一種石油降解菌的固定化方法與應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種石油降解菌的固定化方法與應用，包括以下內容：以小麥秸稈、玉米秸稈、麥麩、樹葉、核桃殼質活性炭為載體材料，混合后進行預處理；接入活化好的石油降解菌種子液，進行吸附培養(yǎng)；在無菌條件下濾掉上層菌懸液，用無菌水沖洗載體材料，將吸附菌后的載體材料轉移到新的石油降解菌種子液中，重復多次使載體材料吸附的菌量達到飽和，即得所需固定化顆粒。本發(fā)明以天然有機材料和天然無機材料為載體，克服了單獨使用無機載體和單獨使用有機載體的不足；通過吸附法實現(xiàn)對石油降解菌的固定，將制得的固定化石油降解菌應用于石油污染土壤的原位修復具有良好的效果，是一種可以推廣應用的環(huán)保產(chǎn)品。
【專利說明】一種石油降解菌的固定化方法與應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物固定化技術，具體地說是一種用于修復石油污染土壤的石油降解菌的固定化方法與應用。
【背景技術】
[0002]石油在開采、煉制、運輸和使用等過程中，由于各種原因會造成不同程度的泄漏，從而造成石油污染土壤。石油污染土壤是石油及石化企業(yè)的重要污染之一，其中的石油污染物對人體及環(huán)境具有很高的毒害作用。國內外石油污染土壤的處理方法主要有:焚燒法、填埋法、堆放法以及生物修復法等。
[0003]微生物修復技術的核心是高效降解菌對石油污染物的降解作用，降解過程使污染物的成分趨向于更復雜，一些次生代謝物和中間降解產(chǎn)物的毒性更大，游離微生物修復作用的不足就逐漸顯現(xiàn)出來，如單位體積內有效降解菌濃度低、與土著菌競爭處于弱勢、抗毒性侵害能力差等。而微生物固定化技術可以克服這些缺點和弊端，使修復效果得到大大改
[0004]微生物固定化技術是20世紀80年代興起的一種新型生物技術，是指將游離的細胞(微生物)或酶定位于限定的空間區(qū)域內，并使其保持活性且能反復使用的技術。微生物固定化技術被廣泛用于修復受污染的流體介質(如廢水)和半流體介質(如泥漿)環(huán)境中，且近十年來，對其修復受污染的非流體介質(如土壤)的研究也日益增多，但將其廣泛應用于受石油污染的土壤修復的報道還較少。
[0005]限制固定化微生物在土壤修復中應用的主要原因是土壤非流體介質本身所具有的復雜性和特殊性，給該技術提出了許多不同于在流體介質中應用固定化技術時所面臨的科學問題，如固定化技術本身存在著不足，未開發(fā)出適用于非流體介質的固定化技術，而且缺乏對固定化顆粒的環(huán)境安全性評價和對固定化過程中環(huán)境因子調控的系統(tǒng)研究；固定化微生物顆粒的載體選擇，如何克服在土壤中固定化顆粒的不可回收性和污染物濃度的非均質性對固定化顆粒造成的沖擊；如何保證吸附法制備的固定化微生物的菌濃度等。
[0006]應用天然載體吸附石油降解菌制備固定化微生物，在保證固定菌濃和營養(yǎng)充足、通風良好的前提下，可以對石油污染土壤起到良好的修復效果。天然載體來自自然，環(huán)境友好，在自然分解過程中可以為微生物的生長繁殖提供營養(yǎng)；將其摻入土壤中，可以起到疏松劑的作用，保證土壤的通風和持水性能。我國是一個農(nóng)業(yè)大國，生產(chǎn)、生活和消費等過程會產(chǎn)生大量的農(nóng)林廢棄物，若直接丟棄或焚燒將會占用大量土地、造成資源浪費和環(huán)境污染。因此，將這些農(nóng)林廢棄物預處理后作為固定細菌的載體，結合無機載體(如活性炭、多孔陶珠、沸石等)比表面積大、吸附性能高的特點以及天然有機載體(廢棄農(nóng)林作物的秸桿、根莖、葉子、種子等)本身所含的纖維物質、C、N元素和具有的保水、支撐性能，可以滿足細菌修復過程中所需的營養(yǎng)、水分、氧氣等條件的要求，同時也是土壤肥料，克服了單獨使用無機載體需要補充外來營養(yǎng)源和單獨使用天然有機載體使固定化菌量不足的缺點，為農(nóng)林廢棄物找到一條資源化出路。CN101177679A公開了一種用于多環(huán)芳烴污染土壤修復的固定化細菌的制備方法，以
0.25~1.0mm紅磚粉、粉煤灰、蛭石、泥炭土、硅藻土或焦炭粉為載體材料，滅菌后，接入菌液，然后增殖培養(yǎng)，制得所需固定化顆粒。在修復過程中發(fā)現(xiàn)，有機載體泥炭土 (含木質素和纖維素)固定化菌對土壤中芘(PYR)和苯并[a]芘(BaP)的去除率分別為62%和47%，比單獨使用無機載體固定化菌的修復效率要高的多。但是，該發(fā)明在制備固定化菌的過程中需要每天按lmL/g~2mL/g載體的量補加增殖培養(yǎng)基，這勢必會增加操作復雜性和操作成本。

【發(fā)明內容】

[0007]針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明提供一種石油降解菌的固定化方法與應用。本發(fā)明方法以天然有機材料和無機材料為載體，克服了單獨使用天然無機載體和單獨使用有機載體的不足；通過吸附法實現(xiàn)對石油降解菌的固定，將制得的固定化石油降解菌應用于石油污染土壤的原位修復具有良好的效果，是一種可以推廣應用的環(huán)保產(chǎn)品。
[0008]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為:
一種石油降解菌的固定化方法，包括以下內容:以小麥稻桿、玉米稻桿、麥麩、樹葉、核桃殼質活性炭為載體材料，混合后進行預處理；接入活化好的石油降解菌種子液，進行吸附培養(yǎng)；在無菌條件下濾掉上層菌懸液，用無菌水沖洗載體材料，將吸附菌后的載體材料轉移到新的石油降解菌種子液中，重復多次使載體材料吸附的菌量達到飽和，即得所需固定化石油降解菌。
[0009]本發(fā)明中，以25wt%~50wt%的小麥稻桿、20wt%~30wt%的玉米稻桿、5wt%~20wt%麥麩、5wt%~20wt%樹葉、10wt%~25wt%的核桃殼質活性炭為載體材料，優(yōu)選以35wt%~50wt%的小麥稻桿，20wt%~25wt%的玉米稻桿，5wt%~10wt%的麥鉄，10wt%~15wt%的樹葉，12.5wt%~20wt%的核桃殼質活性炭為載體材料。
[0010]本發(fā)明中，所述的樹葉為梧桐樹葉。小麥秸桿、玉米秸桿和樹葉曬干、粉碎，過24目篩。麥麩和核桃殼均為市售。
[0011]本發(fā)明中，核桃殼質活性炭采用ZnCl2活化法制備，具體為:稱取一定量的粉碎過24目篩的核桃殼浸潰于50wt%的ZnCl2溶液中，料液比為2:3，攪拌2小時后靜置24 h，干燥后放入管式加熱爐中，于300°C、N2的氛圍下炭化80min，所得炭化樣品再在50wt%ZnCl2溶液中浸潰20min，經(jīng)抽濾、干燥后置于馬弗爐中于500°C下活化40 min，冷卻后將活化產(chǎn)物用20wt%的鹽酸溶液煮沸20min，再用去離子水將所得產(chǎn)物洗滌至中性，置于干燥箱中于120 °C烘干。制備的核桃殼質活性炭的比表面積為960m2/g，碘吸附值為820mg/g。
[0012]本發(fā)明中，載體的預處理是用蒸餾水浸泡12~24h，調節(jié)pH7.0~7.5，濾去上層漂浮的雜質和上清液，50°C烘24h，高壓滅菌。
[0013]本發(fā)明中，石油降解菌種子液的制備采用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，配方為=NaCl10g/L,蛋白胨10g/L,牛肉膏5g/L和一定體積的蒸懼水加熱混合均勻，冷卻后用NaOH或鹽酸調節(jié)ρΗ7.0~7.2，121 °C水蒸氣滅菌20 min。
[0014]本發(fā)明中，石油降解菌種子液是在120r/min、3(TC條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期與穩(wěn)定期的交界點，保證石油降解菌的數(shù)量達到lXKT-SXK^f/mL。將高效石油降解菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期與穩(wěn)定期的交界點，可以保證菌的最高活性和穩(wěn)定性。
[0015]本發(fā)明中，將石油降解菌種子液與載體材料混合，載體材料占石油降解菌種子液的5v%~20v%。在120~160r/min、30°C條件下培養(yǎng)16~24h，用無菌水緩緩沖洗吸附石油降解菌后的載體材料，去掉未吸附上的石油降解菌，將所述吸附菌后的載體材料轉移到新的石油降解菌種子液中，重復多次使載體材料吸附固定的菌量基本達到飽和，最終得到固定化的石油降解菌成品。
[0016]本發(fā)明固定化石油降解菌的應用，具體使用方式為:保持土壤25wt%~30wt%的水分含量，以播種的方式按每平方米土壤撒0.1~Ikg固定化石油降解菌成品，并對表層O~30cm 土壤進行翻耕，使之與固定化石油降解菌成品混合均勻，并保證土壤良好的通氣性。
[0017]本發(fā)明的優(yōu)點在于:
1.載體材料均來源于自然界，成本低，通氣性良好，對生物無毒性，不會引入二次污染。結合無機載體(自制核桃殼質活性炭)比表面積大、吸附性能高的特點以及天然有機載體(小麥秸桿、玉米秸桿、麥麩、樹葉)本身所含的纖維物質和C、N元素以及具有的保水、支撐性能，可以滿足細菌修復過程中所需的營養(yǎng)、水分、氧氣等條件的要求，同時作為土壤肥料，克服了單獨使用天然無機載體需要補充外來營養(yǎng)源和單獨使用天然有機載體固定菌量不足的缺點，為農(nóng)林廢棄物找到一條資源化出路。
[0018]具體表現(xiàn)為:①玉米秸桿、小麥秸桿含有的豐富的纖維素物質，利用其在土壤中緩慢分解形成的有機質、腐殖質，可為土壤中微生物提供原料，從而有效改善土壤的結構。②通過添加樹葉、麥麩等輔助材料，使得C、N比更適合微生物生長，且利用樹葉、麥麩本身含有的高持水能力以及麥麩含有的豐富的膳食纖維，可以維持土壤的含水率，提供細菌繁殖所需要的營養(yǎng)和水分；③利用核桃殼質活性炭巨大的比表面積和優(yōu)異的吸附性能將石油降解菌牢牢吸附在其表面，在修復過程中將土壤中的石油污染物進行吸附富集，然后附著在載體上的細菌對污染物進行分解。
[0019]2.固定化石油降解菌成品對石油污染土壤有明顯的修復效果，在投料比0.5~
1.0kg/m2污染土壤、修復時 間40d的條件下，石油污染物去除率可達58.5wt%~64wt%，比游離菌高出16.5wt%~22.0wt%，其中飽和烴去除效果最好，可達70.3wt%~74.0wt%。
[0020]3.采用簡單的吸附法，制備工藝簡單，生產(chǎn)費用低，凈化效果好，易于批量生產(chǎn)，可以用于大面積石油污染土壤的生物修復的推廣使用。
【具體實施方式】
[0021 ] 下面通過【具體實施方式】來進一步描述本發(fā)明。本發(fā)明中，wt%為質量分數(shù)，v%為體積分數(shù)。
[0022]實施例1
(I)載體材料的預處理
將在農(nóng)田和野外收集到的玉米秸桿、小麥秸桿和梧桐樹葉曬干、粉碎，過24目篩；然后與市售的麥麩和自制24目核桃殼質活性炭混合。載體材料的配比為50wt%的小麥秸桿、20wt%的玉米稻桿、5wt%麥麩、10wt%的梧桐樹葉、12.5wt%核桃殼質活性炭?；旌虾蟮妮d體用蒸餾水浸泡12~24h，調節(jié)pH7.0~7.5，濾去上層漂浮的雜質和上清液，將濾出的混合載體50°C烘24h，121 °C高壓蒸汽滅菌20min，備用。
[0023]核桃殼質活性炭采用ZnCl2活化法制備，具體為:稱取一定量的粉碎過24目篩的核桃殼浸潰于50wt%的ZnCl2溶液中，料液比2:3，攪拌2小時后靜置24 h，干燥后放入管式加熱爐中，于300°C、N2的氛圍下炭化80min，所得炭化樣品再在50wt%ZnCl2溶液中浸潰20min,經(jīng)抽濾、干燥后置于馬弗爐中于500°C下活化40 min,冷卻后將活化產(chǎn)物用20wt%的鹽酸溶液煮沸20 min，再用去離子水將所得產(chǎn)物洗滌至中性，置于干燥箱中于120 °C烘干。自制的核桃殼質活性炭的比表面積為960m2/g,碘吸附值為820mg/g.。
[0024](2)石油降解菌種子液的制備
將石油降解菌接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，在120r/min、3(TC條件下培養(yǎng)至石油降解菌的對數(shù)生長期與穩(wěn)定期的交界點，制得石油降解菌的種子液，保證種子液中石油降解菌的數(shù)量達到I X 101°個/mL。
[0025]所述牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的配方為:NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L和一定體積的蒸餾水混合均勻，用NaOH或鹽酸調節(jié)pH7.0~7.2，121 °C水蒸氣滅菌20min。
[0026](3)固定化石油降解菌的制備
將按(2)所述制備的石油降解菌種子液與(I)所述的載體材料混合，所述載體材料占石油降解菌種子液的10V%，120r/min、3(TC條件下培養(yǎng)16h，取出，無菌條件下濾掉上層菌懸液，用無菌水緩緩沖洗吸附石油降解菌后的載體材料，去掉未吸附上的石油降解菌，將所述吸附菌后的載體轉移到新的石油降解菌種子液中，重復上述步驟三次，使載體材料吸附固定的菌量基本達到飽和，最終得到固定化石油降解菌的成品。
[0027](4)固定化石油降解菌的應用
保持土壤25wt%~30wt%的水分含量，將固定化石油降解菌成品以播種的方式按
`0.5kg/m2撒入受石油污染的土壤中，并對表層O~30cm 土壤進行翻耕，修復時間40d的條件下，石油污染物去除率可達60.lwt%,比游離菌高出22.0wt%，其中飽和烴去除效果最好，可達 73.lwt%0
[0028]實施例2
與實施例1不同之處在于:載體材料的配比為37.5wt%的小麥稻桿、20wt%的玉米稻桿、10wt%麥麩、12.5wt%梧桐樹葉、20wt%核桃殼質活性炭。
[0029]同條件下修復40d，石油污染物去除率達62wt%，其中飽和烴去除率可達72.5wt%。
[0030]實施例3
與實施例1不同處之一在于:載體材料的配比為25wt%的小麥稻桿、30wt%的玉米稻桿、15wt%麥麩、15wt%梧桐樹葉、15wt%核桃殼質活性炭。不同處之二在于:固定化石油降解菌成品的撒入量為lkg/m2。
[0031]其他條件相同，修復時間40d，石油污染物去除率達58.5wt%，其中飽和烴去除率可達 70.3wt%。
[0032]實施例4
與實施例1不同處之一在于:制備石油降解菌種子液時，保證石油降解菌種子液中石油降解菌的數(shù)量達到5X101(I個/mL ;不同處之二在于:固定化石油降解菌制備時，載體材料與石油降解菌種子液的體積比為20v%，160r/min，30°C條件下培養(yǎng)24h。
[0033]同條件下修復40d，石油污染物去除率達64wt%，其中飽和烴去除率可達74wt%。
[0034]比較例I
與實施例1不同之處在于，載體材料的配比為30wt%的小麥稻桿、30wt%的玉米稻桿、15wt%麥麩、25wt%梧桐樹葉,不含無機載體核桃殼質活性炭。
[0035]同條件下修復40d，石油污染物去除率達53.6wt%，其中飽和烴去除率為62.7wt%。
[0036]比較例2
與實施例1不同之處在于，固定化石油降解菌制備時，只進行一次吸附固定化步驟，不
重復吸附三次。
[0037]同條件下修復40d ，石油污染物去除率達50.8wt%，其中飽和烴去除率為61.3wt%。
【權利要求】
1.一種石油降解菌的固定化方法,包括以下內容:以小麥稻桿、玉米稻桿、麥麩、樹葉、核桃殼質活性炭為載體材料，混合后進行預處理；接入活化好的石油降解菌種子液，進行吸附培養(yǎng)；在無菌條件下濾掉上層菌懸液，用無菌水沖洗載體材料，將吸附菌后的載體材料轉移到新的石油降解菌種子液中，重復多次使載體材料吸附的菌量達到飽和，即得所需固定化石油降解菌。
2.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:以25wt%~50wt%的小麥秸桿、20wt%~30wt%的玉米稻桿、5wt%~20wt%麥鉄、5wt%~20wt%樹葉、10wt%~25wt%的核桃殼質活性炭為載體材料。
3.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:以35wt%~50wt%的小麥秸桿，20wt%~25wt%的玉米稻桿，5wt%~10wt%的麥鉄，10wt%~15wt%的樹葉，12.5wt%~20wt%的核桃殼質活性炭為載體材料。
4.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:所述的樹葉為梧桐樹葉。
5.按照權利要求1或4所述的方法，其特征在于:小麥秸桿、玉米秸桿和樹葉曬干、粉碎，過24目篩。
6.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:核桃殼質活性炭采用ZnCl2活化法制備，具體為:稱取一定量的粉碎過24目篩的核桃殼浸潰于50wt%的ZnCl2溶液中，料液比為2:3，攪拌2小時后靜置24 h，干燥后放入管式加熱爐中，于300°C、N2的氛圍下炭化80min，所得炭化樣品再在50wt%ZnCl2溶液中浸潰20min，經(jīng)抽濾、干燥后置于馬弗爐中于500°C下活化40 min,冷卻后將活化產(chǎn)物用20 wt%的鹽酸溶液煮沸20min，再用去離子水將所得產(chǎn)物洗滌至中性，置于干燥箱中于120 °C烘干。
7.按照權利要求6所述的方法，其特征在于:制備的核桃殼質活性炭的比表面積為960m2/g,碘吸附值為 820mg/g。
8.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:載體的預處理是用蒸餾水浸泡12~24h，調節(jié)pH7.0~7.5，濾去上層漂浮的雜質和上清液，50°C烘24h，高壓滅菌。
9.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:石油降解菌種子液的制備采用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，配方為:NaCl 10g/L,蛋白胨10g/L,牛肉膏5g/L和一定體積的蒸懼水加熱混合均勻，冷卻后用NaOH或鹽酸調節(jié)pH7.0~7.2，121 °C水蒸氣滅菌20 min。
10.按照權利要求1或9所述的方法，其特征在于:石油降解菌種子液是在120r/min、30°C條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期與穩(wěn)定期的交界點，保證石油降解菌的數(shù)量達到IX IOltl~5X10lclf/mL。
11.按照權利要求1所述的方法，其特征在于:將石油降解菌種子液與載體材料混合，載體材料占石油降解菌種子液的5v%~20v%。
12.按照權利要求1或11所述的方法，其特征在于:在120~160r/min、30°C條件下培養(yǎng)16~24h，用無菌水緩緩沖洗吸附石油降解菌后的載體材料，去掉未吸附上的石油降解菌，將所述吸附菌后的載體材料轉移到新的石油降解菌種子液中，重復多次使載體材料吸附固定的菌量達到飽和。
13.權利要求1至12任一所述的固定化石油降解菌的應用，其特征在于:固定化石油降解菌的具體使用方式為:保持土壤25wt%~30wt%的水分含量，以播種的方式按每平方米土壤撒0.1~Ikg固定化石油降解菌成品，并對表層O~30cm 土壤進行翻耕,使之與固定化石油降解菌成品混合均勻`，并保證土壤良好的通氣性。
【文檔編號】C12N11/14GK103773752SQ201210404089
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2012年10月23日 優(yōu)先權日:2012年10月23日
【發(fā)明者】秦麗姣, 鄧德剛, 周彤 申請人:中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院