一種抗BLyS單鏈抗體及其制備方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及抗B淋巴細胞刺激因子(BLyS)的單鏈抗體及其制備方法和醫(yī)藥用途。
【背景技術(shù)】
[0002]B淋巴細胞刺激因子(B lymphocyte stimulator，BLyS，也被稱為BAFF)最早于1999年由Moore等多個研宄小組獨立發(fā)現(xiàn)的一種全新的、具有重要免疫調(diào)節(jié)功能的細胞因子。BLyS屬于腫瘤壞死因子(tumour necrosis factor，TNF)超家族成員，是一個典型的II型跨膜單鏈糖蛋白。
[0003]BLyS由285個氨基酸組成，分子量大小約為31.3kDa，其胞外區(qū)134-285位氨基酸可在弗林蛋白酶的作用下發(fā)生水解，形成可溶性的功能片段。雖然BLyS能以膜結(jié)合的形式存在，但BLyS主要以可溶的同源三聚體形式與其受體結(jié)合發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能。目前發(fā)現(xiàn)的BLyS受體主要有三個:TACI，BCMA和BAFF-R。其中BLyS與BAFF-R為特異性結(jié)合，兩者的相互作用是B細胞賴以生存的必要條件。
[0004]BLyS可大量發(fā)現(xiàn)于外周血及淋巴組織細胞的培養(yǎng)上清中，其主要表達于諸如中性粒細胞、巨噬細胞、單核細胞、樹突狀細胞等先天固有的免疫細胞中；在IFNy、IL-10以及 G-CSF (granulocyte colony-stimulating factor，G-CSF)等細胞因子的刺激下會增強BLyS的表達。BlyS具有明顯的B細胞趨向性并能特異性的結(jié)合B細胞，其對于B細胞的增殖、分化、成熟以及生存等方面發(fā)揮著非常重要的調(diào)控作用，而BLyS對由B細胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病的過程以及T淋巴細胞瘤起著重要的影響。BLyS過表達與多種自身免疫性疾病有著密切的聯(lián)系，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic Lupus Erythematosus, SLE)、肖格倫綜合征(Sjogren’sSyndrome，SS)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)、重癥肌無力(MyastheniaGravis，MG)等等(參見，例如，The complexity of the BAFF TNF-familymembers:1mplicat1nsfor autoimmunity.Lahiri A 等 J Autoimmun.2012Sep ；39(3):189-98.do1:0.1016/j.jaut.2012.05.009.Epub 2012Jun 29)。以 BLyS 為作用靶點的藥物，尤其以貝利木單抗為代表的單克隆抗體藥物等，在治療SLE等自身性免疫疾病方面取得非常好的臨床效果。
[0005]單鏈抗體(single chain variable fragment, ScFv)是通過基因工程將抗體的重鏈可變區(qū)(variable reg1n of heavy chain, VH)與輕鏈可變區(qū)(variable reg1n oflight chain,VL)通過一段連接肽而形成的一種重組蛋白。單鏈抗體既保持了親本抗體與抗原的結(jié)合特異性和相當?shù)挠H和力，因為分子量小更容易進入腫瘤組織和細胞，發(fā)揮相應(yīng)的作用；并且單鏈抗體不具有完整抗體的Fe段，因而其不會與補體受體結(jié)合，避免了全長I gGI的抗體依賴的細胞毒和補體依賴的細胞毒性。
[0006]雖然目前噬菌體抗體庫為相對最成熟且應(yīng)用最多的抗體庫技術(shù)，但是噬菌體抗體庫屬于原核表達體系，與真核表達體系存在差異，而表達系統(tǒng)差異越大，抗體改構(gòu)后的活性發(fā)生改變的可能性就越大。哺乳動物細胞抗體庫屬于真核表達體系，它具有原核表達體系所不具備翻譯后修飾功能，而這也是決定蛋白生物活性的關(guān)鍵之一。由于本實驗室構(gòu)建的哺乳動物細胞抗體庫是應(yīng)用人源293T細胞建庫，因此獲得的抗體最近接天然人源抗體，在保證親和力的同時，也使所獲的候選抗體的免疫原性大大降低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供能抗B淋巴細胞刺激因子抗體。
[0008]本發(fā)明提供了一種抗人B淋巴細胞刺激因子單鏈抗體，其具有選自下列可變區(qū):
(a)重鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO: 4所示氨基酸序列；(b)輕鏈可變區(qū)包括SEQ ID NO: 6所示氨基酸序列；(c)重鏈可變區(qū)包括SEQ ID N0:4所示氨基酸序列，且輕鏈可變區(qū)包括SEQ IDNO:6所示氨基酸序列；(d)重鏈可變區(qū)與SEQ ID N0:4所示氨基酸序列具有至少90%同一性；或(e)輕鏈可變區(qū)與SEQ ID NO:6所示氨基酸序列具有至少90%同一性。
[0009]因此，目標抗體可能包含a) —個重鏈可變區(qū)，其氨基酸序列與序列4所示序列至少有約 91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%gg 100%的一致性和 b) 一個輕鏈可變區(qū)，其氨基酸序列與序列6所示序列至少有約91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 的一致性。
[0010]在一個優(yōu)選實施方案中，所述單鏈抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ IDNO:3，輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列為SEQ ID N0:4。
[0011 ] 在一個優(yōu)選實施方案中，編碼所述重鏈可變區(qū)的氨基酸序列的核苷酸序列為SEQID NO: 1，編碼所述輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列的核苷酸序列為SEQ ID NO:2。
[0012]另一方面，本發(fā)明提供了具有選自下列可變區(qū)的單鏈抗體:
[0013](a)重鏈可變區(qū)的編碼基因包括SEQ ID NO:3所示核苷酸序列；(b)輕鏈可變區(qū)的編碼基因包括SEQ ID NO:5所示核苷酸序列；(c)重鏈可變區(qū)的編碼基因包括SEQ ID NO:3所示核苷酸序列，且輕鏈可變區(qū)的編碼基因包括SEQ ID NO: 5所示核苷酸序列；(d)重鏈可變區(qū)的編碼基因能與SEQ ID NO:3所示核苷酸序列在嚴謹條件下雜交；或(e)輕鏈可變區(qū)的編碼基因能與SEQ ID NO:5所示核苷酸序列在嚴謹條件下雜交。
[0014]一個優(yōu)選實施方案中，所述單鏈抗體的重鏈可變區(qū)的編碼核苷酸序列為SEQ IDNO: 3，輕鏈可變區(qū)的編碼核苷酸序列為SEQ ID NO: 5。
[0015]在一個具體實施方案中，本發(fā)明所述單鏈抗體的氨基酸序列為SEQ ID NO:2。
[0016]在一個具體實施方案中，本發(fā)明所述單鏈抗體的編碼基因的核苷酸序列為SEQ IDN0:2o
[0017]另一方面，本發(fā)明提供了重組表達載體，其中含有編碼本發(fā)明所述單鏈抗體全長或可變區(qū)的核酸序列。
[0018]另一方面，本發(fā)明提供了宿主細胞，所述宿主細胞被本發(fā)明所述的重組表達載體所轉(zhuǎn)化。
[0019]本發(fā)明實驗證明，本發(fā)明提供的單鏈抗體與BLyS具有高親和力，BLyS過表達與多種自身免疫性疾病有著密切的聯(lián)系，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic Lupus Erythematosus,SLE)、肖格倫綜合征(Sjogren' sSyndrome, SS)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis，RA)、重癥肌無力(Myasthenia Gravis, MG)等。以BLyS為作用勒點的藥物在治療SLE等自身性免疫疾病方面取得非常好的臨床效果。
[0020]因此，另一方面，本發(fā)明提供了一種用于治療自身免疫病的藥物組合物，其包含有效量的作為活性成分的本發(fā)明所述的單鏈抗體和藥用載體。
[0021]術(shù)語“有效量”指可有效治療哺乳動物中的疾病或病癥的藥物量。
[0022]術(shù)語“藥效上可接受的載體”指一種或多種有機或無機成分，它可以使天然的或合成的，與抗體組合后可促進其應(yīng)用?？山邮艿妮d體包括無菌的生理鹽水或是其他藥學(xué)上可獲得的且為本領(lǐng)域所熟知的水或非水的等滲溶液或滅菌混懸劑。
[0023]另一方面，本發(fā)明提供了一種針對自身免疫病的診斷試劑，其包含本發(fā)明所述的單鏈抗體、能夠產(chǎn)生可檢測信號的標記物及使用說明書。
[0024]另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明所述單鏈抗體在制備用于治療自身免疫病的藥物中的用途。
[0025]另一方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明所述單鏈抗體在制備自身免疫病的診斷試劑中的用途。
[0026]本發(fā)明中所述的自身免疫病包括但不限于系統(tǒng)性紅斑狼瘡、肖格倫綜合征、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎或重癥肌無力等。
[0027]本發(fā)明所述單鏈抗體的重鏈可變區(qū)中的⑶R1、⑶R2、⑶R3的氨基酸序列分別如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9 所示；輕鏈可變區(qū)中 CDRl、CDR2、CDR3 的氨基酸序列分別如 SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12 所示。因此，
[0028]另一方面，本發(fā)明提供了一種抗人B淋巴細胞刺激因子單克隆抗體，其重鏈可變區(qū)中 CDR1、CDR2、CDR3 的氨基酸序列為 SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9;和 / 或其輕鏈可變區(qū)中CDRU CDR2、CDR3的氨基酸序列為SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 11、SEQ IDNO:12ο
[0029]可變區(qū)⑶R的變體與上述⑶R區(qū)可以有至多6個氨基酸殘基(例如，1、2、3、4或5個氨基酸取代)的取代，在具有CDR變體的單克隆抗體中，CDR區(qū)變體具有與B淋巴細胞刺激因子結(jié)合活性。
[0030]本發(fā)明所述單克隆抗體除了重鏈和輕鏈中的高度可變區(qū)⑶R1、⑶R2和⑶R3和鏈接序列外，其它為框架區(qū)。框架區(qū)可在結(jié)合所需的三維結(jié)構(gòu)不受影響的條件下倍其他序列置換，抗體特異性的分子基礎(chǔ)主要來源于它的高變區(qū)⑶R1、⑶R2和⑶R3。這些區(qū)域是與抗原結(jié)合的關(guān)鍵部位。為維持優(yōu)選的結(jié)合特性，CDR的序列應(yīng)盡可能保留，然而，可能需要一些氨基酸改變使結(jié)合特性最優(yōu)化，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以用標準做法來達到此目的。
[0031]所述的單克隆抗體為單鏈抗體、雙鏈抗體、嵌合抗體、抗體片段或含有所述抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽。
[0032]本發(fā)明所述“抗體”應(yīng)該解釋為涵蓋具有所需特異性的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任意特異性結(jié)合因子。因而，這個術(shù)語涵蓋了與之同源的抗體片段、衍生物以及抗體的功能等同物和同源物，也包括含有抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的任何多肽，無論是天然的還是合成產(chǎn)生的?？贵w的實例是免疫球蛋白亞型(如IgG，IgE, IgM, IgD和IgA)及其亞型亞類；也可以是包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的片段如Fab、scFv、Fv、dAb或Fd,或者雙鏈抗體。融合至另一多肽的、包含抗原結(jié)合結(jié)構(gòu)域的嵌合體分子或者等同物也包括在其中。
[0033]抗體可以通過許多方式修飾，可用DNA重組技術(shù)來產(chǎn)生保留原來抗原特異性的其他抗體或嵌合分子。這種技術(shù)可以包括將編碼抗體的免疫球蛋白可變區(qū)或互補性決定區(qū)(CDRs)的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定區(qū)