專(zhuān)利名稱(chēng)：一種玉米胚乳瞬時(shí)表達(dá)外源基因的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)，尤其涉及的是一種玉米胚乳瞬時(shí)表達(dá)外源基因的方法。
背景技術(shù)：
瞬時(shí)表達(dá)以活體植株作為實(shí)驗(yàn)材料，能夠準(zhǔn)確的反應(yīng)基因在植物體內(nèi)的實(shí)際功能，是一種快速、簡(jiǎn)便、高效的基因功能分析法，已經(jīng)在多種植物中得到應(yīng)用(Xu et.al.，2001 ；Mitsui et. al. ,2003 ；ffydro et. al.，2006)。瞬時(shí)表達(dá)的轉(zhuǎn)化方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法、基因槍轟擊法以及原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法幾種。這幾種方法各有優(yōu)劣，對(duì)于定性研究，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法較為理想，它操作簡(jiǎn)便，成本很低，缺點(diǎn)是每次只能轉(zhuǎn)化一個(gè)質(zhì)粒，由于轉(zhuǎn)化效率的因素，不可能做到每次轉(zhuǎn)化的細(xì)胞數(shù)都是一致的，因此，對(duì)于定量研究基因的功能是不夠準(zhǔn)確的。 而且，由于物種的限制，一些植物組織農(nóng)桿菌較容易侵染，轉(zhuǎn)化效率較高，而許多植物，特別是單子葉植物的組織是不容易受農(nóng)桿菌侵染的，不適合于用農(nóng)桿菌侵染法。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法在擬南芥和玉米黃化苗葉片以及水稻懸浮細(xì)胞中已經(jīng)應(yīng)用成功(Chiu et. al. , 1996 ；Luet. al. ,1998 ；Sheen et. al.，2001 )，這種轉(zhuǎn)化方法可以同時(shí)向細(xì)胞中轉(zhuǎn)入多個(gè)質(zhì)粒，因此，轉(zhuǎn)化時(shí)可以加入一個(gè)含有報(bào)告基因的內(nèi)參質(zhì)粒，用來(lái)檢測(cè)每次轉(zhuǎn)化的效率，從而糾正每次實(shí)驗(yàn)中轉(zhuǎn)化效率不同而產(chǎn)生的誤差，對(duì)于要求定量研究是一個(gè)理想方法。雖然原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法是一種簡(jiǎn)便高效的轉(zhuǎn)化方法，但是對(duì)于材料有很大的限制，有研究顯示，擬南芥葉片的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化中，對(duì)于擬南芥的生長(zhǎng)狀態(tài)和生長(zhǎng)時(shí)期有較高的要求(Sheen et. al. ,2001)；玉米葉片原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化也僅限于用2-3葉期的黃化苗制作的原生質(zhì)體，而其它時(shí)期的葉片或含有葉綠體葉片或者其它組織原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化目前非常困難(Chiu et.al.，1996)。水稻懸浮細(xì)胞的局限性主要在于懸浮細(xì)胞的獲得，懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)需要經(jīng)過(guò)愈傷組織多次繼代后，再用液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)，使松散的愈傷組織分散到液體培養(yǎng)基中才能獲得懸浮細(xì)胞(Lu et. al.，1998)，這是一個(gè)耗時(shí)耗力的過(guò)程。除了以上三種材料外，其它植物材料的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法還鮮見(jiàn)報(bào)道?；驑屴Z擊轉(zhuǎn)化法是一個(gè)物理過(guò)程，最大的優(yōu)點(diǎn)是轉(zhuǎn)化材料不受物種限制，而且操作簡(jiǎn)便。目前已經(jīng)報(bào)道的基因槍轟擊法介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)在多種植物中已經(jīng)得到應(yīng)用(Luan et. al. , 1992 ；Xu et. al. , 2001 ；Miki et. al. , 2004 ；Selth et.al.,2004 ；Ueki et. al. ,2009)。Marzabal等(1998)曾利用授粉后15-17天的玉米胚乳進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)分析了 Y-zein基因啟動(dòng)子中的兩個(gè)順式作用元件，我們根據(jù)Marzdbal等報(bào)導(dǎo)的方法，在授粉后15-17天的玉米胚乳中沒(méi)能成功瞬時(shí)表達(dá)外源基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足提供一種玉米胚乳瞬時(shí)表達(dá)外源基因的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案如下一種玉米胚乳瞬時(shí)表達(dá)外源基因的方法，采用基因槍轟擊轉(zhuǎn)化授粉后9天的胚乳，轟擊壓力為900psi,轟擊距離6cm。本發(fā)明技術(shù)解決了胚乳特異表達(dá)基因和啟動(dòng)子的瞬時(shí)表達(dá)難題，為胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子活力驗(yàn)證，順式作用元件鑒定，外源基因功能鑒定提供技術(shù)支撐。


圖I為授粉后不同天數(shù)的玉米胚乳在不同壓力和不同轟擊距離下的轉(zhuǎn)化效率；A-F分別為7DAP胚乳，9DAP胚乳，IlDAP胚乳，13DAP胚乳，15DAP胚乳，20DAP胚乳；圖2為部分轟擊條件下胚乳的染色情況(7DAP胚乳，6cm) 1-4 1300psi, IIOOpsi，900psi,650psi ；圖3為ZmSSI啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的⑶S在9DAP胚乳中的染色情況；1_2 :轟擊2槍?zhuān)Z擊I槍?zhuān)弧?br> 具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。我們對(duì)玉米胚乳瞬時(shí)表達(dá)的轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了摸索和優(yōu)化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)于灌漿后不同時(shí)期的玉米胚乳，轉(zhuǎn)化效率存在很大的差異，授粉后7-11天的胚乳能夠有效進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其中以授粉后9天的胚乳轉(zhuǎn)化效果最好，而授粉11天以后，隨著授粉后天數(shù)的推移，轉(zhuǎn)化效果隨之明顯降低，幾乎降為零(圖I)。從剝離的胚乳外觀可以發(fā)現(xiàn)，授粉后7-9天的胚乳呈現(xiàn)的是透明狀，里面幾乎沒(méi)有淀粉等貯藏物質(zhì)，而授粉后11天的胚乳已經(jīng)開(kāi)始變渾濁，說(shuō)明細(xì)胞里面開(kāi)始合成淀粉等貯藏物質(zhì)了，隨著授粉后天數(shù)的推移，胚乳由透明的果凍狀逐漸變成白色的固體，而轉(zhuǎn)化效果也隨之迅速降低。說(shuō)明胚乳細(xì)胞內(nèi)淀粉等貯藏物質(zhì)的合成是干擾胚乳基因槍轉(zhuǎn)化的主要因素。其原因可能是授粉13天后胚乳細(xì)胞里造粉體內(nèi)開(kāi)始大量合成淀粉，眾多含有淀粉的造粉體包圍在胚乳的細(xì)胞核外，阻止了基因槍轟擊的金粉進(jìn)入細(xì)胞核，從而大大降低了轉(zhuǎn)化效率。除材料的自身因素外，影響基因槍轉(zhuǎn)化效率的因素還有轟擊壓力、轟擊距離以及轟擊的次數(shù)等。轟擊壓力大時(shí)，金粉的穿透力強(qiáng)，但是可能損壞細(xì)胞，轟擊壓力小時(shí)，能有效保護(hù)細(xì)胞，但穿透力弱，有可能不能將金粉有效打入細(xì)胞核。轟擊距離的遠(yuǎn)近也是同理。對(duì)于以上幾個(gè)參數(shù)的摸索發(fā)現(xiàn)，900psi的轟擊壓力能獲得最高的轉(zhuǎn)化效果(圖2)，轟擊距離以6cm為最佳。對(duì)于授粉后9天的胚乳在最佳轟擊條件下,轟擊一次與轟擊兩次得到的結(jié)果差異不顯著(圖3)，說(shuō)明轟擊次數(shù)對(duì)轉(zhuǎn)化效率影響不明顯。應(yīng)當(dāng)理解的是，對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，可以根據(jù)上述說(shuō)明加以改進(jìn)或變換，而所有這些改進(jìn)和變換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種玉米胚乳瞬時(shí)表達(dá)外源基因的方法，其特征在于，采用基因槍轟擊轉(zhuǎn)化授粉后9天的胚乳,轟擊壓力為900psi,轟擊距離6cm。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種玉米胚乳瞬時(shí)表達(dá)外源基因的方法，采用基因槍轟擊轉(zhuǎn)化授粉后9天的胚乳，轟擊壓力為900psi，轟擊距離6cm。本發(fā)明解決了胚乳特異表達(dá)基因和啟動(dòng)子的瞬時(shí)表達(dá)難題，為胚乳特異性表達(dá)啟動(dòng)子活力驗(yàn)證，順式作用元件鑒定，外源基因功能鑒定提供技術(shù)支撐。
文檔編號(hào)C12N15/87GK102965394SQ20121033042
公開(kāi)日2013年3月13日 申請(qǐng)日期2012年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月10日
發(fā)明者黃玉碧, 胡育峰, 張軍杰, 劉漢梅, 劉應(yīng)紅 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)