以鴨病毒性腸炎病毒疫苗株為載體的重組病毒疫苗在雞形目禽類中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種活病毒載體鴨病毒性腸炎病毒(DEV)弱毒疫苗載體在雞形目禽類中的應(yīng)用，所述DEV弱毒疫苗載體可以用于表達(dá)雞形目禽類病原的相關(guān)基因，并能攜帶外源基因在雞形目禽類中表達(dá)，在免疫動物體內(nèi)誘導(dǎo)良好的針對此病原的保護(hù)。本發(fā)明通過表達(dá)禽流感病毒血凝素(HA)基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株(其保藏編號為CCTCC?V201125，命名為rDEVus78Ha-Re6)和表達(dá)新城疫病毒F基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株(其保藏編號為CCTCC?V201220，命名為rDEV?F)在雞中的應(yīng)用證明了DEV弱毒疫苗株載體的以上特性。
【專利說明】以鴨病毒性腸炎病毒疫苗株為載體的重組病毒疫苗在雞形
目禽類中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于重組病毒疫苗領(lǐng)域，更具體地屬于重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗領(lǐng)域。本發(fā)明提供一種可以在雞形目禽類中使用的活病毒載體，即鴨病毒性腸炎病毒(DEV)弱毒疫苗株載體，其可以表達(dá)雞形目禽類病原的相關(guān)基因，并能攜帶此外源基因在雞形目禽類中表達(dá)，在免疫動物體內(nèi)誘導(dǎo)良好的針對此病原的保護(hù)。本研究分別以表達(dá)禽流感病毒血凝素(HA)基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株(其保藏編號為CCTCC V201125，命名為rDEVus78Ha-Re6)和表達(dá)新城疫病毒F基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株(其保藏編號為CCTCC V201220，命名為rDEV F)為模式病毒，證明了 DEV弱毒疫苗株的以上特性。
【背景技術(shù)】
[0002]鴨腸炎病毒(duck enteritis virus, DEV),又稱鴨病毒性腸炎病毒。能引起鴨、鵝和其它雁形目禽類發(fā)生急性 、熱性、敗血性為特征的烈性傳染病。但對DEV的研究相對于其它皰疫病毒而言相對比較少。故第八次國際病毒學(xué)分類委員會報(bào)告將其分類為皰疫病毒[1]，而未能進(jìn)一步將其進(jìn)行分類。2009年，Li等報(bào)道了 DEV疫苗株全基因組的測序和分析結(jié)果，其基因組大小約為158Kb，約編碼78個(gè)蛋白。通過對DEV疫苗株基因組基因構(gòu)成及結(jié)構(gòu)分析，DEV被認(rèn)為是α皰疹病亞科中的中間型病毒，與水痘病毒屬成員更為相近[2]。而同為禽類皰疫病毒的馬立克病毒(MDV)和火雞皰疫病毒(HTV)屬于馬立克病毒屬,雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)和鸚鵡皰疹病毒(PsHV)為傳染性喉氣管炎病毒屬。
[0003]目前，我國使用的DEV弱毒疫苗株是上世紀(jì)60年代在雞胚聯(lián)系傳代研制成功。只用于預(yù)防鴨等雁形目禽類DEV。使用廣泛，安全有效[3]。至今未見有報(bào)道其可作為活病毒載體表達(dá)雞等雞形目禽類傳染病病源保護(hù)性抗原，并可用于預(yù)防雞形目禽類傳染病。
[0004]自上世紀(jì)80年代成功利用痘苗病毒為載體表達(dá)單純皰疹病毒的TK基因以來，人們開始嘗試用各種不同DNA病毒為載體，表達(dá)不同外源基因，并將構(gòu)建的重組疫苗用于人和各種不同動物疾病的預(yù)防。大量的研究結(jié)果表明，皰疹病毒因其基因組大，可供外源基因插入或替代的非必需基因多，被認(rèn)為是一種良好的構(gòu)建重組活疫苗的病毒載體。截止目前，已有大量的相關(guān)研究報(bào)道。在常見畜禽皰疹病毒疾病中，如以偽狂犬病毒(PRV)為載體，分別在gD、gE、gG和TK等基因中插入CSF的E2等外源基因，并用其免疫豬，取得了良好的免疫效果&11]。用在雞傳染性喉氣管炎病毒(ILTV)的ULO和UL50中分別插入不同HA基因構(gòu)建成功的重組病毒免疫雞，均效果良好[12,]。同樣,Sakaguchi M(1993 ；1994)和SonodaK (1996)等分別在MDVl的US10、US3、IRL中插入Lac Z基因，用其免疫I日齡無特定病原雞(SPF雞)，I周后用vMDV、vvMDV攻毒，其對SPF雞的保護(hù)效率為80~100% [15_17];在MDVl的USlO中插入NDV F基因、在US2中插入IBDV VP2基因的重組病毒對MDV強(qiáng)毒的保護(hù)效率與對照MDVl相當(dāng)[18’19] ；Tsukamoto K等(2002)以Pec作為傳染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2基因的啟動子插入火雞皰疹病毒(HVT)的UL45和UL46基因之間成功構(gòu)建重組病毒，用其免疫的SPF雞足以抵抗IBDV強(qiáng)毒的攻擊[2°]。[0005]本研究室在前期研究中，在鴨病毒性腸炎病毒的基因組中鑒定出可供外源基因穩(wěn)定插入的復(fù)制非必需區(qū)。在此基礎(chǔ)之上，本研究將目前中國用于禽流感預(yù)防的疫苗株血凝素(HA)基因插入DEV基因組的US7和US8基因之間，用其免疫無特定病原鴨(SPF鴨)能使SPF鴨產(chǎn)生良好的對抗流感的抗體[21]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，用其免疫雞，可以誘導(dǎo)良好的HI抗體。攻毒試驗(yàn)表明，免疫后兩周，免疫雞均完全保護(hù)。證明DEV弱毒疫苗株能在雞體內(nèi)進(jìn)行一過性復(fù)制，并能攜帶外源基因并表達(dá)，使外源蛋白誘導(dǎo)良好的抗體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供一種可以在雞形目禽類中使用的活病毒載體，即DEV弱毒疫苗株載體，其可以表達(dá)雞形目禽類病原的相關(guān)基因，并能攜帶此外源基因在雞形目禽類中表達(dá)，在免疫動物體內(nèi)誘導(dǎo)良好的針對此病原的保護(hù)。本發(fā)明分別通過表達(dá)禽流感病毒血凝素(HA)基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株(其保藏編號為CCTCC V201125(命名為rDEVus78Ha-Re6)和表達(dá)新城疫病毒F基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株(其保藏編號為CCTCC V201220，命名為rDEV F)在雞中的應(yīng)用證明了 DEV弱毒疫苗株載體的以上特性。
[0007]具體地，本發(fā)明人利用重組克隆技術(shù)，分別將包含禽流感病毒血凝素(HA)基因和SV40啟動子序列的基因片段SV40-HA(SEQ ID NO:1)，和包含新城疫病毒F基因和SV40啟動子序列的基因片段SV40-F(SEQ ID NO:2)插入到DEV的US7和US8基因之間的間隔區(qū)(US7和US8基因之間的間隔區(qū)的核苷酸序列見SEQ ID NO:6)中，分別構(gòu)建獲得在US7和US8基因之間插入SV40-HA表達(dá)框的粘粒pF0S5us78 SV40 HA,和插入SV40-F表達(dá)框架的 粘粒pF0S5us78 SV40 F。并拯救獲得表達(dá)禽流感病毒血凝素(HA)基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株CCTCC V201125，命名為rDEVus78Ha_Re6 (該重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株已于2011年7月15日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國武漢，武漢大學(xué)))；和表達(dá)新城疫病毒F基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株CCTCC V201220，命名為rDEVF(于2012年5月24日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，中國武漢，武漢大學(xué)，郵編:430072))。表達(dá)禽流感病毒血凝素(HA)基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株CCTCCV201125已于2011年9月26日申請專利，申請?zhí)枮?01110286743.6，其中詳細(xì)描述了表達(dá)禽流感病毒血凝素(HA)基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株的構(gòu)建方法，并證明了該重組疫苗株能夠有效地預(yù)防由鴨病毒性腸炎病毒和禽流感病毒在鴨、鵝和其它雁形目禽類中引起的傳染病。表達(dá)新城疫病毒F基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株CCTCC V201220的構(gòu)建方法參見下述實(shí)施例4。
[0008]按本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)的理解，DEV弱毒疫苗株載體是構(gòu)建在包括鴨鵝的雁形目禽類中有預(yù)防活性的重組病毒疫苗株的廣泛應(yīng)用的病毒載體，由于雁形目與雞形目之間的物種差異，目前還沒有人將DEV弱毒疫苗株載體用于構(gòu)建在雞形目中有預(yù)防活性的重組病毒疫苗株。然而，本發(fā)明人在關(guān)于表達(dá)禽流感病毒血凝素(HA)基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株的后續(xù)研究中令人驚訝地發(fā)現(xiàn)上述由DEV弱毒疫苗株載體構(gòu)建的表達(dá)禽流感病毒血凝素(HA)基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株在雞形目禽類中也具有有效活性。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)鴨腸炎病毒(DEV)弱毒疫苗株載體也可以用于構(gòu)建能夠預(yù)防雞形目禽類疾病的重組病毒疫苗株，進(jìn)而完成了本發(fā)明。同時(shí)，發(fā)明人進(jìn)一步構(gòu)建了表達(dá)新城疫病毒F基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株rDEV F，并在雞中進(jìn)行了系統(tǒng)評價(jià)，進(jìn)一步證明DEV弱毒疫苗株載體可用于構(gòu)建在雞形目中有預(yù)防活性的重組病毒疫苗株。
[0009]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供鴨病毒性腸炎病毒（DEV)弱毒疫苗株 載體用于構(gòu)建能夠預(yù)防雞形目禽類疾病的重組病毒疫苗株的應(yīng)用，該鴨病毒性腸炎病毒 (DEV)弱毒疫苗株載體可以表達(dá)雞形目禽類病原的相關(guān)基因，并能攜帶外源基因在雞形目 禽類中表達(dá)，在免疫動物體內(nèi)誘導(dǎo)良好的針對此病原的保護(hù)。其中所述鴨病毒性腸炎病毒 弱毒疫苗株可以是CVCC AV1222。外源雞形目病原基因一般插入到鴨病毒性腸炎病毒（DEV) 弱毒疫苗株載體的US7和US8基因之間的間隔區(qū)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)和經(jīng) 驗(yàn)選擇適當(dāng)?shù)牟迦胛稽c(diǎn)，利用鴨病毒性腸炎病毒弱毒疫苗株構(gòu)建重組病毒的方法可參見 CCTCC V201125的構(gòu)建方法（可參見專利申請201110286743. 6)。
[0010]通過檢測表達(dá)禽流感病毒血凝素（HA)基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株和表 達(dá)新城疫病毒F基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株在雞形目禽類中的預(yù)防活性證明鴨 病毒性腸炎病毒疫苗株以上特點(diǎn)。表達(dá)禽流感病毒血凝素（HA)基因的重組鴨病毒性腸炎 病毒疫苗株保藏編號為CCTCC V201125，命名為rDEVus78Ha-Re6，其于2011年7月15日保 藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC，中國武漢，武漢大學(xué)）；表達(dá)新城疫病毒F基因的重 組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株保藏編號為CCTCC V201220，命名為rDEV F (于2012年5月24 日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC，中國武漢，武漢大學(xué)，郵編：430072))。所述表 達(dá)禽流感病毒血凝素（HA)基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株CCTCC V201125在鴨腸炎 病毒DEV基因組的US7和US8基因之間的間隔區(qū)（SEQ ID NO ：6)中插入包含禽流感病毒血 凝素HA基因和SV40啟動子序列的基因片段SV40-HA(SEQ ID NO ：1)0所述表達(dá)新城疫病 毒F基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株CCTCC V201220在鴨腸炎病毒DEV基因組的US7 和US8基因之間的間隔區(qū)（SEQ ID N0：6)中插入包含新城疫病毒F基因和SV40啟動子序 列的基因片段SV40-F(SEQ ID NO :2)。
[0011]因此，在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供表達(dá)禽流感病毒血凝素HA基因 的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株CCTCC V201125在制備用于預(yù)防雞形目禽類中的禽流感疾 病的重組病毒疫苗中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供表達(dá)新城疫病毒F基因的重組鴨病毒性腸炎病 毒疫苗株CCTCC V201220在制備用于預(yù)防雞形目禽類中的新城疫疾病的重組病毒疫苗中的 應(yīng)用。
[0012]在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，除禽流感病毒基因、新城疫病毒基因外，所述雞形目 禽類的其它病原，包括禽法氏囊病病毒、禽傳染性支氣管炎病毒等其它可感染雞形目禽類 的各類疾病病原。例如，可以是禽流感病毒血凝素HA基因，新城疫病毒的F基因或HN基因， 法氏囊病毒的VP2基因等。
[0013]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種可以在雞形目禽類中使用的活病毒 載體，DEV弱毒疫苗株載體，其可以表達(dá)雞形目禽類病原的相關(guān)基因，并能攜帶此外源基因 在雞形目禽類中表達(dá)，在免疫動物體內(nèi)誘導(dǎo)良好的針對此病原的保護(hù)。通過表達(dá)禽流感病 毒血凝素（HA)基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株和表達(dá)新城疫病毒F基因的重組鴨病 毒性腸炎病毒疫苗株證明鴨病毒性腸炎病毒疫苗株以上特點(diǎn)。以及用此載體研制新的在雞 形目禽類中使用的疫苗。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)所述疫苗的應(yīng)用目的、進(jìn)行免疫的禽類等因 素，可以容易地選擇適合的藥用佐劑、賦形劑等。
[0014]在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，所述DEV弱毒疫苗株，可用做載體研制新型疫苗在雞形目禽類中應(yīng)用，有效用于預(yù)防由雞形目禽類相關(guān)病原引起的傳染病，例如，有效用于預(yù)防法氏囊病毒引起的法氏囊病、由禽流感病毒等引起的禽流感等、新城疫病毒引起的新城疫疾病等。因此，本發(fā)明提供下述:
[0015]1.鴨病毒性腸炎病毒弱毒疫苗株用于制備預(yù)防雞形目禽類中疾病的重組病毒疫苗株的應(yīng)用，其中所述鴨病毒性腸炎病毒弱毒疫苗株用作攜帶外源性雞形目禽類病原基因在雞形目禽類中表達(dá)的表達(dá)載體。
[0016]2.第I項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述鴨病毒性腸炎病毒弱毒疫苗株是CVCC AV1222。
[0017]3.第I項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述外源性雞形目禽類病原基因選自禽流感病毒、新城疫病毒、禽法氏囊病病毒、或禽傳染性支氣管炎病毒等雞形目禽類常見傳染病病原的基因。
[0018]4.第3項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述外源性雞形目禽類病原基因選自禽流感病毒血凝素HA基因、新城疫病毒的F基因或HN基因、或法氏囊病毒的VP2基因等。
[0019]5.第I項(xiàng)的應(yīng)用，其中所述雞形目禽類中的疾病選自由禽流感病毒引起的禽流感、由法氏囊病毒引起的法氏囊病、由新城疫病毒引起的雞新城疫病、禽傳染性支氣管炎病毒引起的雞傳染性支氣管炎病等。
[0020]6.一種表達(dá)新城疫病毒F基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株，其保藏編號為CCTCC V201220。
[0021]7.表達(dá)禽流感病毒血凝素HA基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株CCTCCV201125在制備用于預(yù)防雞形目禽類中的禽流感疾病的重組病毒疫苗中的應(yīng)用。
[0022]8.表達(dá)新城疫病毒F基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株CCTCC V201220在制備用于預(yù)防雞形目禽類中的新城疫疾病的重組病毒疫苗中的應(yīng)用。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]從下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的上述特征和優(yōu)點(diǎn)將更明顯，其中:
[0024]圖1:PCClFos 粘粒圖譜；
[0025]圖2:拯救的病毒dDEV與親本DEV疫苗株病毒基因組分別用BamH 1.EcoR 1.BbvCI酶切后的脈沖電泳圖譜，其中DEV:親本DEV疫苗株(即用于構(gòu)建重組病毒的親本病毒疫苗株)，dDEV:由本發(fā)明人構(gòu)建和篩選的5粘粒系統(tǒng)(參見實(shí)施例1-3)拯救出的三株病毒，Ml:低范圍PFG分子標(biāo)記(Low Range PFG Marker) ；M2:DL15000分子標(biāo)記；M3: λ -Hind III消化分子標(biāo)記(λ-Hind III digest Marker)；
[0026]圖3:pUC ccdB kan 質(zhì)粒圖譜；
[0027]圖4:pF0S5 us78 Kan ccdB 粘粒圖譜；
[0028]圖5:pENTR MCS 質(zhì)粒圖譜；
[0029]圖6:pSI HA⑷和pSI F⑶質(zhì)粒圖譜；
[0030]圖7:pENTR sv40_ha(A)和 pENTR sv40_F(B)質(zhì)粒圖譜；
[0031]圖8:pF0S5us78 SV40 HA(A)和 pF0S5us78 SV40F (B)粘粒圖譜；
[0032]圖9:鴨病毒性腸炎病毒感染性克隆拯救重組病毒示意圖；
[0033]圖10:重組病毒HA基因和F基因在CEF中的表達(dá)免疫熒光檢測結(jié)果圖；
[0034]圖11:免疫重組病毒后，在SPF雞體內(nèi)誘導(dǎo)HI抗體的情況；“^”:rDEVus78Ha-Re6免疫組，“O” =DEV免疫組，“〇” =PBS對照組。[0035]圖12:SEQ ID NO:1:SV40_HA表達(dá)框架，其中斜體加下劃線部分為來自H5N1型禽流感毒株A/duck/Guangdong/S1322/2010 (H5N1)的禽流感血凝素HA基因。
[0036]圖13:SEQ ID NO:2:SV40_F表達(dá)框架，其中斜體加下劃線部分為來自新城疫病毒LaSota毒株F基因。
[0037]序列描述
[0038]SEQ ID NO:1:SV40_HA 表達(dá)框架，即包含 A/duck/Guangdong/Sl322/2010 (H5Nl)禽流感病毒血凝素HA基因和SV40啟動子序列的基因片段；
[0039]SEQ ID NO:2:SV40_F表達(dá)框架，其中斜體加下劃線部分為來自新城疫病毒LaSota毒株F基因。[0040]SEQ ID NO:3:“RfA” 基因，其中基因?yàn)?aatRl-氯霉素-ccdB_aatR2 ；
[0041]SEQ ID NO:4 =RfKan 基因；
[0042]SEQ ID NO:5:A/duck/Guangdong/S1322/2010 (H5N1)禽流感病毒血凝素HA基因；
[0043]SEQ ID NO:6:US7和US8基因之間的間隔區(qū)的核苷酸序列；
[0044]SEQ ID NO:7:來源于新城疫病毒的LaSota毒株的新城疫病毒F基因。
【具體實(shí)施方式】
[0045]以下通過實(shí)施例來進(jìn)一步闡明本發(fā)明。但是應(yīng)該理解，所述實(shí)施例只是舉例說明的目的，并不意欲限制本發(fā)明的范圍和精神。
[0046]實(shí)施例1.DEV疫苗株基因組Fosmid文庫的構(gòu)建
[0047]按EPICENTRE 公司“CopyControI Fosmid Library Production Kit，，試劑盒說明書構(gòu)建DEV基因組的Fosmid文庫。
[0048]方法如下:將DEV疫苗株病毒(CVCC AV1222) (GeneBank EU082088)(中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心，目錄編號AV1222 ;購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所)DNA用物理方法即用25號針頭(購自上海治宇醫(yī)療器械有限公司)抽吸多次進(jìn)行切斷處理，用T4 DNA聚合酶(T4 DNA Polymerase,購自 New England Biolabs)及喊性憐酸酶(Alkaline Phosphatase,購自New England Biolabs)對DNA片段進(jìn)行末端平滑化及去磷酸化處理,脈沖電泳(用Bio-Rad公司CHEF Mapper?XA Pulsed Field系統(tǒng)進(jìn)行脈沖電泳，脈沖電泳的條件為:電泳緩沖液為0.5xTBE,瓊脂糖膠濃度為I %，程序?yàn)?K-80K)，回收38kbp_48kbp之間的DNA片段。將回收后的DEV DNA片斷兩端用T4連接酶連接上Fse 1-Sbf 1-Pme I接頭，精制后連接到pCCl Fos (購自EPICENTRE，圖譜見圖1)載體上，4°C過夜連接。對混和液進(jìn)行包裝，轉(zhuǎn)染大腸桿菌EPI300-T1 (購自EPICENTRE)。對文庫滴度進(jìn)行確認(rèn)，其試驗(yàn)過程如下:將包裝好的混和液進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別取10_2，ιοΛ ?ο-5, ?ο-6四個(gè)稀釋度的稀釋液10 μ I感染100 μ I ΕΡΙ300-Τ1細(xì)胞，將此菌涂于含12.5 μ g/ml氯霉素的LB平板，37°C過夜培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)量，并計(jì)算其滴度，結(jié)果為3.8xl05cfu/lib。即成功構(gòu)建DEV的fosmid文庫。
[0049]實(shí)施例2.用于拯救DEV病毒粘粒的選擇
[0050]文庫構(gòu)建成功后，挑取286個(gè)克隆提取粘粒，用堿裂解法[5]提取粘粒，送大連寶生物公司對插入pCCl Fos中的DEV DNA片段末端進(jìn)行測序，測序引物序列如下:
[0051]Primer 1:5’ -TAATACGACTCACTATAGGG-3’
[0052]Primer 2:5’ -GCCAAGCTATTTAGGTGAGA-3’[0053]經(jīng)過末端測序的分析，共得到插入片段兩端都連接有完整Fse 1-Sbf 1-Pme I接頭的克隆250個(gè)。從這250個(gè)克隆中選取多組用于拯救DEV的5粘粒組合。其中每組中克隆的DEV DNA片段兩端都含有Fse 1-Sbf 1-Pme I接頭，能相互重疊，且能拼接覆蓋全DEV
基因組。
[0054]實(shí)施例3.病毒拯救
[0055]用Qiagen公司的中量提取試劑盒提取所選擇的粘粒的DNA。用Fse 1、Sbf I或Pme I內(nèi)切酶(均購自New England Biolabs)對所選擇的粘粒進(jìn)行線性化處理,反應(yīng)條件如下:Sbf I內(nèi)切酶20U (也可以使用Fse I或Pme I內(nèi)切酶)，粘粒10 μ g，37°C作用I小時(shí)，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀制備轉(zhuǎn)染用DEV DNA。 [0056]參照Reddy SM (2002)的磷酸鈣方法將5段DEV DNA共轉(zhuǎn)染次代雞胚成纖維細(xì)胞(CEF) [22]，經(jīng)多次重復(fù)，其中有3組5粘粒組合轉(zhuǎn)染4-6天后可見CEF出現(xiàn)DEV病毒典型病變，選取重復(fù)性較好的一組5粘粒組合進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。收獲此組5粘粒共轉(zhuǎn)染拯救的病毒，命名為dDEV，用此dDEV與親本DEV病毒(即用于構(gòu)建該感染性克隆的親本病毒)分別接種次代CEF。
[0057]CEF的制備方法如下:取9-10日齡SPF雞胚，用酒精棉球消毒后，用碘酊擦拭氣室部位，脫碘后無菌取出雞胚，放置到盛有Hank’ s液(購自HyClone)的平皿中洗滌，并去除頭、四肢和內(nèi)臟，用剪刀剪碎。用0.25%的胰酶(4mL/胚)在37°C水浴中消化4_5分鐘，棄去胰酶，用Hank’s液洗滌2次。加入適量的含血清與雙抗(青霉素100u/mL，鏈霉素IOOmg/mL)的M199營養(yǎng)液(購自HyClone)，吹打使細(xì)胞分散，用四層紗布過濾后制成IO6-1O7細(xì)胞/毫升的細(xì)胞懸液，最后分裝于培養(yǎng)轉(zhuǎn)瓶中37°C旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)。36-48小時(shí)后，按毒種:細(xì)胞培養(yǎng)液體積為1: 1000將病毒接種于CEF。待細(xì)胞病變達(dá)到100%時(shí)，收集培養(yǎng)液；4°C 6000g離心10分鐘，去除細(xì)胞碎片；取上清50000g離心2小時(shí)富集病毒；然后經(jīng)20%和60%蔗糖密度梯度離心，50000g離心2小時(shí)，回收20%和60%中間層；之后經(jīng)50000g離心2小時(shí)超速離心脫糖處理獲得純化好的病毒。提取病毒全基因組DNAt23]，分別用BamH 1.EcoR I和BbvC 1(均購自New England Biolabs)對原疫苗株DEV和dDEV進(jìn)行酶切。反應(yīng)條件如下:分別取BamH I,EcoR I和BbvC I各20U，分別與DEV基因組DNA 8 μ g混和，于50 μ I體系中37°C作用I小時(shí)。用Bio-Rad公司CHEF Mapper(I) XA Pulsed Field系統(tǒng)進(jìn)行脈沖電泳，脈沖電泳的條件為:電泳緩沖液位0.5x TBE，瓊脂糖膠濃度為1%，程序?yàn)?K-70K。
[0058]拯獲的病毒酶切圖譜和親本病毒相同，如圖2所示。說明所選擇的5粘粒組成功拯救DEV病毒。本發(fā)明人將所選擇的5粘粒組成員分別命名為pFOSl、pF0S2、pF0S3、pF0S4、PF0S5，該5粘粒克隆所包含的DEV DNA片段兩端都含有Fse 1-Sbf 1-Pme I接頭，能相互重疊，且能拼接覆蓋全DEV基因組(它們的重疊和覆蓋模式可參見圖9)，并且其中pF0S5包含DEV基因組的US7和US8基因以及它們之間的間隔區(qū)(US7和US8基因之間的間隔區(qū)的核苷酸序列參見SEQ ID N0:6)。關(guān)于該5粘粒系統(tǒng)本發(fā)明人已經(jīng)申請專利，申請?zhí)枮?01010207207.8，題目為“鴨病毒性腸炎病毒疫苗株感染性克隆系統(tǒng)及其構(gòu)建方法和應(yīng)用”， 申請日期:為2010年6月13日。
[0059]實(shí)施例4.在DEV基因組的US7、US8基因之間的間隔區(qū)中分別插入SV40-HA表達(dá)框架(SEQ ID NO:1)和SV40-F表達(dá)框架(SEQ ID NO:2)的重組突變粘粒的構(gòu)建
[0060]基于上述實(shí)施例1-3結(jié)果，在所選擇的5粘粒組成員pF0S5中DEV基因組的US7和US8基因之間的間隔區(qū)(SEQ ID NO:6)中，具體地，US7和US8基因之間的間隔區(qū)共223bp，本研究中，該間隔區(qū)缺失了其中第108至111位的四個(gè)核苷酸，代之以分別插入SV40-HA和SV40-F表達(dá)框架(SV40-HA和SV40-F表達(dá)框架的核苷酸序列分別為SEQ ID NO:1和SEQID NO:2，其中包含SV40啟動子，參見圖12和圖13，其中斜體加下劃線部分分別來源于A/duck/Guangdong/S1322/2010 (H5N1)禽流感病毒血凝素 HA 基因(SEQ ID NO:5))和來源于新城疫病毒的LaSota毒株的新城疫病毒F基因(SEQ ID NO:7)。構(gòu)建2個(gè)重組突變粘粒，分別是pF0S5us78 SV40 HA和pF0S5us78 SV40 F(該突變粘粒的圖譜如圖8所示，其構(gòu)建模式可參見圖9)。在本研究中，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，HA基因的插入位置不影響其對鴨病毒性腸炎病毒的免疫效果。但HA基因插入其他位置，是否會影響其對鴨病毒性腸炎病毒的保護(hù)效果需要實(shí)驗(yàn)來證明。
[0061]F0S5us78 SV40 HA粘粒的構(gòu)建過程簡述如下:
[0062]4.1 pUC ccdB kan 的構(gòu)建:
[0063]用表1所示的三對引物(由TaKaRa公司合成)分別對Invitrogen公司GatewayVector Conversion System with One Shot ccdB Survival 2 Tl Competent Cells 試劑盒中提供的“RfA”(其中基因?yàn)閍atRl-氯霉素-ccdB-aatR2)基因(SEQ ID NO:3)進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。
[0064]表1:用于克隆“Rfkan” (其中基因?yàn)閍atRl-卡那霉素-ccdB_aatR2)基因的PCR
引物
[0065]
【權(quán)利要求】
1.鴨病毒性腸炎病毒弱毒疫苗株用于制備預(yù)防雞形目禽類疾病的重組病毒疫苗株的應(yīng)用，其中所述鴨病毒性腸炎病毒弱毒疫苗株用作攜帶外源性雞形目禽類病原基因在雞形目禽類中表達(dá)的表達(dá)載體。
2.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述鴨病毒性腸炎病毒弱毒疫苗株是CVCCAV1222。
3.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述外源性雞形目禽類病原基因選自禽流感病毒、新城疫病毒、禽法氏囊病病毒、或禽傳染性支氣管炎病毒等雞形目禽類常見傳染病病原的基因。
4.權(quán)利要求3的應(yīng)用，其中所述外源性雞形目禽類病原基因選自禽流感病毒血凝素HA基因、新城疫病毒的F基因或HN基因、或法氏囊病毒的VP2基因等。
5.權(quán)利要求1的應(yīng)用，其中所述雞形目禽類中的疾病選自由禽流感病毒引起的禽流感、由法氏囊病毒引起的法氏囊病、由新城疫病毒引起的雞新城疫病、禽傳染性支氣管炎病毒引起的雞傳染性支氣管炎病等。
6.一種表達(dá)新城疫病毒F基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株，其保藏編號為CCTCCV201220。
7.表達(dá)禽流感病毒血凝素HA基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株CCTCCV201125在制備用于預(yù)防雞形目禽類中的禽流感疾病的重組病毒疫苗中的應(yīng)用。
8.表達(dá)新城疫病毒F基因的重組鴨病毒性腸炎病毒疫苗株CCTCCV201220在制備用于預(yù)防雞形目禽類中的新城疫 疾病的重組病毒疫苗中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12R1/93GK103667351SQ201210331405
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2012年9月10日
【發(fā)明者】陳化蘭, 柳金雄, 步志高, 姜永萍 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所