專利名稱：一種鑒別金銀花和山銀花的方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及中藥材來(lái)源品種鑒定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用核糖體DNA的ITS2片段鑒別金銀花和山銀花藥材的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
金銀花(FlosLonicerae Japonica)為忍冬科植物忍冬 Lonicera japonicaThunb.的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花。山銀花(Flos Lonicerae)為忍冬科植物灰租毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.、紅腺忍冬 Lonicera hypoglauca Miq.、華南忍冬Lonicera confusa DC.成黃褐毛忍冬 Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng 的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花。金銀花和山銀花都是常用的名貴中藥材，在臨床上都有廣泛的應(yīng)用，具有清熱解毒，疏散風(fēng)熱之功效，但兩者在藥效成分含量上不同，功效也各有側(cè)重，而且它們的性狀極為相似，用傳統(tǒng)方法極難把二者區(qū)分開(kāi)，藥典中采用的性狀鑒別的方法具有一定的主觀性，而且必須要求藥材外形完整，無(wú)損傷，可操作性不強(qiáng)，同時(shí)鑒別者需要有豐富的專業(yè)知識(shí)和鑒別經(jīng)驗(yàn)。目前市場(chǎng)上出現(xiàn)了金銀花和山銀花混用的情況，在一定程度上影響了用藥的質(zhì)量和安全。針對(duì)這種情況，急需尋找一種穩(wěn)定、可靠、簡(jiǎn)易地方法用于快速鑒別金銀花和山銀花藥材或粉末。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供利用核糖體DNA的ITS2片段鑒別金銀花和山銀花藥材的方法。由于金銀花和山銀花藥材都是干燥的花蕾和初開(kāi)的花，它們的DNA可能已經(jīng)發(fā)生了一定的降解，而且金銀花和山銀花都含有較多的多糖，本發(fā)明提供的金銀花和山銀花藥材DNA提取方法，可高效、快速提取金銀花和山銀花藥材的DNA。具體包括以下步驟:取金銀花、山銀花藥材，在基因組DNA提取前加入5%的PVP40粉末。本發(fā)明提供的金銀花和山銀花藥材的核糖體DNA的ITS2快速PCR擴(kuò)增方法主要針對(duì)其序列GC含量高的特點(diǎn)，可通過(guò)提高退火溫度和加入5%的二甲基亞砜和2%的三甲基甘氨酸成功擴(kuò)增金銀花和山銀花的ITS2序列。本發(fā)明提供的金銀花和山銀花的鑒定方法，包括PCR擴(kuò)增ITS2基因。具體包括如下步驟:
(I)提取待測(cè)樣品DNA，(2) PCR擴(kuò)增含有核糖體DNA的ITS2序列的片段；(3)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序，拼接，去除序列兩端的5.8S和28S基因區(qū)段，獲得完整ITS2基因間隔區(qū)。本發(fā)明所用擴(kuò)增引物序列為:ITS2-HF 5’ -ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’ITS2-HR 5’ -GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’
所述PCR擴(kuò)增的體系為每25μ L:10 X PCR Buffer2.5 μ L, 25mmol/L Mg2+2 μ L, 2.5mmol/LdNTPs2 μ L, 2.5 μ mol/L 弓 I物各1.0 μ L，DNA模板30ng，Taq DNA聚合酶1.0U, 5%的二甲基亞砜1.0 μ L，2%的三甲基甘氨酸0.5 μ L,補(bǔ)滅菌雙蒸水至25 μ L0所述PCR擴(kuò)增的條件為94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸45s，40個(gè)循環(huán)。(4)基于K2P模型，構(gòu)建待測(cè)樣品的ITS2序列的NJ樹(shù)，通過(guò)NJ樹(shù)可以直觀的鑒別金銀花和山銀花。本發(fā)明所述方法可應(yīng)用于鑒定忍冬屬植物。所述忍冬屬植物優(yōu)選為金銀花、山銀花。本發(fā)明的有益效果:(I)本發(fā)明提供的金銀花藥材核糖體DNA的ITS2片段制備方法可有效解決金銀花藥材的品種鑒定、品種改良、育種，以及種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)利用等問(wèn)題。(2)本發(fā)明方法適用性廣，操作簡(jiǎn)單，易于掌握，準(zhǔn)確性高。能夠成功實(shí)現(xiàn)對(duì)金銀花和山銀花藥材或粉末的快速、準(zhǔn)確鑒定。



圖1為加入5%的二甲基亞砜1.0 μ L和2%的三甲基甘氨酸0.5 μ L的PCR反應(yīng)體系中，金銀花和山銀花ITS2序列的PCR擴(kuò)增電泳圖；Μ為分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、26為陰性對(duì)照；2-25為金銀花；27-31為灰氈毛忍冬；32-36為黃褐毛忍冬；37_38為紅腺忍冬；39_40為華南忍冬；圖2為未加入5%的二甲基亞砜1.0 μ L和2%的三甲基甘氨酸0.5 μ L的PCR反應(yīng)體系中，金銀花和山銀花ITS2序列的PCR擴(kuò)增電泳圖；Μ為分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、26為陰性對(duì)照；2-25為金銀花；27-31為灰氈毛忍冬；32-36為黃褐毛忍冬；37_38為紅腺忍冬；39_40為華南忍冬；圖3為金銀花和山銀花的NJ樹(shù)鑒定結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若為特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。本發(fā)明所用儀器為臺(tái)式高速離心機(jī)、PTC-100基因擴(kuò)增儀、電泳儀、紫外凝膠成像分析系統(tǒng)、ΜΜ400球磨儀(德國(guó)Retsch)。本發(fā)明中涉及到的百分號(hào)“％”，若未特別說(shuō)明，是指質(zhì)量百分比；但溶液的百分t匕，除另有規(guī)定外，是指溶液IOOml中含有溶質(zhì)若干克；液體之間的百分比，是指20°C時(shí)容量的比例。實(shí)施例11、實(shí)驗(yàn)材料，如表I所示。表I金銀花和山銀花樣品
權(quán)利要求
1.一種鑒別金銀花和山銀花的方法，包括PCR擴(kuò)增ITS2核苷酸序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，包括以下步驟: 1)提取樣品DNA； 2)PCR擴(kuò)增ITS2序列的片段； 3)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行拼接，獲得ITS2基因間隔區(qū)； 4)構(gòu)建樣品的ITS2序列的NJ樹(shù)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述樣品為金銀花藥材或山銀花藥材。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，在提取DNA前加入樣品量3%-5%的聚乙烯吡咯烷酮PVP-40粉末。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的引物為ITS2-HF5’ -ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3’ ；ITS2-HR 5’ -GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3’。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的體系為每25μL:1OXPCR Buffer2.5μ L,25mmol/L Mg2+2 μ L, 2.5mmol/LdNTPs2 μ L，2.5 μ mol/L 引物各1.0 μ L，DNA模板30ng，Taq DNA聚合酶L 0U, 5%的二甲基亞砜L 0μ L，2%的三甲基甘氨酸0.5μ L，補(bǔ) ddH20 至 25 μ L。
7.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的條件為94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸45s，40個(gè)循環(huán)。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述方法在鑒別忍冬屬植物中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述忍冬屬植物為金銀花、山銀花。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種鑒別金銀花和山銀花的方法及其應(yīng)用。本發(fā)明方法包括PCR擴(kuò)增ITS2核苷酸序列，包括1)提取樣品DNA；2)PCR擴(kuò)增含有核糖體DNA的ITS2序列的片段；3)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行拼接，獲得完整ITS2基因間隔區(qū)；4)構(gòu)建樣品的ITS2序列的NJ樹(shù)。本發(fā)明方法有效解決金銀花藥材的品種鑒定、品種改良、育種，以及種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)利用等問(wèn)題；本發(fā)明方法適用性廣，操作簡(jiǎn)單，易于掌握，準(zhǔn)確性高，能夠成功實(shí)現(xiàn)對(duì)金銀花和山銀花藥材或粉末的快速、準(zhǔn)確鑒定。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103173532SQ20121037234
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2012年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月29日
發(fā)明者陳士林, 侯典云, 宋經(jīng)元, 姚輝 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所, 河南科技大學(xué)