專利名稱：單鏈可變片段抗-cd133抗體及其用途的制作方法
單鏈可變片段抗-CD133抗體及其用途相關(guān)申請的交叉引用
本申請要求2010年5月26日提交的美國臨時專利申請系列號61/348，348和2010年10月5日提交的美國臨時專利申請系列號61/390，011的優(yōu)先權(quán)，它們各自通過引用整體并入本文。
背景技術(shù)：
癌細胞象正常細胞一樣分化。腫瘤細胞群包括更低分化的、自我更新的、腫瘤起源干細胞的相對小組群，和更高分化的腫瘤細胞的相對更大的組群。更高分化的細胞對化學(xué)療法更敏感，更低分化的癌癥干細胞中的小部分具有更高的抗藥性，因而促成藥物難以治療的復(fù)發(fā)。CD133是一種確定的癌癥干細胞標志物。人⑶133是一種細胞表面糖蛋白，其已經(jīng)被用作造血干細胞、神經(jīng)干細胞的標志物，并用于富集許多癌癥中的腫瘤起源細胞群，所述癌癥包括結(jié)腸癌和膠質(zhì)母細胞瘤(Kemper等人；Weigmann等人，1997; Yin等人，1997)?？?⑶133抗體是可用于鑒別、分離和靶向這些干細胞群體的重要工具。盡管許多⑶133抗體是商購可得的，它們具有幾個限制。首先，最廣泛地使用的抗-CD133單克隆抗體識別這樣的對象所述對象最初被認為是很不明確的糖基化表位(Bidlingmaier等人，2008)，但是最近被報道為在分化過程中丟失的未糖基化的表位，所述丟失可能是由于表位掩蔽(Kemper等人)。在任一種情況下，這些抗體都不會檢測出表達某些翻譯后修飾的CD133表位的細胞，因此不能用于確定總的CD 133表達。其次，商購可得的靶向未修飾的CD133表位的抗-CD133抗體經(jīng)常是多克隆的。第三，大多數(shù)目前可得到的抗體僅適用于有限的生物學(xué)測定中。為了克服這些缺點，需要制備新的抗-CD133單克隆抗體，所述抗體會特異性地識別CD133的未糖基化的表位，且可用于多種生物學(xué)測定中。 癌是轉(zhuǎn)化的上皮細胞的侵襲性惡性腫瘤。一些最致命的癌癥是癌，包括藥物難以治療的胰腺、頭頸、前列腺、乳房、結(jié)腸和其它器官的癌癥。例如，在胰腺癌中，發(fā)現(xiàn)僅10-15%的患者在確診時是可切除的，這是因為它的侵襲性生長和向淋巴結(jié)和肝臟的快速轉(zhuǎn)移。當(dāng)考慮所有階段時，生存中值是3-6個月，5年存活率為1_4%，僅在美國，每年有超過32，000位患者死于該病。乳腺癌具有很好的存活率，但是根據(jù)美國癌癥學(xué)會(American CancerSociety)估測，在2007年仍然有178，000例新病例，預(yù)期40，000例死亡。在頭頸癌的情況下，在美國，在2006年報道了 40，000例病例，約11，000例死于該病。主要難點(culprit)是藥物難以治療的疾病的轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)，所以迫切需要替代性藥物。

發(fā)明內(nèi)容
在一個方面，本發(fā)明提供了一種特異性地結(jié)合人⑶133的單克隆抗體。在有些實施方案中，所述單克隆抗體是由本文所述的雜交瘤克隆7生產(chǎn)的單克隆抗體。在另一個方面，本發(fā)明提供了在本文中鑒別為雜交瘤克隆7的雜交瘤。在另一個方面，本發(fā)明提供了由雜交瘤克隆7生產(chǎn)的單克隆抗體的單鏈可變片段(scFv)o 在有些實施方案中，所述 scFv 包含 SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50,SEQ ID N0:51、SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID N0:54或SEQ ID NO:55的氨基酸序列。在一個具體實施方案中，所述scFv包含SEQ ID N0:53的氨基酸序列。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種分離的多核苷酸，其包含編碼下述氨基酸序列的核苷酸序列SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54 或 SEQ ID NO: 55。在有些實施方案中，所述分離的多核苷酸包含編碼SEQ ID NO:53的氨基酸序列的核苷酸序列。在一個具體實施方案中，所述分離的多核苷酸包含SEQ ID N0:56的核酸序列。在另一個方面，本發(fā)明提供了融合多肽。通常，融合多肽包括靶向部分和毒素部分。所述靶向部分可以包括本文所述的單克隆抗體或其scFv，它們會特異性地結(jié)合癌癥干細胞差別地表達的標志物。在有些實施方案中，所述毒素部分可以包括細胞裂解毒素的去免疫的治療活性部分。在另一個方面，本發(fā)明提供了組合物，所述組合物包括剛剛描述的多種融合多肽。在有些實施方案中，所述組合物可以包括第一種融合多肽和第二種融合多肽，其中所述第一種融合多肽特異性地結(jié)合癌癥干細胞差別地表達的第一種標志物，且所述第二種融合多肽特異性地結(jié)合癌癥干細胞差別地表達的第二種標志物。在一個實施方案中，一種融合多肽可以特異性地結(jié)合⑶133，且另一種融合多肽可以特異性地結(jié)合EGFR。在另一個方面，本發(fā)明提供了組合物，其中所述單克隆抗體或其SCFv可以與納米顆粒偶聯(lián)。在某些實施方案中，所述納米顆?？梢允强缮锝到獾摹Ｔ谀承嵤┓桨钢?，所述納米顆粒可以含有細胞裂解毒素。

在另一個方面，本發(fā)明提供了治療方法，所述治療方法包括給需要這種治療的受試者施用治療有效量的組合物，所述組合物包括本文所述的單克隆抗體或其scFv。在有些實施方案中，所述單克隆抗體或其scFv可以與治療部分融合，或與含有治療性化合物的納米顆粒偶聯(lián)。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種組合物，所述組合物包括與可檢測的標志物偶聯(lián)的本文所述的單克隆抗體或其scFv。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種檢測表達癌癥干細胞標志物的細胞的方法。通常，所述方法包括使至少一個表達CD133的細胞和組合物接觸，所述組合物包括與可檢測的標志物偶聯(lián)的本文所述的單克隆抗體或其scFv，并檢測特異性地結(jié)合所述細胞的組合物的部分。在有些實施方案中，所述組合物可以施用給受試者。上述發(fā)明內(nèi)容無意描述每個公開的實施方案或本發(fā)明的每種實現(xiàn)。下面的描述更具體地例證了示例性的實施方案。在遍布本申請的幾個地方，通過實施例列表提供了引導(dǎo)，所述實施例可以各種組合進行使用。在每種情況下，列舉的列表僅僅用作代表性的集合，不應(yīng)解釋為排它性列表。


圖1:用于疫苗接種的⑶133抗原。⑶133蛋白的拓撲圖(圖A)和氨基酸序列(圖B，SEQ ID N0:l)o 制備了重組的嵌合的 CD133 抗原(SEQ ID N0:2)，其由 SEQ ID N0:1 的氨基酸殘基180-380和612-765 (在圖B中標有下劃線)組成。用細菌表達該重組的嵌合的⑶133抗原(SEQ ID NO: 2)，進行純化，并通過SDS-PAGE證實，其具有45 kDa的分子量(圖C)。圖2:新制備的CD133雜交瘤的分析。測試了雜交瘤克隆的上清液，作為在蛋白質(zhì)印跡(圖A)和免疫熒光(圖B)測定中的第一抗體。免疫前的血清(-ve)或免疫后的抗血清(a. s.)用作對照。就蛋白質(zhì)印跡而言，將關(guān)于蛋白濃度標準化的Caco-2裂解物加載上SDS-PAGE凝膠，分離，印跡到硝酸纖維素膜上，并切成條帶。用得自鑒別的雜交瘤的上清液探測每個條帶。用商購可得的抗體(ab 19898，Abeam)探測在泳道I中的膜,并用作額外陽性對照。就免疫熒光而言，固定Caco-2細胞,并用雜交瘤上清液進行免疫染色。使用商購可得的抗體(293C3，Militenyi)作為額外陽性對照。在該圖中的比例條代表200微米。在原發(fā)性膠質(zhì)母細胞瘤和腎組織的免疫組織化學(xué)分析中，使用雜交瘤克隆7的上清液(圖C)。圖3:由雜交瘤克隆7生產(chǎn)的抗體的特異性。(X)流式細胞計量術(shù)。用得自雜交瘤克隆7的第一抗體或293C3 (Militenyi)溫育細胞，隨后用標記的第二抗體溫育，然后通過流式細胞計量術(shù)進行分析。得自新開發(fā)的抗-CD133雜交瘤克隆7的抗體(空心黑色直方圖)將下述過表達⑶133的細胞非常特異性地染色Caco-2 (iii)、GBM6 (iv)、和用⑶133轉(zhuǎn)染的U87細胞(ii)，但是沒有將⑶133陰性的U87細胞(i)染色。將使用由雜交瘤克隆7生產(chǎn)的單克隆抗體的免疫染色與克隆293C3 (空心灰色直方圖)進行了對比。用實心灰色直方圖代表同種型對照。衣霉素介導(dǎo)的糖基化抑制。用遞增劑量的衣霉素(2.5、5、10、20l^g/ml)處理Caco-2細胞3天。DMSO處理過的細胞或未處理過的細胞用作對照。裂解細胞，然后使用由雜交瘤克隆7生產(chǎn)的單克隆抗體或GAPDH抗體通過蛋白質(zhì)印跡法進行分析。圖4: CD133scFV識別CD133標志物。用FITC標記CD133scFv。從已知的CD133的GenBank序列，制備寡核苷酸，然后`使用聚乙烯亞胺(PEI) -DNA復(fù)合物轉(zhuǎn)染進HEK293-TLR2細胞中。用抗-CD133scFV-FITC復(fù)合物溫育細胞，洗滌，然后通過流式細胞計量術(shù)進行分析。以標準直方圖形式表示數(shù)據(jù)，其中將陽性細胞百分比相對于熒光強度繪圖。僅⑶133-轉(zhuǎn)染的細胞與FITC-標記的⑶133scFv反應(yīng)。對照包括與空載體反應(yīng)的轉(zhuǎn)染細胞，與同種型對照反應(yīng)的轉(zhuǎn)染細胞，或不與CD133-FITC反應(yīng)的未轉(zhuǎn)染細胞。圖5:去免疫的CD133KDEL基因包括抗-CD133 scFV，所述scFV與具有末端KDEL序列的下游PE38拼接。圖6:錐蟲藍活力測定，其中每天在培養(yǎng)的細胞中測量活力。用d⑶133KDEL(CD133KDEL)或?qū)φ湛?B細胞靶向的毒素CD22KDEL處理UMSCC-11B頭頸癌細胞。圖7: d⑶133KDEL融合蛋白會阻止腫瘤干細胞特有的腫瘤起始。在腫瘤起始測定中，將分選的細胞注射進裸鼠脅腹中。該圖顯示了生長的那些腫瘤的腫瘤生長速率。P值指示分選的和未分選的(對照)組之間的差異的顯著性。圖8:錐蟲藍活力測定，其測量d⑶133KDEL隨時間對培養(yǎng)的MDA-MB-231細胞的影響。NTR -未處理。圖9: d⑶133KDEL對具有全身性MDA-MB-231腫瘤的小鼠中的腫瘤進展的影響。通過脾內(nèi)注射來施用200萬細胞，在裸鼠中誘導(dǎo)全身性腫瘤。在腫瘤接種后第6天，開始用d⑶133KDEL治療小鼠。單個療程由每隔一天(星期一、星期三、星期五)注射的20吒藥物組成，給小鼠施用6個療程。每周獲取動物的圖像。將生物發(fā)光強度測量為光子/秒/sr/cm2的函數(shù)。未治療對照。
圖10:用dCD133KDEL、dEGF4KDEL或二者的混合物治療的小鼠中的腫瘤進展的生物發(fā)光分析。圖11: 3H-胸苷攝取測定，其表明，當(dāng)將突變形式(2219ARLKDEL 7mut，批次1，批次2，和批次3)和未突變形式(2219ARLKDEL (親本))與Daudi細胞進行對比時，沒有活性損失。在施用所有3批突變的藥物和I批未突變的藥物48小時以后，細胞殺死是相同的。圖12:每周用突變的或未突變的藥物免疫正常小鼠組。給動物抽血，并每周使用ELISA測定血清的抗-毒素抗體。取各值的平均值，然后通過Student T檢驗進行分析。曲線是顯著不同的(P〈0. 05)。圖13:得自圖12的小鼠的血清樣品的中和固定量的2219KDEL的殺死的能力。從4只2219KDEL7mut-免疫的小鼠和2只用未突變的2219KDEL免疫的小鼠采集血清，然后與
0.2 nM 2219KDEL—起溫育。得自2219KDELmut7小鼠的血清沒有阻斷2219KDEL的細胞殺死。圖14:用突變的2219KDEL7mut治療具有全身性B細胞疾病的小鼠。它們中的80%是沒有疾病的存活者。對照都死亡。圖15:每周用EGF4KDEL 7mut和未去免疫的EGF4KDEL對免疫感受態(tài)B6小鼠(n=5/組)進行免疫。每周取出血清，并在靈敏的ELISA測定中確定抗-毒素(PE)水平。應(yīng)答受到顯著抑制。圖16: dCD133KDEL對MiaPaCa-2胰腺癌細胞的影響。使用3H-亮氨酸摻入蛋白合成測定，在所述細胞系上測試dCD133KDEL。包括CD3CD3KDEL作為陰性對照。包括dEGF4KDEL作為陽性對照，因為在該細胞系上的高EGFR表達。將數(shù)據(jù)表示為3H-亮氨酸摻入相對于在單獨培養(yǎng)基中溫育的對照細 胞的百分比。圖17: d⑶133KDEL對NA頭頸癌細胞的影響。使用3H-亮氨酸摻入蛋白合成測定，在NA細胞系上測試d⑶133KDEL。包括⑶3⑶3KDEL作為陰性對照。包括dEpCAM23作為陽性對照，因為在該細胞系上的高EpCAM表達。將數(shù)據(jù)表示為3H-亮氨酸摻入相對于在單獨培養(yǎng)基中溫育的對照細胞的百分比。圖18:蛋白質(zhì)印跡,其表明抗-小鼠IgG與⑶133抗體-綴合的納米顆粒結(jié)合(泳道3)，但是不與未綴合的納米顆粒結(jié)合(泳道2)。圖19: PLGA顆粒的流式細胞計量術(shù)數(shù)據(jù)，所述PLGA顆粒負載了 6_香豆素，且與⑶133抗體綴合(c)或未綴合(b)。圖20:使用CD133-免疫顆粒的Caco_2細胞的熒光免疫染色。圖21: Caco-2細胞裂解物的⑶133-綴合的納米顆粒(⑶133-NP)和未綴合的納米顆粒(NP)含量。Caco-2細胞表現(xiàn)出對⑶133-綴合的納米顆粒的更大攝取。圖22: d⑶133KDEL對具有人頭頸脅腹腫瘤的裸鼠中的貧片腫瘤進展的影響。A)用測徑器測量腫瘤體積。B)治療的(dCD133KDEL治療的)和未治療的(PBS治療的)小鼠隨時間的生物發(fā)光圖像。圖23: d⑶133KDEL對具有人頭頸脅腹腫瘤的裸鼠中的貧片腫瘤進展的影響。治療的(⑶133KDEL)、未治療的(未處理)和對照(⑶19KDEL)小鼠隨時間的生物發(fā)光圖像。圖24:照片顯示了用scFv⑶133-KDEL治療的、具有人膠質(zhì)母細胞瘤異種移植物的nu/nu小鼠中的腫瘤消退。A)治療前的腫瘤信號，在腹膜內(nèi)注射人膠質(zhì)母細胞瘤細胞以后7天；B)在用scFv⑶133-KDEL治療14天以后的腫瘤信號。
具體實施例方式本發(fā)明提供了組合物和方法，它們利用特異性地結(jié)合癌癥干細胞差別地表達的某些標志物的單克隆抗體及其片段的發(fā)現(xiàn)。本文所述的組合物和方法可以提供某些癌癥形式的檢測和治療的額外選擇，因為所述單克隆抗體(及其片段)靶向癌癥干細胞群體。通過靶向小量的、但是增生性的腫瘤細胞亞群，這可以實現(xiàn)某些癌癥形式的更早檢測，和/或提供有效治療。在下面的公開內(nèi)容中，下述術(shù)語應(yīng)當(dāng)具有指示的含義
“差別地表達的”表示這樣的標志物特性與其它細胞類型對標志物的表達相比，癌癥干細胞以不同的程度表達所述標志物。在某些情況下，所述差別表達可以是，與其它細胞類型相比，癌癥干細胞以更大的程度表達該標志物。在某些情況下，所述標志物可以由癌癥干細胞表達，但是不會在除了癌癥干細胞以外的細胞類型中以可檢測的水平表達?！安糠帧奔捌渥兓枋霰硎具@樣的化學(xué)化合物部分其表現(xiàn)出特定特性，例如，特定生物學(xué)或化學(xué)功能(例如，靶 標特異性或細胞裂解活性)。“多肽”表示，通過肽鍵相連的氨基酸的聚合物。因而，例如，術(shù)語肽、寡肽、蛋白和酶都被包括在多肽的定義內(nèi)。該術(shù)語也包括多肽的表達后修飾，諸如糖基化、乙酰化、磷酸化等等。術(shù)語多肽并不暗示氨基酸聚合物的任何特定最小長度或最大長度。多肽可以是可從天然來源直接分離的，或可以借助于重組技術(shù)、酶技術(shù)或化學(xué)技術(shù)進行制備?！疤禺愋缘摹奔捌渥兓枋霰硎?，對特定靶標具有任何程度的差別的或非一般的(即，非特異性的)親和力。“治療性的”及其變化描述表示，改善與病癥有關(guān)的一種或更多種現(xiàn)有征狀或臨床征象的治療或部分?！案纳啤北硎?，特定病癥特有的征狀或臨床征象的程度、嚴重性、頻率和/或可能性的任何減輕。“征象”或“臨床征象”表示，與特定病癥有關(guān)的客觀物理征，其能夠被患者以外的人發(fā)現(xiàn)?！罢鳡睢北硎炯膊』蚧颊郀顩r的任何主觀證據(jù)。術(shù)語“和/或”是指，一個或所有列出的要素，或任意2個或更多個列出的要素的組合。在這些術(shù)語出現(xiàn)在說明書和權(quán)利要求書中時，術(shù)語“包含”及其變化描述不具有限制含義。除非另外指出，“一個”、“一種”、“所述”和“至少一個”可互換地使用，并表示一個或超過一個。用端點表示的數(shù)值范圍在本文中也包括在該范圍內(nèi)包括的所有數(shù)字(例如，1-5包括 1,1.5,2,2. 75,3,3. 80、4、5 等)。目前可得到的⑶133抗體的一個顯著缺點是，每種抗體僅適用于特定類型的免疫測定法，寬范圍的技術(shù)需要使用多種抗體。在這里，我們報道了一種新穎的抗-CD133單克隆抗體，其可以在蛋白質(zhì)印跡法、免疫熒光、免疫組織化學(xué)和流式細胞計量術(shù)應(yīng)用中識別CD 133抗原。在我們的研究中，通過ELISA進行了雜交瘤的初步篩選，這提示，雜交瘤克隆7也可以潛在地用于ELISA用途中。另外，我們已經(jīng)克隆了雜交瘤克隆7抗體的單鏈可變片段(scFv)。
現(xiàn)有的⑶133抗體的第二個有關(guān)限制是，最常用的抗-⑶133抗體(例如，AC133和293C3)識別已經(jīng)報道為糖基化的⑶133表位的對象(綜述參見=Bidlingmaier等人，2008 )?？商鎿Q地，其他人提出，這些不是糖基化的表位，而是由糖基化造成被掩蔽(由于蛋白折疊的變化)的表位?？赡懿蛔懔钊梭@奇的是，關(guān)于使用這些糖基化依賴性的CD133抗體分選的細胞用于富集具有增加的腫瘤起始和自我更新能力的細胞的能力，存在巨大爭論。眾多報道已經(jīng)載明了具有特殊腫瘤起始潛力的CD133+細胞，但是許多相反的研究已經(jīng)證實，⑶133_細胞也會在異種移植測定中引發(fā)腫瘤(Bidlingmaier等人，2008)。在某些情況下，所謂的“⑶133_細胞”是已經(jīng)喪失AC133/293C3表位的⑶133+細胞。實際上，結(jié)腸腫瘤起始細胞的分化，可以伴有AC133表位喪失、致腫瘤性和集落生成，盡管具有穩(wěn)定的CD133mRNA水平。糖基化依賴性的(例如，AC133，293C3)和糖基化非依賴性的(例如，雜交瘤克隆7)CD133抗體的組合使用，可以是將CD133糖基化的變化與CD133表達的變化區(qū)分開的非常有用的工具。這種區(qū)分可用于測試癌癥干細胞假說的工作中，其中使用基于表面標志物(諸如CD133)分選的細胞。經(jīng)證實的雜交瘤克隆7與糖基化的和未糖基化的表位的反應(yīng)性提示，它可用于將治療劑靶向CD133+癌細胞，不論分化狀態(tài)如何。基于報道的CD133的結(jié)構(gòu)(Shmelkov等人，2005)，設(shè)計了由CD133蛋白的氨基酸殘基180-380和612-765組成的重組的嵌合的抗原(圖1A，圖1B)。使用Hopp-Woods抗原分析圖、Kyte-Doolittle親水性表征和Emini Surface概率分析,來鑒別和避免疏水的、非特異性的和弱免疫原性的區(qū)域。在大腸桿菌中表達了重組抗原，進行純化，并通過SDS-PAGE進行分析(圖1C)。純化的蛋白具有45 kDa的分子量，這與預(yù)測的分子量相一致。使用標準的雜交瘤技術(shù)，將純化的抗原注射進BALB/c小鼠中，用于制備單克隆抗-CD133抗體。通過ELISA，篩 選來自得到的雜交瘤克隆的細胞培養(yǎng)上清液中針對重組CD 133的抗體的生產(chǎn)。在2輪篩選以后，得到11個分泌抗-CD133抗體的陽性穩(wěn)定雜交瘤克隆。使用單獨的雜交瘤克隆7和雜交瘤克隆17的上清液，我們通過蛋白質(zhì)印跡和免疫熒光測定(使用⑶133+ Caco-2細胞)驗證了篩選的雜交瘤，從而揭示了與⑶133的預(yù)測分子量相對應(yīng)的清晰帶(圖2A)。但是，在免疫熒光測定中，得自雜交瘤克隆7、雜交瘤克隆15和雜交瘤克隆16的上清液較強地將Caco-2細胞膜染色，而得自雜交瘤克隆9和雜交瘤克隆13的上清液提供弱染色(圖2B)。由于雜交瘤克隆7在兩種測定中有效地識別CD133表位，我們選擇它用于進一步表征，并測試它在其它用途中的應(yīng)用。在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤和腎組織切片的免疫組織化學(xué)分析中，雜交瘤克隆7導(dǎo)致膜-特異性的染色(圖2C)。所述染色在腎切片中是清晰的且均勻的，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中是更不均勻的。我們接著確定了雜交瘤克隆7對⑶133的特異性。用編碼人⑶133 cDNA的表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染了 CD133ffi/_ U87細胞，用雜交瘤克隆7或商購可得的CD133抗體(293C3)染色，并通過流式細胞計量術(shù)進行分析。適當(dāng)?shù)耐N型抗體和模擬轉(zhuǎn)染的U87細胞用作對照。雜交瘤克隆7和293C3抗體沒有可察覺地將未轉(zhuǎn)染的U87細胞染色(圖3A (i)和圖3A (ii))。相比而言，兩種抗體標記的⑶133-轉(zhuǎn)染的細胞證實了雜交瘤克隆7對⑶133的特異性。接著，雜交瘤克隆7能夠象293C3抗體一樣將內(nèi)源地表達⑶133的Caco-2和GBM6細胞免疫染色(圖 3A (iii)和圖 3A (iv))。接著，我們確定了雜交瘤克隆7是否識別糖基化的表位。在蛋白質(zhì)印跡分析之前，用衣霉素處理Caco-2細胞,所述衣霉素是一種確定地記載的蛋白糖基化抑制劑(Tkacz和Lampen, 1975; Lehle和Tanner, 1976)。在衣霉素處理的樣品中，觀察到與糖基化的⑶133蛋白相對應(yīng)的130 kDa帶和可能來自未糖基化蛋白的95 kDa帶。相比而言，在對照樣品中僅看到糖基化的CD133帶。130 kDa帶甚至存在于用高劑量衣霉素處理且在長期處理以后的樣品中，這指示，這些細胞中CD133糖基化的不完全抑制。更高劑量衣霉素導(dǎo)致明顯的細胞毒性，正如下降的GAPDH帶所示。這些結(jié)果強烈地提示，雜交瘤克隆7特異性地結(jié)合未糖基化的表位。接著，使用雜交瘤克隆7來克隆由雜交瘤克隆7生產(chǎn)的CD133-特異性的單克隆抗體的scFv。首先，使用源自雜交瘤克隆7的RNA，構(gòu)建小鼠scFv文庫。在總RNA純化和第一鏈cDNA合成以后，擴增編碼scFv的基因庫(實施例10)。從合成的cDNA，分別擴增VH和VL基因庫。通過使用重疊PCR融合VH和VL片段，隨機裝配scFv基因。用單一很少切割的限制性內(nèi)切核酸酶Sfil，消化scFv cDNA和載體。連接以后，將重組構(gòu)建體轉(zhuǎn)化進電感受態(tài)的尤凝朦XL1-BLUE中。過夜溫育以后，從宿主細菌中提取擴增的重組噬粒。所述文庫構(gòu)建通過僅一次轉(zhuǎn)化實現(xiàn)，且具有1. 0 X IO7的理論尺寸。進行標準淘選3個循環(huán)，此后，使用噬菌體ELISAdIUS 30個隨機選擇的克隆針對CD133的反應(yīng)性。鑒別出9個陽性克隆，每個生產(chǎn)一種scFv :SEQ ID NO:47,SEQ ID N0:48、SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID N0:5USEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54和SEQ ID N0:55。DNA測序表明，9個⑶133-特異性的克隆中的5個是相同的，這強烈地提示，它們都源自單個雜交瘤克隆7。選擇重組克隆11 (編碼SEQ ID NO:53)，用于轉(zhuǎn)化進TM/fWTop 10F’中進行表達。在該過程中，在5’末端和3’末端處截短重組克隆11，使得由該克隆編碼的scFv多肽具有N-端氨基酸和C-端氨基酸缺失?？寺〉木幋a序列反映在SEQ ID N0:57中，編碼的scFv多肽反映在SEQ ID N0:58中。與SEQ ID N0:53相比，SEQ ID N0:58在N-端處被截短了 6個氨基酸，在C-端處被截短了 16個氨基酸。SEQ ID NO: 58也具有在N-端處的甲硫氨酸，它是克隆過程的人工制品。使用尤展//朦分泌機制，實現(xiàn)了 scFv (SEQ ID NO:58)的可溶表達，并在低溫(30°C)誘導(dǎo)。表達的scFv (SEQ ID NO:58)主要存在于培養(yǎng)基和義凝朦周質(zhì)空間中。進行可溶性scFv ELISA,以確認與⑶133的結(jié)合特異性。存在于培養(yǎng)基和周質(zhì)空間中的重組克隆11 scFv (SEQ ID N0:58)對人CD133是特異性的。因而，在一個方面，本發(fā)明提供了由本文所述的雜交瘤克隆7生產(chǎn)的單克隆抗體的scFv。本文使用的“由雜交瘤克隆7生產(chǎn)的單克隆抗體的scFv”可以包括這樣的多肽所述多肽包括 SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID N0:51、SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:55,SEQ ID N0:58 中的任一個，或在結(jié)構(gòu)上與參照多肽類似的多肽，所述參照多肽包括SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:48,SEQ IDNO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID N0:51、SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54,SEQ IDNO:55, SEQ ID N0:58 中的任一個。在一個實施方案中，所述scFv包括SEQ ID N0:53的氨基酸序列。在其它實施方案中，所述scFv是在結(jié)構(gòu)上與參照多肽類似的多肽，其中所述參照多肽包括SEQ ID NO:53的氨基酸序列。在另一個實施方案中，所述scFv包括SEQ ID NO:58的氨基酸序列。在其它實施方案中，所述scFv是在結(jié)構(gòu)上與參照多肽類似的多肽，其中所述參照多肽包括SEQ ID NO:58的氨基酸序列。如本文使用的，如果多肽的氨基酸序列與參照多肽相比具有指定量的同一性，那么該多肽“在結(jié)構(gòu)上類似于”參照多肽?？梢匀缦卵刂L多肽的整個長度確定2種多肽的結(jié)構(gòu)相似性對齊2種多肽(例如，候選多肽和例如SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:48,SEQ IDNO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID N0:51、SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54,SEQ IDN0:55或SED ID NO:58的多肽)的殘基，以優(yōu)化沿著它們的序列長度的相同氨基酸的數(shù)目；在對齊中允許在任一個或兩個序列中的間隙，以便優(yōu)化相同氨基酸的數(shù)目，盡管如此，在每個序列中的氨基酸必須保持它們的適當(dāng)次序。候選多肽是與參照多肽進行對比的多肽。候選多肽可以分離自例如動物，或可以使用重組技術(shù)來生產(chǎn)，或化學(xué)地或酶促地合成。使用在GCG包(10. 2版，Madison WI)中的BESTFIT算法，可以進行氨基酸序列的逐對對比分析?？商鎿Q地，使用BLAST 2搜索算法的Blastp程序，可以對比多肽，所述BLAST 2 搜索算法由 Tatiana 等人描述0#icro況o7 Lett, 174，247-250 (1999)),且在在國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站上得到?？梢允褂盟蠦LAST 2搜索參數(shù)的默認值，包括matrix = BL0SUM62; open gap penalty = 11, extension gap penalty = I,gap x_dropoff = 50, expect = 10, wordsize = 3,和開啟過濾器。在2個氨基酸序列的對比中，可以用“同一性”百分比表示結(jié)構(gòu)相似性，或可以用“相似性”百分比表示結(jié)構(gòu)相似性。“同一性”表示，相同氨基酸沿著更長多肽的整個長度的存在?！跋嗨菩浴北硎荆刂L多肽的整個長度，不僅存在相同氨基酸，而且存在保守置換。一個氨基酸的保守置換可以選自該氨基酸所屬的類別的其它成員。例如，蛋白生物化學(xué)領(lǐng)域眾所周知，屬于具有特定大小 或特性(諸如電荷、疏水性和親水性)的氨基酸群體的一個氨基酸，可以置換另一個氨基酸，而不改變蛋白的活性，特別是在與生物活性沒有直接關(guān)系的蛋白區(qū)域中。例如，非極性的(疏水的)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。極性的中性氨基酸包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。帶正電荷的(堿性的)氨基酸包括精氨酸、賴氨酸和組氨酸。帶負電荷的(酸性的)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。保守置換包括，例如，Lys置換Arg，反之亦然，以維持正電荷；Glu置換Asp，反之亦然，以維持負電荷；Ser置換Thr，以維持游離-OH ;和Gln置換Asn，以維持游離_NH2。同樣地，也預(yù)見到多肽的生物活性類似物，其含有一個或更多個鄰接或非鄰接氨基酸的缺失或添加，所述缺失或添加不會消除所述多肽的功能活性。本發(fā)明的多肽可以包括，與參照氨基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列相似性的多肽。本發(fā)明的多肽可以包括，與參照氨基酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的多肽。無論評估氨基酸相似性還是氨基酸同一性，參照氨基酸序列可以是SEQ IDNO:47,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID N0:5USEQ ID NO:52,SEQ IDNO:53,SEQ ID NO:54,SEQ ID N0:55或SED ID N0:58中的任一個。因而，在有些實施方案中，所述參照氨基酸序列包括SEQ ID N0:47的氨基酸序列。在其它實施方案中，所述參照氨基酸序列包括SEQ ID N0:48的氨基酸序列。在其它實施方案中，所述參照氨基酸序列包括SEQ ID N0:49的氨基酸序列。在其它實施方案中，所述參照氨基酸序列包括SEQ ID NO:50的氨基酸序列。在其它實施方案中，所述參照氨基酸序列包括SEQ ID N0:51的氨基酸序列。在其它實施方案中，所述參照氨基酸序列包括SEQ ID N0:52的氨基酸序列。在其它實施方案中，所述參照氨基酸序列包括SEQ ID N0:53的氨基酸序列。在其它實施方案中，所述參照氨基酸序列包括SEQ ID N0:54的氨基酸序列。在其它實施方案中，所述參照氨基酸序列包括SEQ ID NO:55的氨基酸序列。在其它實施方案中，所述參照氨基酸序列包括SEDID NO:58的氨基酸序列。在一個具體實施方案中，所述參照氨基酸序列包括SEQ ID N0:53o在另一個具體實施方案中，所述參照氨基酸序列包括SEQ ID NO:58的氨基酸序列。例如，如上所述，SEQ ID NO:58是代表SEQ ID NO:53的稍微截短形式的scFv多肽。SEQ ID NO:58具有243個氨基酸，其中的242個與SEQ ID NO:53中的對應(yīng)氨基酸相同，所述SEQ ID NO:53具有263個氨基酸。因此，SEQ ID N0:58與SEQ ID N0:53相比具有 92% 序列同一性。SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ IDNO:51, SEQ ID NO:52 , SEQ ID N0:54或SEQ ID NO:55的氨基酸序列的類似截短可以類似地提供適當(dāng)?shù)墓δ芏嚯?。也可以設(shè)計本發(fā)明的多肽，以提供額外序列，例如，添加額外的C-端或N-端氨基酸的編碼序列，所述氨基酸會便利通過捕集在柱上或使用抗體的純化。這樣的標簽包括，例如，富含組氨酸的標簽，其允許將多肽純化到鎳柱上。這樣的基因修飾技術(shù)和合適的額外序列是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。在另一個方面，本發(fā)明提供了一種分離的多核苷酸分子，其編碼由本文所述的雜交瘤克隆7生產(chǎn)的單克隆抗體的scFv。示例性的分離的多核苷酸包括這樣的分離的多核苷酸其編碼 SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:50, SEQ ID N0:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55 或 SED ID NO:58 中的任一個的氨基酸序列或在結(jié)構(gòu)上與參照多肽類似的多肽，所述參照多肽包括SEQ ID NO:47,SEQ IDNO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID N0:5USEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ IDNO:54,SEQ ID N0:55或SED ID N0:58中的任一個。示例性的多核苷酸也包括這樣的多核苷酸序列的互補體。在本發(fā)明中也包括，在標準雜交條件下與下述多核苷酸雜交的多核苷酸所述多核苷酸編碼SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ IDNO:51, SEQ ID NO:52, SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:54, SEQ ID NO:55, SED ID N0:58 中的任一個的氨基酸序列或在結(jié)構(gòu)上與參照多肽類似的多肽，所述參照多肽包括SEQ ID N0:47、SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID N0:5USEQ ID NO:52,SEQ ID N0:53、SEQ ID NO:54,SEQ ID N0:55或SED ID N0:58中的任一個，和這樣的多核苷酸序列的互補體。在本發(fā)明中也包括，與參照核苷酸序列具有至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的多核苷酸，所述參照核苷酸序列編碼 SEQ ID NO:47, SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50, SEQ ID NO:51, SEQ IDNO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54,SEQ ID N0:55 或 SED ID NO:58 中的任一個的氨基酸序列。在有些實施方案中，所述參照核苷酸序列可以編碼SEQ ID N0:53的氨基酸序列。在一個實施方案中，所述參照核苷酸序列可以包括SEQ ID N0:56的核苷酸序列。在其它實施方案中，所述參照核苷酸序列可以編碼SEQ ID N0:58的氨基酸序列。在一個實施方案中，所述參照核苷酸序列可以包括SEQ ID N0:57的核苷酸序列。本文使用的“序列同一性”表示2個多核苷酸序列之間的同一性。通常如下確定序列同一性對齊2個多核苷酸的殘基，以優(yōu)化沿著它們的序列長度的相同核苷酸的數(shù)目；在對齊中允許在任一個或兩個序列中的間隙，以便優(yōu)化共有的核苷酸的數(shù)目，盡管如此，在每個序列中的核苷酸必須保持它們的適當(dāng)次序。候選序列是與已知序列進行對比的序列。例如，使用BLAST 2搜索算法的Blastn程序，可以對比2個多核苷酸序列，所述BLAST 2搜索算法由 Tatiana 等人，F(xiàn)EMS Microbiol Lett.，1999;77^: 247-250 描述，且可在環(huán)球網(wǎng)上在ncb1. nlm. nih. gov/BLAST/得到?？梢允褂盟蠦LAST 2搜索參數(shù)的默認值，包括reward for match = I, penalty for mismatch = —2， open gap penalty = 5, extensiongap penalty = 2, gap x_dropoff = 50, expect = 10, wordsize = 11,和開啟過濾器。在本發(fā)明中也包括多核苷酸片段。多核苷酸片段是本文所述的分離的多核苷酸的一部分。這樣的部分可以具 有幾百核苷酸的長度，例如約100、約200、約300、約400、約500、約600、約700或約800個核苷酸的長度。可替換地，這樣的部分可以具有約10個核苷酸至約100個核苷酸的長度。本發(fā)明的單克隆抗體、scFv或多核苷酸可以用于鑒別，得自受試者的樣品是否具有表達⑶133的細胞。人⑶133是一種細胞表面糖蛋白，其已經(jīng)被用作造血干細胞、神經(jīng)干細胞的標志物，并用于富集許多癌癥中的腫瘤起源細胞群，所述癌癥包括結(jié)腸癌和膠質(zhì)母細胞瘤。因而，表達CD133的細胞的鑒別、定位和/或定量，可以給醫(yī)學(xué)從業(yè)人員提供關(guān)于下述方面的信息獲取該樣品的受試者是否具有至少部分地以表達CD133的細胞為特征的病癥，或處于發(fā)展所述病癥的風(fēng)險中。在有些實施方案中，在得自受試者的生物樣品中鑒別出表達CD133的細胞，可以指示所述受試者具有結(jié)腸癌和/或膠質(zhì)母細胞瘤，或處于發(fā)展所述病癥的風(fēng)險中。通常，可以使本發(fā)明的單克隆抗體、scFv或多核苷酸與得自受試者的生物樣品的至少一部分接觸。在單克隆抗體或scFv的情況下,所述生物樣品可以包括表達⑶133的細胞、表達CD133的細胞的片段、和/或從生物樣品中的細胞至少部分地分離的CD133。在多核苷酸的情況下，所述生物樣品可以包括，例如，裂解的細胞、基因組DNA、mRNA和/或cDNA(或mRNA擴增的其它產(chǎn)物，例如，通過PCR)?？梢詸z測所述單克隆抗體、scFv或多核苷酸是否以下述方式特異性地結(jié)合生物樣品中的組分所述方式指示樣品中的細胞的CD133表達。例如，可以檢測單克隆抗體或scFv與CD133的至少一部分的特異性結(jié)合。類似地，本發(fā)明的多核苷酸(如果必要的話，經(jīng)過變性)與得自樣品的多核苷酸(如果必要的話，也經(jīng)過變性)的至少一部分的特異性結(jié)合(例如，雜交)，指示⑶133表達。癌癥干細胞區(qū)室(compartment)含有超過一個干細胞群體，CD133KDEL對這些表達CD133的群體中的至少一個是非常有效的。在我們檢查的各種癌中，我們檢測到約5%CD133細胞/95% CD133-細胞。例如，表I顯示了幾個系。用FITC標記抗-CD133 scFV,然后進行標準的流式細胞計量術(shù)。⑶133表達水平(4-7. 1%)與報告的值相一致。CaCo-2結(jié)腸直腸癌是已知表達高水平的CD133+細胞的細胞系，所以我們包括它作為陽性對照。抗-⑶45-FITC和抗-CD19 FITC是優(yōu)先識別造血細胞的陰性對照。表1.在不同癌系上的⑶133+表達。
權(quán)利要求
1.在本文中鑒別為雜交瘤克隆7的雜交瘤。
2.由雜交瘤克隆7生產(chǎn)的單克隆抗體。
3.由雜交瘤克隆7生產(chǎn)的單克隆抗體的單鏈可變片段(scFv)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的scFv，所述scFv包含SEQID NO:47,SEQ ID NO:48,SEQ IDNO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54,SEQ IDNO:55或SEQ ID NO:58的氨基酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的scFv，其中所述scFv包含SEQID NO: 58的氨基酸序列。
6.一種分離的多核苷酸，其包含編碼下述氨基酸序列的核苷酸序列SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:5USEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55 或 SEQ ID NO:58。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的分離的多核苷酸，其中所述分離的多核苷酸包含編碼SEQIDNO:58的氨基酸序列的核苷酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的分離的多核苷酸，其中所述分離的多核苷酸包含SEQIDNO:57的核酸序列。
9.一種組合物，其包含權(quán)利要求2的單克隆抗體。
10.一種組合物，其包含權(quán)利要求3-5中的任一項的scFv。
11.一種融合多肽，其包含 靶向部分，其包含 權(quán)利要求2的單克隆抗體；或 權(quán)利要求3-5中的任一項的scFv ;和 毒素部分，其包含細胞裂解毒素的治療活性部分。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的多肽，其中所述毒素部分是去免疫的。
13.一種組合物，其包含 根據(jù)權(quán)利要求11所述的第一種融合多肽；和 第二種融合多肽，其包含 根據(jù)權(quán)利要求11所述的第二種融合多肽；或 融合多肽，其包含特異性地結(jié)合癌癥干細胞差別地表達的第二種標志物的單克隆抗體或其ScFv0
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的組合物，其中癌癥干細胞差別地表達的至少一種標志物包括 CD133。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或權(quán)利要求14所述的組合物，其中癌癥干細胞差別地表達的至少一種標志物包括EGFR。
16.—種方法,其包括 給需要這種治療的受試者施用治療有效量的 權(quán)利要求2的單克隆抗體； 權(quán)利要求3-5中的任一項的scFv ； 根據(jù)權(quán)利要求11或權(quán)利要求12所述的融合多肽；或 權(quán)利要求9、10或13-15中的任一項的組合物。
17.根據(jù)權(quán)利要求9所述的組合物，所述組合物另外包括與單克隆抗體偶聯(lián)的納米顆粒。
18.根據(jù)權(quán)利要求10所述的組合物，所述組合物另外包括與scFv偶聯(lián)的納米顆粒。
19.一種組合物，其包含與下述物質(zhì)偶聯(lián)的可檢測的標志物 權(quán)利要求2的單克隆抗體，或 權(quán)利要求3-5中的任一項的scFv。
20.—種方法,其包括 使權(quán)利要求19所述的組合物與至少一個表達CD133的細胞接觸；和 檢測包含與至少一個表達CD133的細胞特異性地結(jié)合的至少一部分組合物的復(fù)合物。
21.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述接觸包括給受試者施用所述組合物，所述受試者包含表達⑶133的癌癥干細胞。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中檢測包含與至少一個表達⑶133的細胞特異性地結(jié)合的至少一部分組合物的復(fù)合物指示所述受試者具有腫瘤病癥或處于該風(fēng)險中。
全文摘要
本文公開了特異性地結(jié)合人CD133的單克隆抗體和其單鏈可變片段。本文也公開了生產(chǎn)特異性地結(jié)合人CD133的單克隆抗體的雜交瘤。
文檔編號G01N33/53GK103068850SQ201080068255
公開日2013年4月24日 申請日期2010年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月26日
發(fā)明者J.R.奧爾菲斯特, J.潘亞姆, S.K.斯瓦米納桑, D.A.瓦勒馬 申請人:明尼蘇達大學(xué)評議會