THP-I、K562、MT4 CD4+、Daud I、C8166 CD4+、HL60，人宮頸癌細胞株 He La，人喉鱗癌細胞株H印-2，人卵巢癌細胞株SK0V3，人結(jié)直腸癌細胞株HCTl 16，人膀胱癌細胞株T-24(19株細胞株均來自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫)，按常規(guī)免疫組化程序進行制片，以可溶性表達的單鏈抗體為一抗,HRP/Anti-E-tag (ab3415_250,從GE healthcare公司獲得)為二抗，鑒定單鏈抗體的抗原結(jié)合特性。7、重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建
通過PCR的方法對鑒定的單鏈抗體編碼基因引入酶切位點，再通過酶切酶連的方式將鑒定的單鏈抗體編碼基因連接入帶有同樣酶切位點的穿梭質(zhì)粒pShuttle-IRES-hrGFP-1(從Stratagene公司獲得)。重組穿梭質(zhì)粒經(jīng)Pme I (從Takara公司獲得)酶切線性化、去磷酸化處理后，電轉(zhuǎn)化BJ5183-AD-1 (從Stratagene公司獲得)細胞。線性的重組穿梭質(zhì)粒與BJ5183-AD-1細胞內(nèi)已經(jīng)存在的骨架質(zhì)粒pAdEasy-l( D102A，從Takara公司獲得)發(fā)生同源重組,產(chǎn)生重組腺病毒質(zhì)粒。
8、重組腺病毒的制備
對重組腺病毒質(zhì)粒進行Pac I酶切，回收酶切產(chǎn)生的約30 Kb大小的酶切片段。將回收的酶切片段混合轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000，轉(zhuǎn)染HEK293細胞(來自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫)。轉(zhuǎn)染成功后J1EK293細胞中將包裝出成熟腺病毒，從而獲得重組人腺病毒載體Ad-hrGFP-ScFv。9、細胞內(nèi)抗體的定位
重組腺病毒感染人乳腺癌細胞MDA-MB-231 (來自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫)細胞后，在細胞內(nèi)產(chǎn)生單鏈抗體。通過融合在單鏈抗體末端的FLAG標(biāo)簽檢測其在細胞內(nèi)的定位。10、體外抑瘤試驗·
用重組腺病毒感染高表達p21Ras蛋白的人乳腺癌細胞MDA-MB-231、人肝癌細胞BEL-7402、人結(jié)腸癌細胞SW480、人卵巢癌細胞0VCAR3，以及低表達p21Ras蛋白的人卵巢癌細胞SK0V3 (以上均來自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫)(I)加入MTT對細胞進行培養(yǎng)，通過測定0D490光吸收值，繪制細胞活力曲線，分析細胞內(nèi)抗體對腫瘤細胞活力的影響；(2)將腫瘤細胞制備成單細胞懸液，以一定的細胞密度接種后，在含20%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)2-3周。吉姆薩染液染色后，倒置顯微鏡下計數(shù)細胞克隆數(shù)，分析細胞內(nèi)抗體對腫瘤細胞增殖能力的影響；(3)將感染的腫瘤細胞以一定的細胞密度接種于基質(zhì)膠Matrigel包被的Transwell微孔膜上表面,培養(yǎng)48 h后,用棉簽擦去微孔膜上表面細胞，使用95%乙醇固定微孔膜下表面細胞。蘇木素染色后，倒置顯微鏡下計數(shù)微孔膜下表面細胞數(shù)目，分析細胞內(nèi)抗體對腫瘤細胞侵襲能力的影響；(4)加入預(yù)冷的75%乙醇，4°C固定細胞過夜。加入PI染液對細胞進行染色，使用流式細胞儀收集細胞PI熒光信號，分析細胞內(nèi)抗體對腫瘤細胞周期分布的影響。11、體內(nèi)抑瘤試驗
將腫瘤細胞BEL-7402、SW480、SK0V3 (來自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫)注射接種SPF級4周齡雌性Balb/c裸鼠，裸鼠成瘤后進行瘤內(nèi)多點腺病毒注射。每3天注射I次，共注射7次。注射后對裸鼠進行觀察，每隔一天稱量裸鼠體重，并測量裸鼠瘤體長、短徑,計算瘤體體積,繪制腫瘤生長曲線。分析細胞內(nèi)抗體對腫瘤生長的抑制作用。


圖I為PCR擴增抗體編碼基因的輕、重鏈可變區(qū)；
M :Marker，條帶大小依次為 600 bp, 500 bp, 400 bp, 300 bp, 200 bp, 100 bp ; 1-2 :重鏈可變區(qū)；3-4 :輕鏈可變區(qū)。圖2為輕、重鏈可變區(qū)連接而成的單鏈抗體基因電泳，M :DL2000。圖3為ELISA篩選表達抗p21Ras蛋白單鏈抗體的重組噬菌體克??；
H-ras、K-ras、N-ras蛋白分別作為抗原包被酶標(biāo)板,每孔包被0. 5 U go I :200稀釋的曬菌體上清(100 U I)作為一抗，I 2000 稀釋的 HRP/Anti_M13 Monoclonal Ccojugate(100 u I)作為二抗，100 u I TMB顯色。陽性對照使用I :2000稀釋的抗p21Ras蛋白單克隆抗體上清(100 u I)為一抗，羊抗鼠IgG (1:2000稀釋，100 u I)為二抗；空白對照使用PBS溶液；陰性對照使用輔助噬菌體Ml3K07上清。酶標(biāo)儀內(nèi)讀取每孔0D450值。
圖4為細胞內(nèi)抗體對腫瘤細胞活力的影響圖。圖5為細胞內(nèi)抗體對腫瘤細胞增殖能力的影響圖。圖6為細胞內(nèi)抗體對腫瘤細胞侵襲能力的影響圖。圖7為細胞內(nèi)抗體對腫瘤細胞周期分布的影響圖。
具體實施例方式實施例I :一種抗p21Ras蛋白的單鏈抗體KGH-Rl-ScFv及其應(yīng)用，其獲得的技術(shù)方案如下
1、抗p21Ras雜交瘤細胞株總RNA提取及cDNA合成· 1.1總RNA提取·
收集培養(yǎng)至對數(shù)生長期的雜交瘤細胞(于2011年9月23日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號CCTCC NO :C201197)，使用Trizol (從Mrcgene公司獲得)，按照試劑使用說明，提取雜交瘤細胞總RNA。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性。NanoDrop 2000(從Thermo公司獲得)分光光度計測定總RNA濃度。I. 2 cDNA 合成
使用 RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (從 Fermentas 公司獲得)，按照試劑盒使用說明，對I. I中所提取總RNA進行反轉(zhuǎn)錄。2、雜交瘤細胞抗體編碼基因輕、重鏈可變區(qū)擴增
2.I抗體編碼基因輕鏈可變區(qū)擴增
使用小鼠來源特異的Light Primer Mix (27-1583-01，從GE healthcare公司獲得)，以I. 2中合成的cDNA為模板，PCR擴增抗體編碼基因輕鏈可變區(qū)，操作參照試劑使用說明。所得產(chǎn)物進行I. 5%瓊脂糖凝膠電泳，檢測電泳條帶大小。2. 2抗體編碼基因重鏈可變區(qū)擴增
同 2. I，使用 Heavy Primers I, 2 (27-1586-01，從 GE healthcare 公司獲得)，PCR擴增抗體編碼基因重鏈可變區(qū)。2. 3輕、重鏈可變區(qū)連接構(gòu)建ScFv基因片段
使用DNA純化回收試劑盒(DP214-02，從Tiangen公司獲得)，按照試劑盒使用說明，對2. I和2. 2中PCR產(chǎn)物進行純化回收。利用重疊延伸PCR原理，使用Linker-Primer Mix(27-1588-01,從GE healthcare公司獲得)，按照試劑使用說明，將回收純化的輕、重鏈可變區(qū)基因片段連接成ScFv基因，結(jié)構(gòu)為V11-Linker-Vp3、重組噬菌體單鏈抗體展示文庫構(gòu)建 3.1 ScFv基因酶切位點引入
使用RS Primer Mix (27-1589-01，從GE healthcare公司獲得)，按照試劑使用說明，對2. 3中所得ScFv基因進行PCR擴增，引入酶切位點。5’端酶切位點為Sfi I，3’端酶切位點為Not I。3. 2 ScFv基因連接噬菌體表達載體pCANTAB-5E
Sfi I和Not I (從Fermentas公司獲得)順序酶切3. I中所得ScFv基因和噬菌體表達載體PCANTAB-5E (從Pharmacia公司獲得)。酶切產(chǎn)物進行I. 0%瓊脂糖凝膠電泳，檢測酶切效果，并切膠純化回收(DP214-02，從Tiangen公司獲得)酶切后的ScFv基因片段和表達載體PCANTAB-5E。按照基因片段比載體3 :1的比例，使用T4 DNA Ligase (從Fermentas公司獲得)連接酶切后的載體和ScFv基因片段。3. 3單鏈抗體初始文庫構(gòu)建
將3. 2中所得重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌TGl (從Lucigen公司獲得)，轉(zhuǎn)化條件參照E. coli Competent Cells DH5 a (D9057A,從Takara公司獲得)使用說明書，培養(yǎng)控制溫度為 30°C，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布 SOB 平板(S0B-AG，含 100 u g/ml Ampicillin 和 2% Glucose)。30°〇培養(yǎng)過夜后，收集平板上菌落于2\￥1'培養(yǎng)液(2\￥1'^6，含100 U g/ml Ampicillin和2% Glucose) 0加入甘油至終濃度為25%，分裝保存于-80°C。所得即為單鏈抗體初始文庫。3. 4重組噬菌體單鏈抗體展示文庫構(gòu)建
取3. 3中所得初始文庫，于2XYT-AG培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。參照試劑使用說 明，加入適量輔助噬菌體M13K07 (27-1524，從GE healthcare公司獲得)，30°C共培養(yǎng)Ih0 離心后重懸沉淀于 2X YT 培養(yǎng)液(2X YT-AK，含 100 u g/ml Ampicillin 和 50 u g/mlKanamycin)，30°C培養(yǎng)過夜。離心后收集上清，加入1/5體積的PEG8000 (從Meker公司獲得)。離心后用適量PBS重懸沉淀，加入甘油至終濃度為25%，分裝保存于-80°C。所得即為曬菌體單鏈抗體展示文庫。4、陽性噬菌體的富集篩選
以下部分詳細步驟參考 Recombinant Phage Antibody System (RPAS,從 GEHealthcare公司獲得)說明書。4. I陽性噬菌體富集
將3. 4中所得PBS重懸的噬菌體單鏈抗體庫加入到10 u g/ml p21Ras蛋白包被的細胞瓶中，37 °C培養(yǎng)2 h。使用PBS溶液(PBS-T，含0.05% Tween-20)洗瓶3次，再繼續(xù)用PBS溶液洗瓶3次。所得即為富集的陽性噬菌體。4. 2噬菌體釋放
于4. I富集陽性噬菌體的細胞瓶中加入適量處于對數(shù)生長期的大腸桿菌TG1，30°C培養(yǎng)I h。離心后重懸沉淀于2XYT-AG培養(yǎng)液，鋪2XYT-AG平板。30°C培養(yǎng)過夜后，收集平板上菌落于2XYT-AG培養(yǎng)液，培養(yǎng)至對數(shù)生長期。加入適量輔助噬菌體M13K07，30°C共培養(yǎng)I h。離心后重懸沉淀于2XYT-AK培養(yǎng)液，30°C培養(yǎng)過夜。離心后收集上清，加入1/5體積的PEG8000。離心后用適量PBS重懸沉淀，再次離心，上清過0. 45 Um孔徑濾膜后，加入甘油至終濃度為25%，保存于-80°C。此即為經(jīng)過第一輪富集篩選的陽性噬菌體。4. 3純化富集
重復(fù)上述富集篩選過程4. I和4. 2，2遍，所得噬菌體用于進一步分析。4.4單克隆分離
于4.3所得噬菌體中加入對數(shù)生長期的大腸桿菌161，301培養(yǎng)1 h。離心后重懸沉淀于2X YT-AG培養(yǎng)液，鋪2X YT-AG平板。30°C培養(yǎng)過夜后，將平板上分離良好的單克隆挑入每孔含400 u I 2 X YT-AG培養(yǎng)液的48孔板內(nèi)。每孔取40 U I加入到一塊新的48孔培養(yǎng)板內(nèi)，加入輔助噬菌體M13K07 (5X IO10 pfu/ml) 400 u I0 30°C培養(yǎng)2 h，至液體變渾濁。將平板離心，小心吸除上清。每孔加入400 u I 2 X YT-AK培養(yǎng)液，30°C培養(yǎng)過夜。將平板離心，所得上清即為單克隆噬菌體液。
5、陽性單克隆噬菌體鑒定
5.I間接ELISA法鑒定陽性重組克隆
將4. 4中所得噬菌體上清加入到每孔0. 5 u g p21Ras蛋白包被的96孔酶標(biāo)板中。37°C反應(yīng) I h 后，PBS-T 溶液洗板 3 次。加入二抗 HRP/Anti_M13 Monoclonal Ccojugate(27-9421-01,從 GE healthcare 公司獲得)100 u I (I :2000 稀釋)，37°C反應(yīng) 0. 5 h。PBS-T溶液洗板3次，再蒸餾水洗板2次。加入100 Ul TMB，于暗處顯色。明顯著色孔即為陽性單克隆噬菌體。5. 2菌液PCR法鑒定陽性重組克隆
以5. I所鑒定陽性噬菌體上清為模板，以pCANTAB-5E載體外源插入片段上下游S1、S6引物為鑒定引物，對噬菌體載體外源插入片段進行PCR擴增，鑒定插入片段大小。PCR產(chǎn)物進行I. 0%瓊脂糖凝膠電泳。其中，SI引物序列為5’ -CAACGTCAAAAAATTATTAT TCGC-3’，S6序列為5’-GTAAATGAATITTCTGTATGAGG-3’。 5. 3外源插入片段測序
使用DNA純化回收試劑盒，按照試劑盒使用說明，對5. 2中PCR產(chǎn)物進行純化回收。回收產(chǎn)物連接PMD19-T載體(D102A，從Takara公司獲得)，篩選的陽性克隆送華大基因公司(BGI)測序，相關(guān)操作按照試劑使用說明。所得測序序列去除載體序列后即為目的單鏈抗體KGH-Rl-ScFv的編碼基因序列。用測序克隆轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，獲得的DH5 aKGH-Rl-ScFv，于2011年9月22日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號CCTCC NO:M2011322。6、單鏈抗體的可溶性表達及鑒定
6.I單鏈抗體的可溶性表達
經(jīng)5. I鑒定陽性噬菌體后，于4. 4中吸取對應(yīng)的單克隆培養(yǎng)液進行擴大培養(yǎng)。30°C培養(yǎng)至0D600=0. 8，離心。小心去除上清，加入新鮮配制的2 X YT培養(yǎng)液(2XYT-AI，含100 u g/ml Ampicillin和ImM IPTG)，誘導(dǎo)可溶性的單鏈抗體表達，30°C培養(yǎng)過夜。離心后去上清，用PBS懸浮菌體沉淀，加入溶菌酶(從Sigma公司獲得)使其終濃度為IU/ yl。消化10min后離心，所得上清即為可溶性表達的單鏈抗體。6. 2單鏈抗體相對分子量鑒定
對6. I所得到的可溶性表達的單鏈抗體進行SDS-PAGE，鑒定單鏈抗體的相對分子量。將6. I所得上清上樣于I X SDS溶液,25mA電泳。室溫下,置于搖床上,異丙醇固定15 min,考馬斯亮藍染色2 h，10%乙酸脫色過夜。顯色完后對照蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)(Marker)分析單鏈抗體相對分子量大小。6. 3單鏈抗體的抗原結(jié)合特性
收集對數(shù)生長期的腫瘤細胞株，共19株，包括人胃癌細胞株BGC-853、MKN28，人肝癌細胞株 QGY-7703、SMMC-7721、H印G2，人乳腺癌細胞株 MDA-MB-231、MDA-MB-435、MCT-7，人白血病細胞株 THP-I、K562、MT4 CD4+、Daud I、C8166 CD4+、HL60，人宮頸癌細胞株 HeLa，人喉鱗癌細胞株H印-2，人卵巢癌細胞株SK0V3，人結(jié)直腸癌細胞株HCTl 16，人膀胱癌細胞株T-24 (分別購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會上海細胞庫/昆明細胞庫，或云南省天然藥物重點實驗室)。收集上述細胞株于離心管內(nèi)，離心后去除上清，用生理鹽水洗滌細胞沉淀。再次離心，用95%乙醇重懸細胞。再次離心去除上清后，重新加入95%乙醇，固定細胞3 ho小心取出腫瘤細胞塊，按常規(guī)石蠟切片程序進行脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟、水化、及抗原高壓修復(fù)。對制備好的腫瘤細胞切片進行免疫細胞化學(xué)檢測，以6. I所得到的可溶性表達的單鏈抗體為一抗，HRP/Anti-E-tag (ab3415_250，從 GE healthcare 公司獲得)為二抗，鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)對底物作用顯色，鑒定單鏈抗體的抗原結(jié)合特性。結(jié)果顯示，可溶性表達的單鏈抗體與除白血病細胞株以外的其他腫瘤細胞株呈不同程度的免疫陽性，說明制備的單鏈抗體具有廣譜的腫瘤細胞株的免疫能力。7、重組腺病毒的構(gòu)建
7.I重組穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建
以5. 3所鑒定的連接有單鏈抗體編碼基因的p MD 19 - T載體質(zhì)粒為模板，用末端分別帶有 Bgl II 和 Xho I 酶切位點的 if 反引物(5’ -GAAGATCT TCATGGCCCAGGTGAA-3’ 和·5’ -CCCTCGAG GGCGGCGGGCAAACTAA-3’)進行 PCR 擴增。擴增得到的 PCR 產(chǎn)物進行 I. 5% 瓊脂糖凝膠電泳，使用DNA純化回收試劑盒回收純化750 bp大小長度的目的條帶。使用BglII和Xho I限制性內(nèi)切酶分別雙酶切回收的PCR產(chǎn)物和穿梭質(zhì)粒pShuttle-IRES-hrGFP-1(從Stratagene公司獲得)，I. 0%瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切是否完全，切膠純化回收經(jīng)雙酶切的PCR產(chǎn)物和穿梭質(zhì)粒。使用T4 DNA Ligase連接回收后的PCR產(chǎn)物和穿梭質(zhì)粒，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物鋪LB-卡那霉素平板，37°C培養(yǎng)過夜。挑取分散良好的轉(zhuǎn)化菌落，用穿梭質(zhì)粒的載體引物pShuttle-F (5’ -CTCACGGGGATTTCCAAGTC-3’)和 pShuttle-R (5，-ATGCAGTCGTCGAGGAAITG-3’)對菌落進行 PCR鑒定。使用 TIANpr印 Mini質(zhì)粒提取試劑盒(DP103-02，從Tiangen公司獲得)對經(jīng)PCR鑒定陽性的菌落提取質(zhì)粒，使用Bgl II和Xho I對提取的質(zhì)粒做進一步的酶切鑒定。對酶切鑒定陽性的質(zhì)粒進行測序，以保證插入片段的序列完整性。7.2重組腺病毒質(zhì)粒的構(gòu)建
將7. I鑒定的重組穿梭質(zhì)粒進行Pme I酶切，使其線性化。線性化的重組穿梭質(zhì)?；厥占兓?，對其進行CIAP (從Fermentas公司獲得)處理，使其去磷酸化。將去磷酸化處理的線性重組穿梭質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化BJ5183-AD-1 (從Stratagene公司獲得)感受態(tài)細胞,轉(zhuǎn)化菌液涂布LB-卡那霉素平板，37°C培養(yǎng)過夜。線性的重組穿梭質(zhì)粒與BJ5183-AD-1細胞內(nèi)存在的骨架質(zhì)粒pAdEasy-1發(fā)生同源重組，產(chǎn)生重組腺病毒質(zhì)粒使用Pac I對重組腺病毒質(zhì)粒進行酶切，酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定酶切產(chǎn)生的片段大小。線性重組穿梭質(zhì)粒與骨架質(zhì)粒PAdEasy-I同源重組后，能夠產(chǎn)生約30 kb大小的Pac I酶切片段。7. 3重組腺病毒制備
參照試劑使用說明，混合7. 2過程中制備的Pac I酶切產(chǎn)生的約30 kb大小的片段于Lipofectamine 2000 (從Invitrogen公司獲得)中，將轉(zhuǎn)染試劑同HEK293細胞(來自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫)共同孵育。轉(zhuǎn)染后24 h，倒置熒光顯微鏡下對轉(zhuǎn)染的細胞進行觀察，如可見明顯綠色熒光，則說明轉(zhuǎn)染成功。在HEK293細胞中包裝出成熟腺病毒。獲得的重組人腺病毒載體Ad-hrGFP-ScFv，于2012年6月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號CCTCC N0:V201219。7.4腺病毒純化
轉(zhuǎn)染后10-14天，絕大部分HEK293細胞出現(xiàn)腫脹、變圓、脫落、聚集成團的細胞病變效應(yīng)時，收集細胞。將細胞懸液進行離心，PBS溶液洗滌、懸浮細胞。將細胞于-80°C甲醇/37°C水浴中反復(fù)凍融，4次，每次凍、融各約5 min。離心后收集上清，分裝保存于_80°C。所得即為腺病毒原液。腺病毒原液經(jīng)氯化銫密度梯度離心進一步純化。該法所得腺病毒滿足進一步實驗的要求。8、細胞內(nèi)抗體的定位
將7. 4所制備的腺病毒按感染復(fù)數(shù)MOI=IOO感染人乳腺癌細胞MDA-MB-231 (中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫)，重組腺病毒感染細胞后，其質(zhì)粒攜帶的基因在細胞內(nèi)表達，能夠通過綠色熒光信號檢測到細胞內(nèi)腺病毒的存在，通過融合在單鏈抗體末端的FLAG標(biāo)簽的檢測知道插入的外源單鏈抗體編碼基因的表達及其在細胞內(nèi)的定位。通過細胞爬片的方法使對數(shù)生長期的MDA-MB-231細胞固定在載玻片上，腺病毒感染細胞36h后，對載玻片上的細胞進行免疫反應(yīng)，加入一抗Anti-FLAG (R) M2 Antibody (2368，從CellSignaling Technology 公司獲得)，二抗 Rhodamine-Conjugated Goat Anti-Rabbit IgG(ZF-0316, Biomarket公司獲得)，免疫反應(yīng)結(jié)束后在激光共聚焦顯微鏡FVlOOO下分別觀 察hrGFP和Rhodamine所激發(fā)熒光以及兩者的共聚焦熒光在細胞內(nèi)的定位。9、細胞內(nèi)抗體對癌細胞的抑制研究
9.I細胞活力的檢測
將7. 4所制備的腺病毒感染高表達p21Ras蛋白的人乳腺癌細胞MDA-MB-231、人肝癌細胞BEL-7402、人結(jié)腸癌細胞SW480、人卵巢癌細胞0VCAR3，以及低表達p21Ras蛋白的人卵巢癌細胞SK0V3。同時，設(shè)立空載體病毒組以及空白對照組。腺病毒感染細胞24 h、36 h、48 h、72 h、96 h后，加入MTT。培養(yǎng)4 h后，棄MTT，加入DMS0，低速振蕩10 min。測定每個樣品的0D490光吸收值，每個樣品設(shè)3個重復(fù)。以感染時間為橫軸，0D490光吸收值為縱軸，繪制細胞活力曲線，分析腫瘤細胞感染腺病毒后表達的細胞內(nèi)抗體對其活力的影響，t匕較高表達與低表達p21Ras蛋白的腫瘤細胞株對該細胞內(nèi)抗體的敏感性。9.2細胞增殖能力的檢測
實驗細胞生長良好、匯合度達到80%時，對其進行腺病毒感染，同時設(shè)立空載體病毒組對照。實驗細胞包括MDA-MB-231細胞、BEL-7402細胞、SW480細胞、0VCAR3細胞、SK0V3細胞(來自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫)。感染24h后使用胰蛋白酶消化貼壁細胞，用含20%新生牛血清(從Gibco公司獲得)的RPMI 1640 (從Hyclone公司獲得)培養(yǎng)液懸浮細胞制成單細胞懸液，以250、500、750個細胞的密度分別接種于6孔板，每個樣品設(shè)3個重復(fù)，培養(yǎng)2-3周。吉姆薩染液染色后，倒置顯微鏡BX41下計數(shù)細胞克隆(單個克隆的細胞數(shù)大于50)數(shù)目，計算克隆形成率。分析比較腫瘤細胞感染腺病毒后表達的細胞內(nèi)抗體對其增殖能力的影響?？寺⌒纬陕?%)=克隆數(shù)/接種的細胞數(shù)X 100%。9.3細胞侵襲能力的檢測
按試劑使用說明，使用基質(zhì)膠Matrigel (從BD Matrigel 公司獲得)包被細胞小室Transwell 微孔膜。同 9. 2，對 MDA-MB-231 細胞、BEL-7402 細胞、SW480 細胞、0VCAR3 細胞、SK0V3細胞(均來自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫)進行腺病毒感染。感染24 h后使用胰蛋白酶消化細胞，用含2%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液懸浮細胞制成單細胞懸液，以3X IO4個細胞的密度接種于基質(zhì)膠Matrigel包被的Transwell微孔膜上表面。在嵌套Transwell微孔膜的24孔板孔中加入含20%新生牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液，培養(yǎng)48h。用棉簽輕輕擦去微孔膜上表面細胞后，使用95%乙醇固定微孔膜下表面細胞。蘇木素染色后，倒置顯微鏡下計數(shù)微孔膜下表面細胞數(shù)目。分析比較腫瘤細胞感染腺病毒后表達的細胞內(nèi)抗體對其侵襲能力的影響。9.4細胞周期的檢測
通過流式細胞術(shù)碘化丙錠(PI，從Beckman公司獲得)染色法檢測細胞內(nèi)DNA含量，將不同細胞的細胞周期時相區(qū)分為G0/G1期，S期，G2/M期，計算各時相的百分率。同9. 2，對MDA-MB-231細胞、BEL-7402細胞、SW480細胞、0VCAR3細胞、SK0V3 (均來自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫)細胞進行腺病毒感染。感染48h后使用胰蛋白酶消化細胞，吹打成單細胞懸液。每個實驗組取I X IO6個細胞，使用預(yù)冷的PBS溶液洗滌細胞2次。加入預(yù)冷的75%乙醇，4°C固定細胞過夜。再次使用預(yù)冷的PBS溶液洗滌細胞2次。加入PI染液對細胞進行染色，30 min。使用流式細胞儀通過流式細胞術(shù)收集細胞PI熒光信號，其·中激發(fā)光波長為488 nm,發(fā)射光波長為620 nm,每個樣品收集多于10000個突光信號。使用MultiCycle DNA軟件分析細胞熒光強度、細胞周期分布，并計算細胞增殖指數(shù)。分析比較腫瘤細胞感染腺病毒后表達的細胞內(nèi)抗體對其細胞周期分布的影響。(Proliferation Index, PI)=(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M) X100%。10、細胞內(nèi)抗體對腫瘤生長的抑制研究
10.I裸鼠腫瘤模型的建立
實驗細胞BEL-7402、SW480、SK0V3生長良好、匯合度達到80%時，使用胰蛋白酶消化、收集細胞，PBS溶液洗滌細胞后將細胞密度調(diào)整成IO7個細胞/200 u 1，作為單次注射用量。將制備好的細胞注射接種于SPF級4周齡雌性Balb/c裸鼠，每種腫瘤細胞接種10只，裸鼠成瘤后用于細胞內(nèi)抗體對腫瘤生長的抑制研究。10. 2細胞內(nèi)抗體對腫瘤生長的抑制研究
裸鼠注射接種成瘤后對其進行分組,每組5只。瘤體直徑達到0. 5 cm時，對其進行瘤內(nèi)多點腺病毒注射，同時設(shè)立空載體病毒組對照。注射量為3X IO8 pfu/只，每3天注射I次，共注射7次。注射后對裸鼠進行觀察，每隔一天稱量裸鼠體重，并測量裸鼠瘤體長、短徑，計算瘤體體積，繪制腫瘤生長曲線。分析比較腫瘤注射腺病毒后表達的細胞內(nèi)抗體對其生長的抑制。瘤體體積=1/2 X長徑X短徑2。
權(quán)利要求
1.一種抗p21Ras蛋白的單鏈抗體KGH-Rl-ScFv，其特征在于該抗體編碼基因序列如SEQ ID NOl 所示。
2.如權(quán)利要求I所述的一種抗p21Ras蛋白的單鏈抗體KGH-Rl-ScFv,其特征在于所述的單鏈抗體基因被插入PMD19-T (D102A,從Takara公司獲得)載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，獲得的大腸桿菌DH5a KGH-Rl-ScFv，于2011年9月22日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號 CCTCC NO M2011322o
3.如權(quán)利要求I所述的一種抗p21Ras蛋白的單鏈抗體KGH-Rl-ScFv,其特征在于所述的單鏈抗體基因轉(zhuǎn)染HEK293細胞后獲得重組人腺病毒載體Ad-hrGFP-ScFv，于2012年6月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號CCTCC N0:V201219。
全文摘要
一種抗p21Ras蛋白的單鏈抗體KGH-R1-ScFv及其應(yīng)用，屬于醫(yī)學(xué)生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及一種攜帶單鏈抗體編碼基因KGH-R1-ScFv的重組人腺病毒載體Ad-hrGFP-ScFv。本發(fā)明的單鏈抗體能夠特異性、廣譜性識別并拮抗不同來源、不同組織、不同細胞株中的p21Ras蛋白；能夠在體外抑制高表達p21Ras蛋白的人腫瘤細胞的增殖能力和侵襲能力，降低分裂期細胞的比例，能夠在小鼠體內(nèi)抑制高表達p21Ras蛋白的人腫瘤細胞移植瘤的生長。
文檔編號C12N15/13GK102786596SQ20121032189
公開日2012年11月21日 申請日期2012年9月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月4日
發(fā)明者丁峰, 楊舉倫, 王麗, 胡奇嬋, 陳玥 申請人:楊舉倫