專利名稱：紫球藻培養(yǎng)基配方及塑料薄膜袋半連續(xù)培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于海洋微藻養(yǎng)殖領(lǐng)域，尤其涉及紫球藻培養(yǎng)基配方及塑料薄膜袋半連續(xù)培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
紫球藻Porphyridium cruentum屬紅藻門、原紅藻綱、紫球藻目、紫球藻科、紫球藻屬，是ー種在不同生長階段呈現(xiàn)紫紅色或深紅色海洋單細(xì)胞微藻，含有豐富的花生四烯酸AA和二十碳五烯酸EPA等多不飽和脂肪酸PUFAs。AA和EPA是人體重要的必需脂肪酸，AA具有調(diào)節(jié)心臟興奮性、參與神經(jīng)內(nèi)分泌、促進(jìn)細(xì)胞分裂和抑制血小板聚集的功能，而EPA是人體合成前列腺素及其衍生物前列環(huán)素、凝血烷、白三烯的前體，可改善血脂質(zhì)量、降低膽固醇及血液黏度和血糖濃度，能有效治療和預(yù)防冠心病等心腦血管疾病以及抗炎、抗過敏作用。因紫球藻具有生長迅速、代時短、可實(shí)現(xiàn)高密度培養(yǎng)的特點(diǎn)，為エ業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn) PUFAs提供有利條件，因此紫球藻正成為人們獲取高產(chǎn)量PUFAs的重要來源。一般來說，適合于培養(yǎng)單細(xì)胞藻類的培養(yǎng)基都可用于紫球藻的培養(yǎng)，這些培養(yǎng)基包括人工海水培養(yǎng)基ASW、KOCH培養(yǎng)基、Harder-Bederke培養(yǎng)基、PringsheinI培養(yǎng)基和PringsheinII培養(yǎng)基等。王長海對紫球藻在無通氣的ASW、海水基礎(chǔ)培養(yǎng)基SBM與海水培養(yǎng)基ASW中的生長情況進(jìn)行了對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SBM更適合紫球藻的生長。通過對培養(yǎng)基成分的分析，顯示通過加富的海水可有效促進(jìn)該藻的生長，而由人工配制的海水缺乏天然海水所特有的某些微量元素而在生長方面受到限制。在未通入CO2的情況下，HCO3-是該藻可利用的唯一碳源，NaHCO3濃度的高低決定其生長的快慢。作為單細(xì)胞的光合自養(yǎng)生物，CO2無疑是影響紫球藻生長的主要營養(yǎng)因子。無機(jī)碳源的另外ー個來源是碳酸氫鹽，紫球藻在光合作用中具有利用質(zhì)膜轉(zhuǎn)化碳酸氫鹽的能力，因此，NaHCO3等可作為此種藻的主要碳源。在其它生長條件適合的情況下，這些無機(jī)碳源濃度的高低決定著該藻生長的快慢。對比實(shí)驗(yàn)揭示高濃度的NaHCO3可使藻體在對數(shù)期的生長速率有效提高。相對于NaHCO3來說，黃俊輝研究證實(shí)在相同條件下以CO2為碳源在生長速率、生物量產(chǎn)量和生物量產(chǎn)率方面，比NaHCO3對照組分別高I. 85,1. 47和I. 76倍。Akimoto研究了在30°C,120001x光照、通入5% CO2情況下紫球藻的生長情況，結(jié)果獲得I. 18g/L-d的生物量及O. 66g/L-d的CO2固定量。除了營自養(yǎng)生活外，有研究顯示紫球藻也可利用葡萄糖等有機(jī)碳源。通入CO2效果較好，但成本較高，設(shè)備復(fù)雜，故生產(chǎn)中使用NaHCO3更經(jīng)濟(jì)合算且操作簡便易行。溫度、光照、鹽度、營養(yǎng)鹽等對紫球藻生長都有重要影響。氮在細(xì)胞代謝中是形成氨基酸、嘌呤、嘧啶、葉啉、氨基糖和胺化合物等的基本元素，因而氮是紫球藻生長最重要的營養(yǎng)元素。有研究認(rèn)為硝酸態(tài)氮是紫球藻生長的最佳氮源。我的實(shí)驗(yàn)顯示NH4NO3用作氮源無論對細(xì)胞密度的増加、不飽和脂肪酸PUFAs的積累等方面的效果均優(yōu)于NaNO3和NH4Cl,這可能是其中的兩種離子N03_和NH4+均可被利用，作用互補(bǔ)，且可保持溶液中離子及pH平衡的結(jié)果。在有機(jī)氮是否也能促進(jìn)紫球藻生長的問題上，存在著爭論，肖華山等研究了 4種無機(jī)氮源NaNO3, KNO3, NH4NO3, (NH4) 2S04與ー種有機(jī)氮源尿素對紫球藻生長的影響，結(jié)果表明硝酸鹽中的no3_作為硝酸還原酶的誘導(dǎo)底物，可增強(qiáng)酶的活性，有利于合成蛋白質(zhì)從而促進(jìn)該藻的生長；銨鹽中的NH4+在一個較低的濃度范圍內(nèi)可以被紫球藻所吸收利用，但當(dāng)超過這ー濃度時，就會對藻體產(chǎn)生抑制和破壞作用，總體表現(xiàn)上銨鹽不利于其生長；而作為有機(jī)氮源的尿素，對紫球藻的毒害較小。陳比鏈等通過單因素實(shí)驗(yàn)和均勻設(shè)計(jì)的數(shù)學(xué)方法對紫球藻生長所需的主要營養(yǎng)進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明添加碳源、氮源、磷源和VB12在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對紫球藻的生長有顯著影響，而VB1和Fe-EDTA對紫球藻的生長沒有明顯的促進(jìn)作用。在此基礎(chǔ)上了獲得了以海水為基礎(chǔ)、穩(wěn)定高產(chǎn)的培養(yǎng)基配方NaHC032. 755g/L，NaNOs3. 224g/L, KH2PO4O. 035g/L, VB122. 772 μ g/L, VB1O. 9mg/L, Fe-EDTA 0. llmg/L。但我用自己發(fā)明的新營養(yǎng)鹽配方培養(yǎng)紫球藻，產(chǎn)量更高，可以提高產(chǎn)量78 %。微藻產(chǎn)業(yè)發(fā)展的前提條件是獲得充足的生物質(zhì)原料。微藻培養(yǎng)模式的選擇是提高微藻生物質(zhì)產(chǎn)量的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此培養(yǎng)模式一直是國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)之一。目前廣泛使用的微藻培養(yǎng)模式主要有批次培養(yǎng)(即一次性培養(yǎng))、流加培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)。微藻批次培養(yǎng)是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)普遍采用的一種培養(yǎng)方式，具有操作簡單，成本低的優(yōu)點(diǎn)。缺點(diǎn)是在進(jìn)行批次培養(yǎng)時，微藻消耗營養(yǎng)鹽尤其是氮、磷的速度較快，容易造成培養(yǎng)液中氮、磷營養(yǎng)鹽的缺乏，藻細(xì)胞的生長和增殖受到限制。這個問題在培養(yǎng)的中后期尤其嚴(yán)重。流加培 養(yǎng)也稱為分批補(bǔ)料培養(yǎng)，是指在培養(yǎng)過程中向培養(yǎng)液中添加一種或多種營養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)方法。連續(xù)培養(yǎng)是指以一定的流速連續(xù)向培養(yǎng)系統(tǒng)內(nèi)添加新鮮培養(yǎng)液，同時以相同的速度流出培養(yǎng)液，使反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞生長環(huán)境處于恒定狀態(tài)。流加培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)模式可有效調(diào)節(jié)藻細(xì)胞生長過程中的營養(yǎng)鹽濃度，使培養(yǎng)液中營養(yǎng)鹽濃度維持在合適水平，既能減輕較高初始營養(yǎng)鹽濃度引起的抑制和毒害作用，使藻體生長的延遲期大大縮短，又能有效解決批次培養(yǎng)中營養(yǎng)鹽限制問題，保證營養(yǎng)鹽的持續(xù)供給使微藻長時間處于對數(shù)生長期，提高了增殖效率，但實(shí)際應(yīng)用中操作麻煩，設(shè)備較復(fù)雜，成本高。我的實(shí)驗(yàn)證實(shí)，半連續(xù)培養(yǎng)模式是紫球藻規(guī)模生產(chǎn)的最佳培養(yǎng)方式。半連續(xù)培養(yǎng)可及時補(bǔ)充培養(yǎng)基中的營養(yǎng)鹽，特別是在培養(yǎng)的后期，保證紫球藻對營養(yǎng)鹽中必需養(yǎng)分的充分?jǐn)z取，而且操作簡單、方便、易行。在氮限制的培養(yǎng)基中，因營養(yǎng)鹽更新率的升高而增加了氮源的濃度，使得紫球藻細(xì)胞生長過程中始終保持合適的氮源濃度，可以大大延長藻細(xì)胞的生長時間，使產(chǎn)量提高78%。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服目前技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種紫球藻培養(yǎng)基配方，其特征在于該紫球藻培養(yǎng)基配方如下NH4N0330. 2毫克，KH2P048毫克，NaHC03504毫克，九ニ O植物生長刺激素(即赤霉素)6國際單位,A8微量元素溶液3毫升，f/2維生素溶液I毫升,人尿I. 5-2毫升，消毒海水1000毫升；其中A8微量元素溶液配方=Fe 0.4克，MnCl2 O. 05克，ZnSO4 O. 005克，CuSO4 O. 002 克，H3BO3 O. 05 克，MoO3 O. 001 克，V O. 001 克，Co (NO3) 2 O. 001 克，O. 05mol/L的H2SO4 300毫升；f/2維生素溶液配方維生素B12O. 5毫克，維生素B1IOO毫克，維生素HO. 5暈克，純水1000暈升。紫球藻的塑料薄膜袋半連續(xù)培養(yǎng)方法，包括如下步驟采用長度450厘米、周長200厘米的農(nóng)用聚こ烯透明塑料薄膜袋培養(yǎng)，兩頭分別用紗布扎ロ ；一端扎入I根充氣管，末端連2個散氣石，作散氣用；塑料袋另一端扎入ー根長約20厘米，直徑6厘米的聚こ烯硬管，作出氣管，此袋即為培養(yǎng)藻的容器；將此袋漂浮在盛有普通海水的水泥池中，水泥池長X寬X深=600厘米X400厘米X85厘米，塑料袋兩端扎好后，用繩吊起，以防袋ロ沉入水中，向袋中加入O. 8 I. 4立方米的培養(yǎng)液并接入藻種，即可進(jìn)行培養(yǎng)；每池吊袋6-8個；培養(yǎng)用的海水鹽度20-30%。，用次氯酸鈉消毒法消毒，方法是I立方米海水中加入漂白液200-300mL，使海水中有效氯含量達(dá)到10_20mg/L，充氣8-12小時后，用硫代硫酸鈉中和余氯。硫代硫酸鈉量由余氯的多少來確定，直到滴入淀粉碘化鉀液不變色為止；按權(quán)利要求I所述的培養(yǎng)基配方加入營養(yǎng)鹽，選純種的對數(shù)生長期藻種接種，即生長良好、生活力旺盛、色澤鮮艷、無沉淀及無明顯附壁現(xiàn)象的藻種，鏡檢無其它雜藻、原生動物等；接種密度30X 104cell/mL，室外培養(yǎng)，自然光照射，溫度22_30°C，光強(qiáng)4000-80001x為最佳，氣泵充入空氣，充氣量不宜太大，以藻細(xì)胞浮起不下沉即可，充氣管末端連兩個氣石；夜間停止充氣，白天行間隔充氣，即充氣I小時，停I小時，重復(fù)進(jìn)行；培養(yǎng)4-6天，密度達(dá)100 X 104-200 X 104cell/mL,采收藻液的1/3，補(bǔ)加相同體積的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，48小時后再采收藻液的1/3，補(bǔ)加相同體積的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，如此循環(huán)進(jìn)行，5-7個循環(huán)周期后即可全部采收。一種紫球藻培養(yǎng)基配方，該紫球藻培養(yǎng)基配方如下NH4N0330. 2毫克，KH2PO4S毫 克，NaHC03504毫克，九ニ O植物生長刺激素(即赤霉素)6國際單位，A8微量元素溶液3毫升，f/2維生素溶液I毫升，人尿I. 5-2毫升，消毒海水1000毫升；其中A8微量元素溶液配方KNO3O. 2g/L, Cacl22H02l. 2g/L, Fe O. 4g, MnCl2O. 05g, NaNO3O. 05g, ZnSO4O. 005g,CuSO4O. 002g, H3BO3O. 05g, MoO3O. OOlg,復(fù)合維生素 B 注射液 0. OOlg, Co(NO3)2O. OOlg,0. 05mol/L的H2SO4 300毫升；f/2維生素溶液配方維生素B12O. 5毫克，維生素B1IOO毫克，維生素H 0. 5毫克，葡萄糖0. Olg,木糖0. Olg,乳糖0. Olg,純水1000毫升。，紫球藻的塑料薄膜袋半連續(xù)培養(yǎng)方法，包括如下步驟采用長度450厘米、周長200厘米的農(nóng)用聚こ烯透明塑料薄膜袋培養(yǎng)，兩頭分別用紗布扎ロ ；一端扎入I根充氣管，末端連2個散氣石，作散氣用；塑料袋另一端扎入ー根長約20厘米，直徑6厘米的聚こ烯硬管，作出氣管，此袋即為培養(yǎng)藻的容器；將此袋漂浮在盛有普通海水的水泥池中，水泥池長X寬X深=600厘米X400厘米X85厘米，塑料袋兩端扎好后，用繩吊起，以防袋ロ沉入水中，向袋中加入0. 8 I. 4立方米的培養(yǎng)液并接入藻種，即可進(jìn)行培養(yǎng)；每池吊袋6-8個；培養(yǎng)用的海水鹽度20-30%。，用次氯酸鈉消毒法消毒，方法是I立方米海水中加入漂白液200-300mL，使海水中有效氯含量達(dá)到10_20mg/L，充氣8-12小時后，用硫代硫酸鈉中和余氯。硫代硫酸鈉量由余氯的多少來確定，直到滴入淀粉碘化鉀液不變色為止；按權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)基配方加入營養(yǎng)鹽，選純種的對數(shù)生長期藻種接種，即生長良好、生活力旺盛、色澤鮮艷、無沉淀及無明顯附壁現(xiàn)象的藻種，鏡檢無其它雜藻、原生動物等；接種密度30X 104Cell/mL，室外培養(yǎng)，自然光照射，溫度21_26°C，光強(qiáng)4000-80001x為最佳，氣泵充入空氣，充氣量不宜太大，以藻細(xì)胞浮起不下沉即可，充氣管末端連兩個氣石；夜間停止充氣，白天行間隔充氣，即充氣I小時，停I小時，重復(fù)進(jìn)行；培養(yǎng)4-6天，密度達(dá)100X 104-200X 104Cell/mL，采收藻液的1/3，補(bǔ)加相同體積的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，48小時后再采收藻液的1/3，補(bǔ)加相同體積的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，如此循環(huán)進(jìn)行，5-7個循環(huán)周期后即可全部采收。一種紫球藻培養(yǎng)基配方，該紫球藻培養(yǎng)基配方如下NH4N0330. 2毫克，KH2PO4S毫克，NaHC03504毫克，九ニ O植物生長刺激素(即赤霉素)6國際單位，A8微量元素溶液3毫升，f/2維生素溶液I毫升，人尿I. 5毫升，消毒海水1000毫升；其中A8微量元素溶液配方FeC6H5070. 0025g/L, KNO3O. 2g/L, Cacl22H02l. 2g/L, Fe 0. 4g, MnCl2O. 05g, NaNO3O. 05g,ZnSO4O. 005g, CuSO4 0. 002g, H3BO3 0. 05g, MoO3 0. OOlg，復(fù)合維生素 B 注射液 O. OOlg,Co (NO3)2 O. OOlg, O. 05mol/L的H2SO4 300毫升ば/2維生素溶液配方維生素B12O. 5毫克，維生素B1IOO毫克，維生素H O. 5毫克，葡萄糖O. Olg,木糖O. Olg,乳糖O. Olg,純水1000毫升。紫球藻的塑料薄膜袋半連續(xù)培養(yǎng)方法，包括如下步驟采用長度450厘米、周長200厘米的農(nóng)用聚こ烯透明塑料薄膜袋培養(yǎng)，兩頭分別用紗布扎ロ ；一端扎入I根充氣管，末端連2個散氣石，作散氣用；塑料袋另一端扎入ー根長約20厘米，直徑6厘米的聚こ烯硬管，作出氣管，此袋即為培養(yǎng)藻的容器；將此袋漂浮在盛有普通海水的水泥池中，水泥池長X寬X深=600厘米X400厘米X85厘米，塑料袋兩 端扎好后，用繩吊起，以防袋ロ沉入水中，向袋中加入O. 8 I. 4立方米的培養(yǎng)液并接入藻種，即可進(jìn)行培養(yǎng)；每池吊袋6-8個；培養(yǎng)用的海水鹽度20-30%。，用次氯酸鈉消毒法消毒，方法是I立方米海水中加入漂白液200-300mL，使海水中有效氯含量達(dá)到10_20mg/L，充氣8-12小時后，用硫代硫酸鈉中和余氯。硫代硫酸鈉量由余氯的多少來確定，直到滴入淀粉碘化鉀液不變色為止；按權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)基配方加入營養(yǎng)鹽，選純種的對數(shù)生長期藻種接種，即生長良好、生活力旺盛、色澤鮮艷、無沉淀及無明顯附壁現(xiàn)象的藻種，鏡檢無其它雜藻、原生動物等；接種密度30X 104Cell/mL，室外培養(yǎng)，自然光照射，溫度21_26°C，光強(qiáng)4000-80001x為最佳，氣泵充入空氣，充氣量不宜太大，以藻細(xì)胞浮起不下沉即可，充氣管末端連兩個氣石；夜間停止充氣，白天行間隔充氣，即充氣I小時，停I小時，重復(fù)進(jìn)行；培養(yǎng)4-6天，密度達(dá)100 X 104-200 X 104cell/mL,采收藻液的1/3，補(bǔ)加相同體積的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，48小時后再采收藻液的1/3，補(bǔ)加相同體積的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，如此循環(huán)進(jìn)行，5-7個循環(huán)周期后即可全部采收。一種紫球藻培養(yǎng)基配方，該紫球藻培養(yǎng)基配方如下=NH4NO3 30. 2毫克，KH2PO4S毫克，NaHC03504毫克，九ニ O植物生長刺激素(即赤霉素)6國際單位，A8微量元素溶液3毫升，f/2維生素溶液I毫升，人尿I. 5毫升，消毒海水1000毫升；其中A8微量元素溶液配方FeC6H5O7O. 0025g/L，土壤浸出液 10ml,KNO3O. 2g/L,Cacl22H02l. 2g/L，F(xiàn)e O. 4g,MnCl2 0. 05g,NaNO3O. 05g, ZnSO4 0. 005g, CuSO4 0. 002g, H3BO3 0. 05g, MoO3 0. OOlg, V 0. OOlg, Co (NO3) 20. 001g，0. 05mol/L的H2SO4 300毫升ば/2維生素溶液配方:維生素B12O. 5毫克，維生素B1IOO毫克，維生素H 0. 5毫克，葡萄糖0. Olg,木糖0. Olg,乳糖0. Olg,純水1000毫升。紫球藻的塑料薄膜袋半連續(xù)培養(yǎng)方法，包括如下步驟采用長度450厘米、周長200厘米的農(nóng)用聚こ烯透明塑料薄膜袋培養(yǎng)，兩頭分別用紗布扎ロ ；一端扎入I根充氣管，末端連2個散氣石，作散氣用；塑料袋另一端扎入ー根長約20厘米，直徑6厘米的聚こ烯硬管，作出氣管，此袋即為培養(yǎng)藻的容器；將此袋漂浮在盛有普通海水的水泥池中，水泥池長X寬X深=600厘米X 400厘米X85厘米，塑料袋兩端扎好后，用繩吊起，以防袋ロ沉入水中，向袋中加入0. 8 I. 4立方米的培養(yǎng)液并接入藻種，即可進(jìn)行培養(yǎng)；每池吊袋6-8個；培養(yǎng)用的海水鹽度20-30%。，用次氯酸鈉消毒法消毒，方法是I立方米海水中加入漂白液200-300mL，使海水中有效氯含量達(dá)到10_20mg/L，充氣8-12小時后，用硫代硫酸鈉中和余氯。硫代硫酸鈉量由余氯的多少來確定，直到滴入淀粉碘化鉀液不變色為止；按權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)基配方加入營養(yǎng)鹽，選純種的對數(shù)生長期藻種接種，即生長良好、生活力旺盛、色澤鮮艷、無沉淀及無明顯附壁現(xiàn)象的藻種，鏡檢無其它雜藻、原生動物等；接種密度30X 104Cell/mL，室外培養(yǎng)，自然光照射，溫度21_26°C，光強(qiáng)4000-80001x為最佳，氣泵充入空氣，充氣量不宜太大，以藻細(xì)胞浮起不下沉即可，充氣管末端連兩個氣石；夜間停止充氣，白天行間隔充氣，即充氣I小時，停I小時，重復(fù)進(jìn)行；培養(yǎng)4-6天，密度達(dá)100 X 104-200 X 104cell/mL,采收藻液的1/3，補(bǔ)加相同體積的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，48小時后再采收藻液的1/3，補(bǔ)加相同體積的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，如此循環(huán)進(jìn)行，5-7個循環(huán)周期后即可全部采收。土壌浸出液的提取步驟為(I)從野外取回有代表性的土壤樣品，在105 115°C下烘干。(2)稱取5g干燥的土壤樣品，放入50mL干燥的錐形瓶中，加入25mL0. 5mol/L的碳酸氫鈉浸提液.用玻璃棒把土壤攪散.再加入半藥匙活性炭，劇烈振蕩I 2分鐘后靜置 5 10分鐘，過濾后得到的濾液是土壌浸出液。有益效果紫球藻的培養(yǎng)傳統(tǒng)上使用SBM培養(yǎng)液配方，生長速度慢，產(chǎn)量低。我的實(shí)驗(yàn)表明，用NH4NO3作氮源，添加適量的NaHCO3并補(bǔ)充了九ニ O植物生長刺激素(即赤霉素)、A8微量元素、f/2維生素，營養(yǎng)更均衡、全面，大大加快了紫球藻的生長速度，產(chǎn)量可以提高78%。紫球藻的培養(yǎng)方式，我用塑料薄膜袋半連續(xù)培養(yǎng)方法培養(yǎng)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的開放水泥池，使得微藻細(xì)胞在生長過程中始終保持合適的營養(yǎng)鹽濃度，易于操作、不易污染、易于掌控、靈活多祥、不易劃破、安全可靠，透光性好，成本低，生長快，產(chǎn)量可提高78%。


圖I為塑料薄膜懸浮吊袋半連續(xù)方法培養(yǎng)紫球藻示意圖其中附圖標(biāo)記為1塑料薄膜袋2水泥池3藻液4進(jìn)氣管5出氣管6散氣石7普通海水
具體實(shí)施例方式培養(yǎng)基配制方法I)九ニ O植物生長刺激素(即赤霉素)為白色結(jié)晶粉末，不易溶解于水，可先用酒精充分溶解(一般每克用50毫升酒精或60度白酒溶解I小時以上)，再按所需濃度兌水稀釋；2)加營養(yǎng)鹽的過程中需不斷攪水，而且各種營養(yǎng)鹽按配方中提供的順序加入，以免發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；3)各種營養(yǎng)鹽特別是A8微量元素溶液和f/2維生素溶液均需預(yù)先配成母液備用；但放置時間不要超過7天，且最好4°C冰箱冷藏保存；4)全部營養(yǎng)鹽加完后再充氣攪拌15分鐘，即可接種；5)所有藥品純度均需化學(xué)純級別；6)此培養(yǎng)基配方對紫球藻擴(kuò)種階段和大規(guī)模培養(yǎng)等各階段都適用。紫球藻塑料薄膜袋半連續(xù)培養(yǎng)方法，參見附圖
采用長度450厘米、周長200厘米的農(nóng)用聚こ烯透明塑料薄膜袋培養(yǎng)，兩頭分別用紗布扎ロ。一端扎入I根充氣管，末端連2個散氣石，作散氣用；塑料袋另一端扎入ー根長約20厘米，直徑6厘米的聚こ烯硬管，作出氣管，此袋即為培養(yǎng)藻的容器。將此袋漂浮在盛有普通海水的水泥池中，水泥池長X寬X深=600厘米X400厘米X85厘米，塑料袋兩端扎好后，用繩吊起，以防袋ロ沉入水中，向袋中加入O. 8 I. 4立方米的培養(yǎng)液并接入藻種，即可進(jìn)行培養(yǎng)。每池吊袋6-8個。培養(yǎng)用的海水鹽度20-30%。，用次氯酸鈉消毒法消毒，方法是I立方米海水中加入漂白液200-300mL，使海水中有效氯含量達(dá)到10_20mg/L，充氣8-12小時后，用硫代硫酸鈉中和余氯。硫代硫酸鈉量由余氯的多少來確定，直到滴入淀粉碘化鉀液不變色為止。按上述培養(yǎng)基配方加入營養(yǎng)鹽，選純種的對數(shù)生長期藻種接種，即生長良好、生活力旺盛、色澤鮮艷、無沉淀及無明顯附壁現(xiàn)象的藻種，鏡檢無其它雜藻、原生動物等。接種密度30X 104cell/mL，室外培養(yǎng)，自然光照射，溫度22_30°C，光強(qiáng)4000_80001χ為最佳，氣泵充入空氣，充氣量不宣太大，以藻細(xì)胞浮起不下沉即可，充氣管末端連兩個氣石。夜間停止充氣，白天行間隔充氣，即充氣I小時，停I小時，重復(fù)進(jìn)行。培養(yǎng)4-6天，密度達(dá)100X 104-200X 104cell/mL，采收藻液的1/3，補(bǔ)加相同體積的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，48小時后再采收藻液的1/3，補(bǔ)加相同體積的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，如此循環(huán)進(jìn)行，5-7個循環(huán) 周期后即可全部采收。最后應(yīng)說明的是以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其限制；盡管參照前述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解其依然可以對前述實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明實(shí)施例技術(shù)方案的精神和范圍。
權(quán)利要求
1.一種紫球藻培養(yǎng)基配方，其特征在于該紫球藻培養(yǎng)基配方如下NH4NO3 30. 2毫克，KH2PO4 8毫克，NaHCO3 504毫克，九二 0植物生長刺激素(即赤霉素)6國際單位，A8微量元素溶液3毫升，f/2維生素溶液I毫升，人尿I. 5-2毫升，消毒海水1000毫升；其中A8微量元素溶液配方Fe 0. 4 克，MnCl2 0. 05 克，ZnSO4 0. 005 克，CuSO4 0. 002 克，H3BO3 0. 05 克，MoO3 0.001 克，V 0. 001 克，Co (NO3)2 0. 001 克，0. 05mol/L 的 H2SO4 300 毫升；f/2 維生素溶液配方維生素B12 0. 5毫克,維生素B1IOO毫克,維生素H 0. 5毫克,純水1000毫升。
2.紫球藻的塑料薄膜袋半連續(xù)培養(yǎng)方法，其特征在于包括如下步驟 采用長度450厘米、周長200厘米的農(nóng)用聚乙烯透明塑料薄膜袋培養(yǎng)，兩頭分別用紗布扎口 ；一端扎入I根充氣管，末端連2個散氣石，作散氣用；塑料袋另一端扎入一根長約20厘米，直徑6厘米的聚乙烯硬管，作出氣管，此袋即為培養(yǎng)藻的容器；將此袋漂浮在盛有普通海水的水泥池中，水泥池長X寬X深=600厘米X400厘米X85厘米，塑料袋兩端扎好后，用繩吊起，以防袋口沉入水中，向袋中加入0. 8 I. 4立方米的培養(yǎng)液并接入藻種，即可進(jìn)行培養(yǎng)；每池吊袋6-8個；培養(yǎng)用的海水鹽度20-30%。，用次氯酸鈉消毒法消毒，方法是I立方米海水中加入漂白液200-300mL，使海水中有效氯含量達(dá)到10_20mg/L，充氣8-12小時后，用硫代硫酸鈉中和余氯。硫代硫酸鈉量由余氯的多少來確定，直到滴入淀粉碘化鉀液不變色為止；按權(quán)利要求I所述的培養(yǎng)基配方加入營養(yǎng)鹽，選純種的對數(shù)生長期藻種接種，即生長良好、生活力旺盛、色澤鮮艷、無沉淀及無明顯附壁現(xiàn)象的藻種，鏡檢無其它雜藻、原生動物等；接種密度30X 104cell/mL，室外培養(yǎng)，自然光照射，溫度22_30°C，光強(qiáng)4000-80001x為最佳，氣泵充入空氣，充氣量不宜太大，以藻細(xì)胞浮起不下沉即可，充氣管末端連兩個氣石；夜間停止充氣，白天行間隔充氣，即充氣I小時，停I小時，重復(fù)進(jìn)行；培養(yǎng)4-6天，密度達(dá)100 X 104-200 X 104cell/mL,采收藻液的1/3，補(bǔ)加相同體積的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，48小時后再采收藻液的1/3，補(bǔ)加相同體積的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，如此循環(huán)進(jìn)行，5-7個循環(huán)周期后即可全部采收。
3.一種紫球藻培養(yǎng)基配方，其特征在于該紫球藻培養(yǎng)基配方如下NH4NO3 30. 2毫克，KH2P048毫克，NaHC03504毫克，九二 0植物生長刺激素(即赤霉素)6國際單位，A8微量元素溶液3毫升，f/2維生素溶液I毫升，人尿I. 5-2毫升，消毒海水1000毫升；其中A8微量元素溶液配方KNO3O. 2g/L, Cacl22H02l. 2g/L, Fe 0. 4g, MnCl2O. 05g, NaNO3O. 05g, ZnSO4O. 005g,CuSO4 0. 002g, H3BO3 0. 05g, MoO3 0. OOlg，復(fù)合維生素 B 注射液 0. OOlg，Co (NO3) 2 0. OOlg,0.0511101/1的H2SO4 300毫升；f/2維生素溶液配方維生素B12O. 5毫克，維生素&100毫克，維生素H 0. 5毫克，葡萄糖0. Olg,木糖0. Olg,乳糖0. Olg,純水1000毫升。
4.紫球藻的塑料薄膜袋半連續(xù)培養(yǎng)方法，其特征在于包括如下步驟 采用長度450厘米、周長200厘米的農(nóng)用聚乙烯透明塑料薄膜袋培養(yǎng)，兩頭分別用紗布扎口 ；一端扎入I根充氣管，末端連2個散氣石，作散氣用；塑料袋另一端扎入一根長約20厘米，直徑6厘米的聚乙烯硬管，作出氣管，此袋即為培養(yǎng)藻的容器；將此袋漂浮在盛有普通海水的水泥池中，水泥池長X寬X深=600厘米X 400厘米X 85厘米，塑料袋兩端扎好后，用繩吊起，以防袋口沉入水中，向袋中加入0. 8 I. 4立方米的培養(yǎng)液并接入藻種，即可進(jìn)行培養(yǎng)；每池吊袋6-8個；培養(yǎng)用的海水鹽度20-30%。，用次氯酸鈉消毒法消毒，方法是I立方米海水中加入漂白液200-300mL，使海水中有效氯含量達(dá)到10_20mg/L，充氣8-12小時后，用硫代硫酸鈉中和余氯。硫代硫酸鈉量由余氯的多少來確定，直到滴入淀粉碘化鉀液不變色為止；按權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)基配方加入營養(yǎng)鹽，選純種的對數(shù)生長期藻種接種，即生長良好、生活力旺盛、色澤鮮艷、無沉淀及無明顯附壁現(xiàn)象的藻種，鏡檢無其它雜藻、原生動物等；接種密度30X 104cell/mL，室外培養(yǎng)，自然光照射，溫度21_26°C，光強(qiáng)4000-80001x為最佳，氣泵充入空氣，充氣量不宜太大，以藻細(xì)胞浮起不下沉即可，充氣管末端連兩個氣石；夜間停止充氣，白天行間隔充氣，即充氣I小時，停I小時，重復(fù)進(jìn)行；培養(yǎng)4-6天，密度達(dá)100 X 104-200 X 104cell/mL,采收藻液的1/3，補(bǔ)加相同體積的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，48小時后再采收藻液的1/3，補(bǔ)加相同體積的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，如此循環(huán)進(jìn)行，5-7個循環(huán)周期后即可全部采收。
5.一種紫球藻培養(yǎng)基配方，其特征在于該紫球藻培養(yǎng)基配方如下=NH4NO3O. 2毫克，KH2P048毫克，NaHC03504毫克，九二 0植物生長刺激素(即赤霉素)6國際單位，A8微量元素溶液3毫升，f/2維生素溶液I毫升，人尿I. 5毫升，消毒海水1000毫升；其中A8微量元素溶液配方FeC6H5O7 0. 0025g/L, KNO3O. 2g/L, Cacl22H02l. 2g/L, Fe 0. 4g, MnCl2O. 05g,NaNO3O. 05g, ZnSO4O. 005g, CuSO4O. 002g, H3BO3 0. 05g, MoO3 0. OOlg,復(fù)合維生素 B 注射液·0.OOlg, Co (NO3)2 0.001g，0.05mol/I^3 H2SO4 300 毫升;f/2 維生素溶液配方:維生素B12O. 5毫克，維生素B1IOO毫克，維生素H 0. 5毫克，葡萄糖0. Olg,木糖0. Olg,乳糖0. Olg,純水1000暈升。
6.紫球藻的塑料薄膜袋半連續(xù)培養(yǎng)方法，其特征在于包括如下步驟 采用長度450厘米、周長200厘米的農(nóng)用聚乙烯透明塑料薄膜袋培養(yǎng)，兩頭分別用紗布扎口 ；一端扎入I根充氣管，末端連2個散氣石，作散氣用；塑料袋另一端扎入一根長約20厘米，直徑6厘米的聚乙烯硬管，作出氣管，此袋即為培養(yǎng)藻的容器；將此袋漂浮在盛有普通海水的水泥池中，水泥池長X寬X深=600厘米X400厘米X85厘米，塑料袋兩端扎好后，用繩吊起，以防袋口沉入水中，向袋中加入0. 8 I. 4立方米的培養(yǎng)液并接入藻種，即可進(jìn)行培養(yǎng)；每池吊袋6-8個；培養(yǎng)用的海水鹽度20-30%。，用次氯酸鈉消毒法消毒，方法是I立方米海水中加入漂白液200-300mL，使海水中有效氯含量達(dá)到10_20mg/L，充氣8-12小時后，用硫代硫酸鈉中和余氯。硫代硫酸鈉量由余氯的多少來確定，直到滴入淀粉碘化鉀液不變色為止；按權(quán)利要求5所述的培養(yǎng)基配方加入營養(yǎng)鹽，選純種的對數(shù)生長期藻種接種，即生長良好、生活力旺盛、色澤鮮艷、無沉淀及無明顯附壁現(xiàn)象的藻種，鏡檢無其它雜藻、原生動物等；接種密度30X 104cell/mL，室外培養(yǎng)，自然光照射，溫度21_26°C，光強(qiáng)4000-80001x為最佳，氣泵充入空氣，充氣量不宜太大，以藻細(xì)胞浮起不下沉即可，充氣管末端連兩個氣石；夜間停止充氣，白天行間隔充氣，即充氣I小時，停I小時，重復(fù)進(jìn)行；培養(yǎng)4-6天，密度達(dá)100 X 104-200 X 104cell/mL,采收藻液的1/3，補(bǔ)加相同體積的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，48小時后再采收藻液的1/3，補(bǔ)加相同體積的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，如此循環(huán)進(jìn)行，5-7個循環(huán)周期后即可全部采收。
7.一種紫球藻培養(yǎng)基配方，其特征在于該紫球藻培養(yǎng)基配方如下NH4N0330. 2毫克，KH2P048毫克，NaHC03504毫克，九二 0植物生長刺激素(即赤霉素)6國際單位，A8微量元素溶液3毫升，f/2維生素溶液I毫升，人尿I. 5毫升，消毒海水1000毫升；其中A8微量元素溶液配方FeC6H5070. 0025g/L，土壤浸出液 10ml，KNO3O. 2g/L，Cacl22H02l. 2g/L，F(xiàn)e·0.4g, MnCl2O. 05g, NaNO3O. 05g, ZnSO4 0. 005g, CuSO4 0. 002g, H3BO3 0. 05g, MoO3 0. OOlg, V·0.OOlg, Co (NO3)2 0.001g，0.05mol/I^3 H2SO4 300 毫升;f/2 維生素溶液配方:維生素B12O. 5毫克，維生素B1IOO毫克，維生素H 0. 5毫克，葡萄糖0. Olg,木糖0. Olg,乳糖0. Olg,純水1000暈升。
8.紫球藻的塑料薄膜袋半連續(xù)培養(yǎng)方法，其特征在于包括如下步驟 采用長度450厘米、周長200厘米的農(nóng)用聚乙烯透明塑料薄膜袋培養(yǎng)，兩頭分別用紗布扎口 ；一端扎入I根充氣管，末端連2個散氣石，作散氣用；塑料袋另一端扎入一根長約20厘米，直徑6厘米的聚乙烯硬管，作出氣管，此袋即為培養(yǎng)藻的容器；將此袋漂浮在盛有普通海水的水泥池中，水泥池長X寬X深=600厘米X 400厘米X 85厘米，塑料袋兩端扎好后，用繩吊起，以防袋口沉入水中，向袋中加入0. 8 I. 4立方米的培養(yǎng)液并接入藻種，即可進(jìn)行培養(yǎng)；每池吊袋6-8個；培養(yǎng)用的海水鹽度20-30%。，用次氯酸鈉消毒法消毒，方法是I立方米海水中加入漂白液200-300mL，使海水中有效氯含量達(dá)到10_20mg/L，充氣8-12小時后，用硫代硫酸鈉中和余氯。硫代硫酸鈉量由余氯的多少來確定，直到滴入淀粉碘化鉀液不變色為止；按權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)基配方加入營養(yǎng)鹽，選純種的對數(shù)生長期藻種接種，即生長良好、生活力旺盛、色澤鮮艷、無沉淀及無明顯附壁現(xiàn)象的藻種，鏡檢無其它雜藻、原生動物等；接種密度30 X IO4ceI 1/mL，室外培養(yǎng)，自然光照射，溫度21-26°C，光強(qiáng)4000-80001x為最佳，氣泵充入空氣，充氣量不宜太大，以藻細(xì)胞浮起不下沉即可，充氣管末端連兩個氣石；夜間停止充氣，白天行間隔充氣，即充氣I小時，停I小時，重復(fù)進(jìn)行；培養(yǎng)4-6天，密度達(dá)100X 104-200X 104Cell/mL，采收藻液的1/3，補(bǔ)加相同體積的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，48小時后再采收藻液的1/3，補(bǔ)加相同體積的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，如此循環(huán)進(jìn)行，5-7個循環(huán)周期后即可全部采收。
9.如權(quán)利要求1-6所述的紫球藻培養(yǎng)基配方，其特征在于土壤浸出液的提取步驟為 (1)從野外取回有代表性的土壤樣品，在105 115°C下烘干。
(2)稱取5g干燥的土壤樣品,放入50mL干燥的錐形瓶中，加入25mL0.5mol/L的碳酸氫鈉浸提液.用玻璃棒把土壤攪散.再加入半藥匙活性炭，劇烈振蕩I 2分鐘后靜置5 10分鐘，過濾后得到的濾液是土壤浸出液。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種紫球藻培養(yǎng)基配方及塑料薄膜袋半連續(xù)培養(yǎng)方法，涉及海洋微藻養(yǎng)殖領(lǐng)域。紫球藻的培養(yǎng)傳統(tǒng)上使用SBM培養(yǎng)液配方，生長速度慢，產(chǎn)量低。我的實(shí)驗(yàn)表明，用NH4NO3作氮源，添加適量的NaHCO3并補(bǔ)充了九二0植物生長刺激素(即赤霉素)、A8微量元素、f/2維生素，營養(yǎng)更均衡、全面，大大加快了紫球藻的生長速度，產(chǎn)量可以提高78％。紫球藻的培養(yǎng)方式，我用塑料薄膜袋半連續(xù)培養(yǎng)方法培養(yǎng)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的開放水泥池一次性培養(yǎng)，使得微藻細(xì)胞在生長過程中始終保持合適的營養(yǎng)鹽濃度，易于操作、不易污染、易于掌控、靈活多樣、不易劃破、安全可靠、透光性好、成本低、生長快、產(chǎn)量高。
文檔編號C12R1/89GK102827776SQ20121034929
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月20日
發(fā)明者王培磊 申請人:王培磊