一種牙垢具核梭桿菌選擇培養(yǎng)基的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及檢驗微生物培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種牙垢具核梭桿菌選擇培養(yǎng)基。
【背景技術(shù)】
[0002] 微生物培養(yǎng)是一種用人工方法使微生物生長繁殖的技術(shù)，而選擇性培養(yǎng)基是用來 促進或抑制一定類型的生物體(如細(xì)胞或細(xì)菌等）而設(shè)計的培養(yǎng)基，利用這種培養(yǎng)基可以將 所需要的微生物從混雜的微生物中分離出來。牙周病是口腔兩大類主要疾病之一，在我國 有很高的發(fā)病率，具核梭桿菌（Fusobacterium nucleatum, Fn)屬革蘭氏陰性專性厭氧桿 菌，與牙周疾病的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，是在牙周病中起主導(dǎo)作用的微生物，也是成人牙周炎 和青少年牙周炎的可疑致病菌之一。該菌除可引起口腔疾病外，還可引起身體其他部位的 感染，包括腦、肺和肝，血液和關(guān)節(jié)，胸和腹部。目前，具核梭桿菌檢驗手段主要是齦下菌斑 采樣進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR)該種方法需要對樣本進行 DNA提取和PCR引物設(shè)計，且需要配備PCR相關(guān)儀器設(shè)備，成本昂貴，操作復(fù)雜。實驗室常用 CDC厭氧菌瓊脂培養(yǎng)具核梭桿菌，由于基層醫(yī)院檢驗科大多缺乏無氧檢驗設(shè)備，因此大多用 "厭氧缸培養(yǎng)法"，所謂的厭氧缸是普通的干燥缸，接種好標(biāo)本的平板或液體培養(yǎng)基試管放 入干燥缸內(nèi)培養(yǎng)，通過物理化學(xué)的方法耗盡缸內(nèi)氧氣，造成厭氧環(huán)境。厭氧缸法的氧氣耗 盡需要時間，而具核梭桿菌為專性厭氧桿菌，因此該種培養(yǎng)技術(shù)存在以下缺陷：①厭氧缸內(nèi) CDC厭氧菌瓊脂培養(yǎng)基上的具核梭桿菌生長緩慢，陽性檢出率低，一周左右方可較準(zhǔn)確的作 出鑒定；②由于非絕對無氧條件，因此牙垢標(biāo)本內(nèi)需氧菌和兼性厭氧菌具有生存條件，培養(yǎng) 基分離能力差。此外，現(xiàn)有的CDC厭氧菌瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)過程中很難將牙垢中的卟啉單胞 菌、普氏桿菌、消化鏈球菌，以及溶血鏈球菌、變形鏈球菌、韋榮球菌、金黃色葡萄球菌、衣氏 和內(nèi)氏放線菌、白色念珠菌等口腔常駐菌分離出去，影響具核梭桿菌的生長和分離。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的技術(shù)任務(wù)是針對以上現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種適合于牙垢標(biāo)本的具核 梭桿菌生長的選擇培養(yǎng)基。
[0004] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題的技術(shù)方案是：一種具核梭桿菌選擇培養(yǎng)基，其特征在于， 配制1000 ml培養(yǎng)基的配方中含有： 胰酪蛋白胨5.0~10.0 g; 豌豆淀粉2. 0~5. Og ; 酵母粉5. 0~10.0 g ; 氯化鈉 5. Og ; 瓊脂 15. 0 ~20.0 g ; 乙二胺四乙酸二鉀鎂鹽2~3g ; 結(jié)頁氨酸〇· 1~〇· 5g ; 無菌熱變形小牛血清50~100mL ; 蒸餾水加至1000ml。
[0005] 上述的無菌熱變形小牛血清制備方法為：取無菌小牛血清80°C下加熱lOmin，在 45°C下加入滅菌胰蛋白酶酶解90min，酶與底物的質(zhì)量比為1:150。
[0006] 上述培養(yǎng)基的制備方法為： (1) 稱取豌豆淀粉在50~70°C下，100mL蒸餾水中糊化； (2) 稱取胰酪蛋白胨；酵母粉；氯化鈉；瓊脂；乙二胺四乙酸二鉀鎂鹽；纈氨酸，用蒸餾 水溶解后與步驟（1)得到的糊化淀粉混勻，121°C，滅菌15min，冷卻到45°C，加入無菌熱變 形小牛血清混勻，滅菌蒸餾水定容到1000 ml后分裝。
[0007] 優(yōu)化方案中，每1000 ml培養(yǎng)基還含有L-高精氨酸0. 1~0. 5g。
[0008] 優(yōu)化方案中，每1000 ml培養(yǎng)基還含有γ-氨基丁酸(λ Ol~(λ lg。
[0009] 優(yōu)化方案中，每1000 ml培養(yǎng)基還含有濃度200g/L的石菖蒲水煮液200~300ml。
[0010] 上述優(yōu)化方案的培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 取石菖蒲加水煮沸30-60min，過濾，取濾液，調(diào)整體積到濃度為200g/L，得石菖蒲 水煮液； (2) 稱取豌豆淀粉在50~70°C下，100mL蒸餾水中糊化； (3) 稱取胰酪蛋白胨；酵母粉；氯化鈉；瓊脂；乙二胺四乙酸二鉀鎂鹽；纈氨酸；L-高精 氨酸；γ -氨基丁酸，用蒸餾水溶解后與步驟（2)得到的糊化淀粉混勻，溶于步驟所得的石 菖蒲提取液中混勻121°C滅菌15min，冷卻到45°C，加入無菌熱變形小牛血清混勻，滅菌蒸 餾水定容到1000 ml后分裝。
[0011] 所述的胰酪蛋白胨含有多種糖類、氨基酸、維生素和微量元素為具核梭桿菌生長 提供能量，豌豆淀粉提供碳源，酵母粉富含蛋白質(zhì)、氨基酸、多肽、核苷酸、維生素、生長因 子、微量元素等營養(yǎng)成分，促進具核梭桿菌的繁殖和生長；氯化鈉維持均衡的滲透壓；瓊脂 為培養(yǎng)基的凝固劑；纈氨酸為厭氧菌營養(yǎng)劑；乙二胺四乙酸二鉀鎂鹽提供具核梭桿菌生長 所需的無機鹽，且該濃度下的乙二胺四乙酸二鉀鎂鹽通過電性絡(luò)合作用附著于細(xì)菌細(xì)胞 壁，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)變形，進行發(fā)揮抑菌滅菌作用，而具核梭桿菌細(xì)胞壁上的外膜蛋白OMP和 fadA黏附蛋白使得具核梭桿菌的細(xì)胞壁區(qū)域等電點與乙二胺四乙酸二鉀鎂鹽不匹配，造成 電性絡(luò)合作用失效，因此抗菌失效。通過實驗分別將口腔常見厭氧菌卟啉單胞菌、普氏桿 菌、韋榮球菌、具核梭桿菌菌株接種到添加 3g/L的乙二胺四乙酸二鉀鎂鹽CDC厭氧選擇培 養(yǎng)基上，對照組為普通⑶C厭氧菌選擇培養(yǎng)基，于37°C、厭氧罐內(nèi)培養(yǎng)48h后觀察，添加乙 二胺四乙酸二鉀鹽的培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)小型具核梭桿菌半透明菌落，未發(fā)現(xiàn)卟啉單胞菌、普氏 桿菌、韋榮球菌菌落，對照組培養(yǎng)基上發(fā)現(xiàn)卟啉單胞菌、普氏桿菌、韋榮球菌、具核梭桿菌菌 落，由此證實乙二胺四乙酸二鉀鹽對卟啉單胞菌、普氏桿菌、韋榮球菌有較好的滅菌作用， 且對于具核梭桿菌無明顯影響。
[0012] 熱變形小牛血清具有選擇性的抗菌效果，其熱變形方法為：取無菌小牛血清80°C 下加熱lOmin，在45°C下加入滅菌胰蛋白酶酶解90min，酶與底物的質(zhì)量比為1:150。熱變 形小牛血清抗菌性質(zhì)針對需氧菌，一方面改變需氧菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，造成通透性增加而死亡， 另一方面可以降低培養(yǎng)基的氧化還原電勢，促進無氧環(huán)境而加速需氧菌死亡，而該種抗菌 作用僅針對于需氧菌，對于厭氧菌則無效。通過實驗將同一大腸桿菌菌株和具核梭桿菌菌 株分別接種到CDC選擇培養(yǎng)基和配方中添加了 80ml/L的熱變形小牛血清的優(yōu)化CDC選擇 培養(yǎng)基上，于密封干燥缸環(huán)境37°C下培養(yǎng)，24h、48h鑒定，24h時添加熱變形小牛血清大腸 桿菌陽性檢出率為50%，沒有添加熱變形小牛血清的培養(yǎng)基上大腸桿菌陽性檢出率為80% ; 48h檢測結(jié)果為添加熱變形小牛血清的培養(yǎng)基具核梭桿菌陽性檢出率70%，沒有添加熱變 形小牛血清的培養(yǎng)基上具核梭桿菌陽性檢出率20% ;由此證實熱變形小牛血清在厭氧缸內(nèi) 對需氧菌有較好的抑制效果，且能通過加速無氧環(huán)境而促進厭氧菌生長。L-高精氨酸為 激活劑，促進纈氨酸的吸收；γ -氨基丁酸為營養(yǎng)增強劑，促進具核梭桿菌生長；石菖蒲(學(xué) 名：Acorus gramineus)屬菖蒲科，為禾草狀的多年生草本植物，藥用部分為根莖部位?，F(xiàn) 代醫(yī)學(xué)研宄表明，石菖蒲含α -細(xì)辛醚等揮發(fā)油及糖類、有機酸、氨基酸、無機元素等成分， 有消腫止痛、化痰開竅、癰疽疥癬等作用，石菖蒲水提液是良好的營養(yǎng)強化劑，石菖蒲水浸 劑（1:3)，在試管內(nèi)對堇色毛癬菌、同心性毛癬菌、星形奴卡菌等皮膚真菌均有不同程度的 抑制作用。有報告指出，石菖蒲煎劑有殺死腹水癌細(xì)胞的作用。Masuda T等研宄發(fā)現(xiàn)石菖 蒲中的α-細(xì)辛醚對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、大腸桿菌等均有抑制作用。實驗證實， 200g/L濃度下的石菖蒲水煮液對于厭氧菌并無殺滅作用，以厭氧培養(yǎng)基為對照，以厭氧培 養(yǎng)基配方中加入200g/L石菖蒲水煮液為實驗組，接種具核梭桿菌菌株，96h的陽性檢出率 分別為60%和70%，二者比較無明顯差異（P>0. 05)。
[0013] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比較，具有檢出可靠、具核梭桿菌分離率高的特點。
【具體實施方式】
[0014] 以下結(jié)合實際情況，對本發(fā)明的【具體實施方式】作詳細(xì)說明。
[0015] 實施例1，配制1000 ml培養(yǎng)基的配方中含有：胰酪蛋白胨10.0 g ;豌豆淀粉2. Og ; 酵母粉5. Og ;氯化鈉5. Og ;瓊脂15. Og ;乙二胺四乙酸二鉀鎂鹽3g ;繳氨酸0.1 g ;無菌熱 變形小牛血清100mL ;蒸餾水加至1000ml。制備方法：（1)稱取豌豆淀粉在70°C下，100mL 蒸餾水中糊化；（2)稱取胰酪蛋白胨；酵母粉；氯化鈉；瓊脂；乙二胺四乙酸二鉀鎂鹽；纈氨 酸，用蒸餾水溶解后與步驟（1)得到的糊化淀粉混勻，121°C，滅菌15min，冷卻到45°C，加入 無菌熱變形小牛血清混勻，滅菌蒸餾水定容到1000 ml后分裝。
[0016] 所述的無菌熱變形小牛血清制備方法為取無菌小牛血清80°C下加熱lOmin，在 45°C下加入滅菌胰蛋白酶酶解90min，酶與底物的質(zhì)量比為1:150。其他實施例中的無菌熱 變形小牛血清制備方法與實施例1中相同。
[0017] 實施例2,配制1000 ml培養(yǎng)基的配方中含有：胰酪蛋白胨8. Og ;豌豆淀粉5. Og ;酵 母粉8. Og ;氯化鈉5. Og