專利名稱：一株太空環(huán)境下的褪色沙雷菌lct-sm166菌株的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種新的微生物菌株以及其生物學特性、基因組DNA序列、轉錄組和差異蛋白組學，利用生物信息學技術獲得其比較基因組學信息、轉錄組測序分析的差異表達基因以及差異蛋白組學鑒定的蛋白質分子。
背景技術：
隨著我國神舟飛船和空間站等龐大航天計劃的實施，載人航天的醫(yī)學保障需求日益突出。航天活動中，一些微生物可隨人體或飛行器進入太空。在空間站中已檢測出包括肺炎克雷伯氏菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌、沙雷氏菌、蠟狀芽孢桿菌和腸球菌等多種細菌?？臻g自然環(huán)境具有地面環(huán)境中所不存在的一些特殊環(huán)境因子，包括失重、高真空、極端溫度、弱磁場和粒子輻射等。這些特殊環(huán)境因子可影響微生物群區(qū)的生物習性，并導致表型改變甚至產生基因突變，使一些機會致病菌在毒力和侵襲力等方面發(fā)生改變，有研究發(fā)現(xiàn)在模擬微重力條件下培養(yǎng)的鼠傷寒沙門氏菌對小鼠感染的毒力會增強；肺炎鏈球菌等機會致病菌在模擬微重力條件下毒力增強。因此迫切需要進行微生物尤其是條件致病菌的空間研究。`褪色沙雷菌是一種兼性厭氧的革蘭氏陰性桿菌，廣泛存在于自然界，是水和土壤中的常居菌群。褪色沙雷菌也是臨床常見的條件致病菌，近幾年在臨床的檢出率增高，而且因為廣譜抗生素的廣泛使用，多重耐藥、泛耐藥甚至全耐藥的菌株顯著增多，臨床抗感染治療手段已十分有限。既往針對該菌生物學特性、致病性等研究均局限于地面。對空間環(huán)境下褪色沙雷菌的研究尚未見報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種太空環(huán)境下的褪色沙雷菌LCT-SM166菌株，通過表型研究揭示其生物學特性及致病性變化，以基因組學法明確空間環(huán)境對細菌遺傳性狀的作用，結合轉錄組學和蛋白組學，研究細菌對空間環(huán)境適應性變化的機制。本發(fā)明提供的菌株LCT-SM166，其保藏號為CGMCC N0.6528。所述的一株褪色沙雷菌，其特征在于:革蘭氏染色陰性，形態(tài)呈桿狀、單個、無芽孢；同地面株相比，抗生素的敏感性無明顯變化；生長速度的差異從生長曲線看不明顯；同地面株均無溶血反應；Biolog反應板生化特征結果顯示同地面株比較可以利用D-棉子糖。所述的LCT-SM166菌株，通過全基因組測序方法獲得太空環(huán)境下的該菌株的突變基因是:SNP差異分析顯示雜合SNP位點有58個，其中有意義的有13個。所述的LCT-SM166菌株，利用轉錄組測序鑒定獲得該菌株的差異表達基因有6個上調，67個下調。所述的LCT-SM166菌株，采用差異蛋白組學方法鑒定得到該菌株的差異表達蛋白分子，其中上調的有21個，下調的90個。其中變化超過兩倍以上的有12個上調的蛋白質分子，70個下調的蛋白質分子。其GO功能富集分析顯示主要同翻譯因子活性和核酸連接有關，Pathway富集分析顯示主要同丙酮酸鹽代謝有關。所述的LCT-SM166菌株，存在靈菌紅素合成基因(pigB-pigP)，其編碼的代謝產物靈菌紅素是一類含甲氧基吡咯骨架結構的天然色素，具有免疫抑制、抗細菌、抗真菌和抗瘧疾等多種生物活性。此外有研究發(fā)現(xiàn)靈菌紅素具有很強的抗腫瘤及免疫抑制活性具有抗腫瘤、免疫抑制作用。


圖1為褪色沙雷 菌LCT-SM166菌株革蘭氏染色圖2為褪色沙雷菌LCT-SM166菌株Biolog生化特征圖3為褪色沙雷菌LCT-SM166菌株生長曲線圖4為褪色沙雷菌LCT-SM166的GC含量與D印th關聯(lián)分析5為褪色沙雷菌樣品LCT-SM166的15-mer分析6為褪色沙雷菌LCT-SM166的轉錄組基因覆蓋度圖7為褪色沙雷菌LCT-SM166的轉錄組差異表達基因圖8為褪色沙雷菌LCT-SM166的蛋白質組差異表達蛋白
具體實施例方式下述實施實例中所用的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施實例中所用的材料、試劑，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑獲得。本項目研究人員采用自制的樣本管搭載細菌，依據(jù):HYK_GF15《航天員系統(tǒng)載人運輸飛船/目標飛行器艙載產品環(huán)境試驗技術條件》，該樣本管通過了沖擊、快速減壓、震動實驗。褪色沙雷菌接種至樣本管中，培養(yǎng)基為LB瓊脂半固體培養(yǎng)基。然后封裝入代號為20111001的樣品包(材料為藍色美塔斯阻燃布料)。經(jīng)過神舟八號搭載，獲得太空環(huán)境下的褪色沙雷菌LCT-SM166菌株。具體實施實例一、LCT-SM262的表型特征分析:(I).形態(tài)特征:取50ul樣品離心,棄上清,加入無菌水50ul,吸取20ul于載玻片上進行固定；初染，吸取革蘭氏染色I (結晶紫)2滴于載玻片樣品上進行初染lmin，然后用自來水沖洗染液；媒染，吸取革蘭氏染色II (碘液)2滴覆蓋涂面染約lmin，然后用自來水沖洗染液，用吸水紙吸取涂面上的水分；脫色，吸取革蘭氏染色III (酒精)2滴滴在涂面上約30s，用水沖洗載玻片，用吸水紙吸取涂面上的水分；復染，吸取革蘭氏染色IV (番紅)2滴滴在涂面上約lmin，用水沖洗載玻片，用吸水紙吸取涂面上的水分；觀察，先用顯微鏡低倍鏡找到目標視野，然后再用油鏡(100X)進行觀察，判定并記錄結果、拍照，見圖1。(2).菌株的 16s rDNA 鑒定:16S rDNA是16S rRNA序列的基因，長約1.5kb。將已分純的單菌直接經(jīng)菌液PCR擴增16S rDNA，部分通過菌液PCR較難擴增的單菌經(jīng)擴大培養(yǎng)后提取基因組后擴增，擴增所用引物序列如下:SgF:AGAGTTTGATCATGGCTCAGSgR: TAGGGTTACCTTGTTACGACTT16S rDNA PCR產物用96孔mi I Ipore純化系統(tǒng)純化后準確定量，經(jīng)ABI3730xl全自動序列分析儀測序，測序結果使用Sequence scanner、Seqman等序列分析軟件，將兩向測序結果去掉首尾不可信序列后拼接，余下的約1350bp(雙向測序)即用于同源性分析。所得16S rDNA序列在Eztaxon server2.1數(shù)據(jù)庫中進行比對,確定菌株大致的分類地位。所有單菌16S序列全部導入seqman,輸出single file (fasta)后，經(jīng)Mega5.0軟件clusterW多重比對，輸出meg文件重新導入構建Neighbor-Joining tree。其中，phylogeny testmethod為bootstrap參數(shù)設置為1000。16s rDNA鑒定結果:16s rDNA鑒定結果為該菌株屬于褪色沙雷菌。(3).耐藥性檢測:經(jīng)過16s rDNA測序分析后，取出這些單菌的斜面，用滅菌的竹簽從斜面上蘸取適量菌種于1.5ml離心管中，混勻，調菌濃度約107 108。吸取備好的菌懸液IOOul進行涂布，盡可能地涂布均勻，每株單菌涂6個平板，每涂完一株菌，就進行下一步(粘貼藥敏片)。粘貼藥敏片，選擇的抗生素為青霉素G、氨芐青霉素、頭孢唑林、復達欣(頭孢他啶)(頭孢噻甲羧肟)、菌必治(頭孢三嗪)、阿奇霉素(泰力特)、環(huán)丙沙星(奔克)(悉復歡)(丙氟哌酸)、潔霉素(林可霉素)、萬古霉素、復方新諾明、氯霉素、舒普深(先鋒必/舒巴坦)、丁胺卡那(阿米卡星)、鏈霉素、美滿霉素(二甲胺四環(huán)素)(米諾環(huán)素)、美羅培南、哌拉西林/他唑巴坦(特治星)。將平板放置在37°C下培養(yǎng)18 24h培養(yǎng)24h后觀察抑菌圈大小。該菌株耐藥性未發(fā)現(xiàn)明顯變化(4).溶血試驗:采用點種法，將太空株和地面株點種于同一血瓊脂培養(yǎng)基上，培養(yǎng)溫度37°C，培養(yǎng)幾天后觀察結果。該菌株未見溶血反應。

(5).生化代謝(Biolog)實驗:菌懸液制備，取出菌株的斜面，用滅菌竹簽蘸取菌種接種在LB液體培養(yǎng)基中(4ml體系)，培養(yǎng)24h。然后取2ml菌液6000r/s離心5min，棄上清培養(yǎng)基，留下離心的菌體，然后用滅菌的生理鹽水洗滌菌體，6000r/s離心5min，再次棄去上清，再用Biolog接種液進行懸浮菌體，最后再轉至15ml的接種液中。調至濃度約IO7 IO8 ;接種，將以上菌懸液倒至接種皿中，震蕩均勻，用12道(或8道)排槍進行加樣，每個Biolog板孔加樣lOOul，共96孔，加完樣后，蓋上Biolog板蓋，放置在37°C下培養(yǎng)，24h和48h進行觀察，并記錄結果，見表1、圖2。表I褪色沙雷菌LCT-SM166的Biolog反應板結果
權利要求
1.一株太空環(huán)境下的褪色沙雷菌LCT-SM166菌株，其保藏號為:CGMCC N0.6528。
2.根據(jù)權利要求1所述的LCT-SM166菌株，其特征在于:革蘭氏染色陰性，形態(tài)呈桿狀、單個、無芽孢；同地面株相比，抗生素的敏感性無明顯變化；生長速度的差異從生長曲線看不明顯；同地面株均無溶血反應；Biolog反應板生化特征結果顯示同地面株比較可以利用D-棉子糖。
3.根據(jù)權利要求1所述的LCT-SM166菌株，通過全基因組測序方法獲得太空環(huán)境下的該菌株的突變基因。
4.根據(jù)權利要求1所述的LCT-SM166菌株，利用轉錄組測序鑒定獲得該菌株的差異表達基因。
5.根據(jù)權利要求1所述的LCT-SM166菌株，采用差異蛋白組學方法鑒定得到該菌株的差異表達蛋白分子。
6.根據(jù)權利要求1所述的LCT-SM166菌株，存在靈菌紅素合成基因(pigB-pigP)，其編碼的代謝產物靈菌紅 素具有抗腫瘤、免疫抑制作用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株太空環(huán)境下的褪色沙雷菌LCT-SM166菌株以及其生物學特性、基因組DNA序列、轉錄組和差異蛋白組學，特別是同地面褪色沙雷菌比較分析鑒定獲得的功能序列和分子，有助于研究太空環(huán)境對微生物的作用和機制，保障太空環(huán)境安全；有助于發(fā)現(xiàn)新的毒力和耐藥靶點，為臨床感染性疾病提供新的治療靶點；其代謝產物靈菌紅素具有抗腫瘤、免疫抑制作用，具有潛在的應用前景。
文檔編號C12R1/425GK103184176SQ201210379818
公開日2013年7月3日 申請日期2012年9月26日 優(yōu)先權日2012年9月26日
發(fā)明者劉長庭, 常德, 王雅娟, 方向群, 李天志, 王俊峰, 郭英華, 蘇龍翔, 陳振鴻, 劉巖 申請人:中國人民解放軍總醫(yī)院