專利名稱：Dc-cik細胞分離培養(yǎng)試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及用于分離和培養(yǎng)DC-CIK細胞的試劑盒及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
以腫瘤免疫治療為核心的生物治療已成為繼手術(shù)、放療和化療之后的第四種治療模式。該治療模式是采用患者自體免疫細胞進行誘導(dǎo)，刺激或輔助人體自身免疫系統(tǒng)，從而完善和增強患者的免疫機能，且治療手段安全，基本無毒副作用，因此于近年來顯示出良好的應(yīng)用前景。
DC-CIK聯(lián)合治療是目前腫瘤生物治療中最成熟的治療方案之一。DC(樹突狀細胞)是迄今發(fā)現(xiàn)的功能最強大的抗原提呈細胞，可高效準確識別腫瘤抗原并將信息傳遞給人體免疫系統(tǒng)，在機體的抗腫瘤免疫中發(fā)揮著重要作用；DC主要由骨髓中的髓樣干細胞和淋巴樣干細胞分化而來，數(shù)量較少，僅占外周血單核細胞數(shù)量的1%以下。CIK細胞(細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞)是一種新型免疫活性細胞，兼有T淋巴細胞的強大抗腫瘤活性和NK細胞(自然殺傷細胞)的非主要組織相關(guān)性復(fù)合物限制性殺瘤的特點，對腫瘤細胞的殺傷活性可達84. 7% ;CIK細胞主要由⑶3+⑶56+和⑶3+⑶8+ T細胞亞群組成，其中⑶3+⑶56+ T細胞為自然殺傷活性T細胞(NKT細胞)，在正常人外周血中含量極少，具有抗腫瘤活性，CD3+CD8+T細胞為細胞毒性T細胞(CTL細胞)，是體內(nèi)執(zhí)行細胞免疫功能的主要效應(yīng)細胞。DC和CIK細胞共同培養(yǎng)聯(lián)合應(yīng)用不僅可顯著增強CIK的抗腫瘤活性，還可提高CIK對腫瘤靶細胞殺傷作用的特異性。DC-CIK細胞具有增殖速度快、殺瘤譜廣、殺瘤活性高等優(yōu)勢，可在不損傷機體免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能的前提下直接殺傷腫瘤細胞，并且具有調(diào)節(jié)和增強機體免疫的功能，尤其是對手術(shù)和放化療后的患者效果更為顯著，能消除患者機體微小的殘留或轉(zhuǎn)移性病灶，防止癌細胞的擴散和復(fù)發(fā)，對改善患者生活質(zhì)量以及提高患者生存率具有重要意義，是現(xiàn)今腫瘤過繼細胞免疫治療的首選方案。DC和CIK細胞尚不能直接從組織中大量分離獲得，必須經(jīng)過培養(yǎng)擴增并純化后才能滿足臨床應(yīng)用的需求。目前，國內(nèi)DC-CIK細胞的分離和培養(yǎng)技術(shù)主要存在以下缺點
(I)分離獲得的DC和CIK細胞純度和活性較低。國內(nèi)主要采用淋巴細胞分離法，分離得到的DC和CIK細胞純度和活性普遍較低，其中還混雜有較多的紅細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞、血小板等，當(dāng)細胞碎片回輸入人體后易引發(fā)病人出現(xiàn)發(fā)熱、炎癥等不良反應(yīng)。(2) CIK細胞增殖速度慢，數(shù)量少。國內(nèi)現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)的CIK細胞其增殖速度慢，難以達到腫瘤治療所需數(shù)量級，腫瘤治療效果欠佳。(3)CIK細胞有效抑瘤因子表達水平低。CIK細胞的細胞毒性與⑶3+⑶56+的表達水平呈正相關(guān)，而國內(nèi)現(xiàn)有技術(shù)培養(yǎng)的CIK細胞中⑶3+⑶56+雙陽性細胞比例低，雙陽性表達率不足10%
發(fā)明內(nèi)容
本申請人針對現(xiàn)有DC-CIK細胞分離和培養(yǎng)技術(shù)存在的上述缺陷，經(jīng)過研究改進，提供一種DC-CIK細胞分離培養(yǎng)試劑盒；本發(fā)明的另一個目的在于提供上述DC-CIK細胞分離培養(yǎng)試劑盒在分離和培養(yǎng)DC-CIK細胞中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)方案如下
一種DC-CIK細胞分離培養(yǎng)試劑盒，包括
(1)淋巴細胞分離液；
(2)外周血樣處理液包括含有質(zhì)量百分濃度為廣3%牛血清白蛋白的D-PBS緩沖液；
(3)CIK細胞誘導(dǎo)增殖體系包括⑶3、白細胞介素-I和白細胞介素-2 ； (4)DC誘導(dǎo)增殖體系包括GM-CSF和白細胞介素-4 ；
(5)細胞培養(yǎng)瓶包被體系包括纖粘連蛋白和Y干擾素；
(6)淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551；
(7)細胞培養(yǎng)袋。本發(fā)明還提供了一種上述DC-CIK細胞分離培養(yǎng)試劑盒在分離和培養(yǎng)DC-CIK細胞中的應(yīng)用，具體步驟如下
(I)外周血樣單核細胞的分離取新鮮的人外周血樣，在其中加入血液抗凝劑后制得抗凝血樣；向所述抗凝血樣中加入1/3 2/3體積的所述外周血樣處理液，充分混勻，用f I. 5倍體積的所述淋巴細胞分離液分離所得混合液中的單個核細胞，并用所述淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551調(diào)節(jié)所述單個核細胞密度至1 5X IO6個/mL，得到外周血單核細胞懸液；將所述外周血單核細胞懸液用所述外周血樣處理液洗滌，于室溫離心5 10 min,轉(zhuǎn)速150(T2000r/min，取白膜層細胞；
(2)DC和CIK細胞的分離
向步驟(I)所得白膜層細胞中加入含有5 10%自體血清的所述淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551，將所得細胞混懸液接種至所述纖粘連蛋白預(yù)包被的細胞培養(yǎng)瓶，為瓶A，并于細胞培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)；f5h后，將瓶A中的懸浮細胞接種至所述Y干擾素預(yù)包被的細胞培養(yǎng)瓶，為瓶B ;
(3)DC細胞的誘導(dǎo)增殖
向瓶A中的貼壁細胞加入含有5 10%自體血清的所述淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551，并同時加入終濃度為50(T750U/mL的所述GM-CSF以及終濃度為50(Tl000U/mL的所述白細胞介素_4，于細胞培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)；培養(yǎng)過程中每三天更換一次含有5 10%自體血漿的所述淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551，同時再次加入上述GM-CSF和白細胞介素_4 ；5^7天后，收獲細胞并將其轉(zhuǎn)移至所述細胞培養(yǎng)袋中進行擴大培養(yǎng)，8 10天后收獲細胞，即得DC細胞；
(4)CIK細胞的誘導(dǎo)增殖
向瓶B中加入含有5 10%自體血清的所述淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551，并同時加入終濃度為300飛00 u g/mL的所述⑶3、終濃度為10(T300U/mL的所述白細胞介素_1以及終濃度為500(T7500U/ml的所述白細胞介素-2，于細胞培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)；48 72 h后，換用含有5 10%自體血漿以及終濃度為50(T750萬U/L所述白細胞介素_2的所述淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551繼續(xù)培養(yǎng)；8 10天后，收獲細胞并將其轉(zhuǎn)移至所述細胞培養(yǎng)袋中進行擴大培養(yǎng)，14 16天后收獲細胞，即得CIK細胞；
(5)DC與CIK細胞的共培養(yǎng)將步驟(3)所得DC細胞和步驟(4)所得CIK細胞按照細胞數(shù)量比1:5 1:8的比例混合培養(yǎng)，得到DC-CIK細胞；
所述自體血清分離自添加了血液促凝劑的所述人外周血樣；
所述自體血漿分離自步驟(I)所制抗凝血樣；
以上百分含量如無特殊說明均為體積百分含量。其進一步的技術(shù)方案為
步驟(3)所述擴大培養(yǎng)是在所述淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551中進行的。步驟(4)所述擴大培養(yǎng)是在含有5 10%所述自體血漿以及終濃度50(T750萬U/L 的所述白細胞介素-2的所述淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551中進行的。步驟(5 )所述混合培養(yǎng)是在含有f 5%所述自體血漿以及終濃度50(T750萬U/L的所述白細胞介素-2的所述淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551中進行的。與現(xiàn)有DC-CIK細胞分離和培養(yǎng)技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益技術(shù)效果
I.本發(fā)明試劑盒分離所得淋巴細胞具有很高的純度和活性，經(jīng)檢測細胞純度和活性(活細胞百分率)均能達到98%以上。2.本發(fā)明試劑盒共培養(yǎng)的CIK細胞增殖速度快，經(jīng)檢測，用本發(fā)明試劑盒進行DC-CIK細胞共培養(yǎng)的CIK細胞在培養(yǎng)第14天數(shù)量可達2. 5 X IO9個/L，完全滿足腫瘤治療所需有效數(shù)量級。3.本發(fā)明試劑盒培養(yǎng)的⑶3+⑶56+雙陽性細胞比例高，經(jīng)檢測培養(yǎng)14天后⑶3+⑶56+雙陽性細胞可達52. 3%，具有很好的臨床效應(yīng)。
4.本發(fā)明試劑盒操作方法簡單，條件易控，可廣泛應(yīng)用于人和哺乳動物DC-CIK細胞的分離培養(yǎng)。


圖I為本發(fā)明實施例2中CIK細胞培養(yǎng)第0 14天的生長狀態(tài)圖。圖2為本發(fā)明實施例2中DC細胞培養(yǎng)第7天的形態(tài)觀測圖。圖3為本發(fā)明實施例2中不同培養(yǎng)時間(0 15天)⑶3+⑶56+細胞的流式細胞儀檢測結(jié)果，其中，右上角方框中顯示的是⑶3+⑶56+細胞。圖4為本發(fā)明實施例2中不同培養(yǎng)時間(0 14天)⑶3+⑶56+細胞的間接免熒光法檢測結(jié)果。
具體實施例方式以下結(jié)合附圖，并通過實施例對本發(fā)明進行具體說明。實施例I 實施例3中所述血庫濃縮白細胞血采集自醫(yī)院腫瘤病人，所述自體血清分離自添加了血液促凝劑的上述血庫濃縮白細胞血，分離步驟為取上述血液于3000r/min離心30min,吸取上清即得。所述自體血漿分離自添加了肝素的上述血庫濃縮白細胞血，分離步驟為同上。實施例I
本實施例中DC-CIK細胞分離培養(yǎng)試劑盒組成如下
(I)淋巴細胞分離液；(2)外周血樣處理液含有質(zhì)量百分濃度為1%牛血清白蛋白的D-PBS緩沖液；
(3)CIK細胞誘導(dǎo)增殖體系⑶3、白細胞介素-I和白細胞介素-2 ；
(4)DC誘導(dǎo)增殖體系GM-CSF、白細胞介素-4 ；
(5)細胞培養(yǎng)瓶包被體系纖粘連蛋白、Y干擾素；
(6)淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551。 將上述試劑盒應(yīng)用于DC-CIK細胞的分離培養(yǎng)，具體步驟如下
(I)外周血樣單核細胞的分離吸取20mL淋巴細胞分離液置于50mL離心管中，取20mL添加了肝素的血庫濃縮白細胞血，并在其中加入8mL外周血樣本處理液(含有質(zhì)量百分濃度為1%牛血清白蛋白的D-PBS緩沖液)，充分混勻，將所得混合液沿試管壁緩慢加至上述淋巴細胞分離液液面上方，加樣過程中勿使血液混入淋巴細胞分離液；將該離心管置于水平式離心機內(nèi)，于室溫以2000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min ；吸去上層血衆(zhòng),用毛細吸管吸取單個核細胞，并用淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551調(diào)節(jié)單個核細胞密度至I X IO6個/mL，得到外周血單核細胞懸液；將所得外周單核細胞懸液用5倍體積的外周血樣處理液洗滌3次，于室溫以1500r/min的轉(zhuǎn)速離心8 min，取白膜層細胞。(2) DC和CIK細胞的分離
向步驟(I)所得白膜層細胞中加入20mL淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T55U含ImL自體血清)，將所得細胞混懸液接種至纖粘連蛋白預(yù)包被的T75方瓶，為瓶A，并于5%C02恒溫細胞培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)；Ih后，將瓶A中的懸浮細胞接種至Y干擾素預(yù)包被的T75方瓶，為瓶B ；
(3)DC細胞的誘導(dǎo)增殖
向瓶A中的貼壁細胞加入20mL淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551 (含ImL自體血清)，同時加入終濃度為500U/mL的GM-CSF以及終濃度為750U/mL的白細胞介素_4，于5%C02恒溫細胞培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)；培養(yǎng)過程中每三天更換一次新鮮的淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551 (含5%的自體血漿)，同時再次加入上述GM-CSF和白細胞介素-4 ；5天后收獲細胞并將其轉(zhuǎn)移至I. 8L細胞培養(yǎng)袋中進行擴大培養(yǎng)(培養(yǎng)基為GT-T551)，10天后收獲細胞，即得DC細胞。(4) CIK細胞的誘導(dǎo)增殖
向瓶B中加入20mL淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551 (含ImL自體血清)，并同時加入終濃度為400 ii g/mL的CD3、終濃度為100U/mL的白細胞介素_1以及終濃度為7500U/mL的白細胞介素_2，于5%C02恒溫細胞培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)；48h后，將瓶B細胞轉(zhuǎn)移至T175方瓶，換用60mL新鮮的淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551 (含3mL自體血漿以及終濃度為750萬U/L的白細胞介素-2)繼續(xù)培養(yǎng)，8天后，收獲細胞并將其轉(zhuǎn)移至I. 8L細胞培養(yǎng)袋中進行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含5%自體血漿以及終濃度為750萬U/L的白細胞介素-2的淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551，兩天補一次液，每次補加IOOmL新鮮的淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551 (含1%自體血漿以及終濃度為750萬U/L的白細胞介素_2)，14天后收獲細胞即得CIK細胞；
(5)DC與CIK細胞的共培養(yǎng)
將步驟(3 )所得DC細胞和步驟(4)所得CIK細胞經(jīng)活細胞計數(shù)后按照細胞數(shù)量比1:8的比例于含有1%自體血漿以及終濃度為750萬U/L的白細胞介素-2的淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551中混合培養(yǎng)，14天后得到DC-CIK細胞。實施例2本實施例中DC-CIK細胞分離培養(yǎng)試劑盒組成如下
(1)淋巴細胞分離液
(2)外周血樣處理液含有質(zhì)量百分濃度為2.5%牛血清白蛋白的D-PBS緩沖液；
(3)CIK細胞誘導(dǎo)增殖體系⑶3、白細胞介素-I和白細胞介素-2 ；
(4)DC誘導(dǎo)增殖體系GM-CSF、白細胞介素-4 ；
(5)細胞培養(yǎng)瓶包被體系纖粘連蛋白、Y干擾素；
(6)淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551。將上述試劑盒應(yīng)用于DC-CIK細胞的分離培養(yǎng)，具體步驟如下
(I)外周血樣單核細胞的分離吸取20mL淋巴細胞分離液置于50mL離心管中，取20mL添加了肝素的血庫濃縮白細胞血，并在其中加入IOmL外周血樣本處理液(含有質(zhì)量百分濃度為2. 5%牛血清白蛋白的D-PBS緩沖液)，充分混勻，將所得混合液沿試管壁緩慢加至上述淋巴細胞分離液液面上方，加樣過程中勿使血液混入淋巴細胞分離液；將該離心管置于水平式離心機內(nèi)，于室溫以2000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min ；吸去上層血衆(zhòng),用毛細吸管吸取單個核細胞，并用淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551調(diào)節(jié)單個核細胞密度至3 X IO6個/mL，得到外周血單核細胞懸液；將所得外周單核細胞懸液用5倍體積的外周血樣處理液洗滌3次，于室溫以2000r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min,取白膜層細胞。(2) DC和CIK細胞的分離
向步驟(I)所得白膜層細胞中加入20mL淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T55U含2mL自體血清)，將所得細胞混懸液接種至纖粘連蛋白預(yù)包被的T75方瓶，為瓶A，并于5%C02恒溫細胞培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)；2h后，將瓶A中的懸浮細胞接種至Y干擾素預(yù)包被的T75方瓶，為瓶B ；
(3)DC細胞的誘導(dǎo)增殖
向瓶A中的貼壁細胞加入20mL淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551 (含2mL自體血清)，同時加入終濃度為750U/mL的GM-CSF以及終濃度為500U/mL的白細胞介素_4，于5%C02恒溫細胞培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)；培養(yǎng)過程中每三天更換一次新鮮的淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551 (含10%的自體血漿)，同時再次加入上述GM-CSF和白細胞介素-4 ；6天后收獲細胞并將其轉(zhuǎn)移至
I.8L細胞培養(yǎng)袋中進行擴大培養(yǎng)(培養(yǎng)基為GT-T551)，9天后收獲細胞，即得DC細胞。(4) CIK細胞的誘導(dǎo)增殖
向瓶B中加入20mL淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551 (含2mL自體血清)，并同時加入終濃度為300 u g/mL的⑶3、終濃度為100U/mL的白細胞介素_1以及終濃度為5000U/mL的白細胞介素-2，于5%C02恒溫細胞培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)；48 h后，將瓶B細胞轉(zhuǎn)移至T175方瓶，換用60mL新鮮的淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551(含6mL自體血漿以及終濃度為500萬U/L的白細胞介素-2)繼續(xù)培養(yǎng)，9天后，收獲細胞并將其轉(zhuǎn)移至I. 8L細胞培養(yǎng)袋中進行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10%自體血漿以及終濃度為500U/L的白細胞介素-2的淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551，兩天補一次液，每次補加IOOmL新鮮的淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551 (含1%自體血漿以及終濃度為500萬U/L的白細胞介素_2)，15天后收獲細胞即得CIK細胞；
(5) DC與CIK細胞的共培養(yǎng)
將步驟(3)所得DC細胞和步驟(4)所得CIK細胞經(jīng)活細胞計數(shù)后按照細胞數(shù)量比1:5的比例于含有5%自體血漿以及終濃度為500萬U/L的白細胞介素-2的淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551中混合培養(yǎng)，15天后得到DC-CIK細胞。實施例3
本實施例中DC-CIK細胞分離培養(yǎng)試劑盒組成如下
(1)淋巴細胞分離液
(2)外周血樣處理液含有質(zhì)量百分濃度為3%牛血清白蛋白的D-PBS緩沖液；
(3)CIK細胞誘導(dǎo)增殖體系CD3、白細胞介素-1和白細胞介素-2 ；
(4)DC誘導(dǎo)增殖體系GM-CSF、白細胞介素-4 ；
(5)細胞培養(yǎng)瓶包被體系纖粘連蛋白、Y干擾素；
(6)淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551。將上述試劑盒應(yīng)用于DC-CIK細胞的分離培養(yǎng)，具體步驟如下
(1)外周血樣單核細胞的分離吸取20mL淋巴細胞分離液置于50mL離心管中，取20mL添加了肝素的血庫濃縮白細胞血，并在其中加入15mL外周血樣本處理液(含有質(zhì)量百分濃度為3%牛血清白蛋白的D-PBS緩沖液)，充分混勻，將所得混合液沿試管壁緩慢加至上述淋巴細胞分離液液面上方，加樣過程中勿使血液混入淋巴細胞分離液；將該離心管置于水平式離心機內(nèi)，于室溫以2000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min ；吸去上層血衆(zhòng),用毛細吸管吸取單個核細胞，并用淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551調(diào)節(jié)單個核細胞密度至5 X 1O6個/mL，得到外周血單核細胞懸液；將所得外周單核細胞懸液用5倍體積的外周血樣處理液洗滌3次，于室溫以1800r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取白膜層細胞。(2) DC和CIK細胞的分離
向步驟(1)所得白膜層細胞中加入20mL淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551 (含1. 5mL自體血清)，將所得細胞混懸液接種至纖粘連蛋白預(yù)包被的T75方瓶，為瓶A，并于5%C02恒溫細胞培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)；5h后，將瓶A中的懸浮細胞接種至Y干擾素預(yù)包被的T75方瓶，為瓶B ;
(3) DC細胞的誘導(dǎo)增殖
向瓶A中的貼壁細胞加入20mL淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551 (含1. 5mL自體血清)，同時加入終濃度為600U/mL的GM-CSF以及終濃度為1000U/mL的白細胞介素_4，于5%C02恒溫細胞培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)；培養(yǎng)過程中每三天更換一次新鮮的淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551(含7. 5%的自體血漿)，同時再次加入上述GM-CSF和白細胞介素-4 ;7天后收獲細胞并將其轉(zhuǎn)移至I. 8L細胞培養(yǎng)袋中進行擴大培養(yǎng)(培養(yǎng)基為GT-T551)，8天后收獲細胞，即得DC細胞。(4) CIK細胞的誘導(dǎo)增殖
向瓶B中加入20mL淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551 (含1. 5mL自體血清)，并同時加入終濃度為500 u g/mL的⑶3、終濃度為200U/mL的白細胞介素_1以及終濃度為6000U/mL的白細胞介素-2，于5%C02恒溫細胞培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)；72h后，將瓶B細胞轉(zhuǎn)移至T175方瓶，換用60mL新鮮的淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551 (含4. 5mL自體血漿以及終濃度為600萬U/L的白細胞介素-2)繼續(xù)培養(yǎng)，10天后，收獲細胞并將其轉(zhuǎn)移至I. 8L細胞培養(yǎng)袋中進行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含7. 5%自體血漿以及終濃度為600萬U/L的白細胞介素-2的淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551，兩天補一次液，每次補加IOOmL新鮮的淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551 (含1%自體血漿以及終濃度為600萬U/L的白細胞介素_2)，16天后收獲細胞即得CIK細胞；
(5)DC與CIK細胞的共培養(yǎng)將步驟(3)所得DC細胞和步驟(4)所得CIK細胞經(jīng)活細胞計數(shù)后按照細胞數(shù)量比1:6的比例于含有3%自體血漿以及終濃度為600萬U/L的白細胞介素-2的淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551中混合培養(yǎng)，14天后得到DC-CIK細胞。實施例4 DC-CIK細胞的相關(guān)性能指標(biāo)檢測
1.活細胞百分率和細胞純度的測定
采用臺盼蘭活細胞計數(shù)法對實施例I 實施例3中與DC細胞共培養(yǎng)的CIK活細胞進行計數(shù)(第14天)，得出活細胞百分率，計算公式為活細胞百分率=(活細胞數(shù)/細胞總數(shù))X 100%o采用鏡檢法檢測細胞純度，計算公式為細胞純度=(I-血細胞數(shù)/活細胞總數(shù))X 100%
結(jié)果參見表I。表I CIK活細胞計數(shù)、活細胞百分率以及細胞純度測定結(jié)果
權(quán)利要求
1.ー種DC-CIK細胞分離培養(yǎng)試劑盒，其特征在于包括 (1)淋巴細胞分離液； (2)外周血樣處理液包括含有質(zhì)量百分濃度為廣3%牛血清白蛋白的D-PBS緩沖液； (3)CIK細胞誘導(dǎo)增殖體系包括⑶3、白細胞介素-1和白細胞介素-2 ； (4)DC誘導(dǎo)增殖體系包括GM-CSF和白細胞介素_4 ； (5)細胞培養(yǎng)瓶包被體系包括纖粘連蛋白和Y干擾素； (6)淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551； (7)細胞培養(yǎng)袋。
2.權(quán)利要求I所述DC-CIK細胞分離培養(yǎng)試劑盒在分離和培養(yǎng)DC-CIK細胞中的應(yīng)用，其特征在于具體步驟如下(I)外周血樣單核細胞的分離取新鮮的人外周血樣，在其中加入血液抗凝劑后制得抗凝血樣；向所述抗凝血樣中加入1/3 2/3體積的所述外周血樣處理液，充分混勻，用f I. 5倍體積的所述淋巴細胞分離液分離所得混合液中的單個核細胞，并用所述淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551調(diào)節(jié)所述單個核細胞密度至1 5X IO6個/mL，得到外周血單核細胞懸液；將所述外周血單核細胞懸液用所述外周血樣處理液洗滌，于室溫離心5 10 min,轉(zhuǎn)速150(T2000r/min，取白膜層細胞； (2)DC和CIK細胞的分離 向步驟(I)所得白膜層細胞中加入含有5 10%自體血清的所述淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551，將所得細胞混懸液接種至所述纖粘連蛋白預(yù)包被的細胞培養(yǎng)瓶，為瓶A，并于細胞培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)；f5h后，將瓶A中的懸浮細胞接種至所述Y干擾素預(yù)包被的細胞培養(yǎng)瓶，為瓶B ; (3)DC細胞的誘導(dǎo)增殖 向瓶A中的貼壁細胞加入含有5 10%自體血清的所述淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551，并同時加入終濃度為50(T750U/mL的所述GM-CSF以及終濃度為50(Tl000U/mL的所述白細胞介素_4，于細胞培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)；培養(yǎng)過程中每三天更換一次含有5 10%自體血漿的所述淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551，同時再次加入上述GM-CSF和白細胞介素_4 ；5^7天后，收獲細胞并將其轉(zhuǎn)移至所述細胞培養(yǎng)袋中進行擴大培養(yǎng)，8 10天后收獲細胞，即得DC細胞； (4)CIK細胞的誘導(dǎo)增殖 向瓶B中加入含有5 10%自體血清的所述淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551，并同時加入終濃度為30(Γ500 μ g/mL的所述⑶3、終濃度為10(T300U/mL的所述白細胞介素_1以及終濃度為500(T7500U/mL的所述白細胞介素-2，于細胞培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)；48 72 h后，換用含有5 10%自體血漿以及終濃度為50(Γ750萬U/L所述白細胞介素-2的所述淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551繼續(xù)培養(yǎng)；8 10天后，收獲細胞并將其轉(zhuǎn)移至所述細胞培養(yǎng)袋中進行擴大培養(yǎng)，1Γ16天后收獲細胞，即得CIK細胞； (5)DC與CIK細胞的共培養(yǎng) 將步驟(3)所得DC細胞和步驟(4)所得CIK細胞按照細胞數(shù)量比1:5 1:8的比例混合培養(yǎng)，得到DC-CIK細胞； 所述自體血清分離自添加了血液促凝劑的所述人外周血樣； 所述自體血漿分離自步驟(I)所制抗凝血樣；以上百分含量如無特殊說明均為體積百分含量。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述DC-CIK細胞分離培養(yǎng)試劑盒在分離和培養(yǎng) DC-CIK細胞中的應(yīng)用，其特征在于步驟(3)所述擴大培養(yǎng)是在所述淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551中進行的。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述DC-CIK細胞分離培養(yǎng)試劑盒在分離和培養(yǎng)DC-CIK細胞中的應(yīng)用，其特征在于步驟(4)所述擴大培養(yǎng)是在含有5 10%所述自體血漿以及終濃度50(Γ750萬U/L的所述白細胞介素-2的所述淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551中進行的。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述DC-CIK細胞分離培養(yǎng)試劑盒在分離和培養(yǎng)DC-CIK細胞中的應(yīng)用，其特征在于步驟(5)所述混合培養(yǎng)是在含有f 5%所述自體血漿以及終濃度50(Γ750萬U/L的所述白細胞介素-2的所述淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551中進行的。
全文摘要
本發(fā)明提供一種DC-CIK細胞分離培養(yǎng)試劑盒及其應(yīng)用，該試劑盒包括淋巴細胞分離液、外周血樣處理液、CIK細胞誘導(dǎo)增殖體系、DC誘導(dǎo)增殖體系、細胞培養(yǎng)瓶包被體系、淋巴細胞培養(yǎng)基GT-T551以及細胞培養(yǎng)袋；其在分離和培養(yǎng)DC-CIK細胞中的應(yīng)用，具體步驟如下外周血樣單核細胞的分離、DC和CIK細胞的分離、DC細胞的誘導(dǎo)增殖、CIK細胞的誘導(dǎo)增殖以及DC與CIK細胞的共培養(yǎng)。本發(fā)明試劑盒分離所得淋巴細胞具有很高的純度和活性、CIK細胞增殖速度快、CD3+CD56+雙陽性細胞比例高、操作方法簡單，條件易控，可廣泛應(yīng)用于人和哺乳動物DC-CIK細胞的分離培養(yǎng)。
文檔編號C12N5/078GK102978161SQ201210409099
公開日2013年3月20日 申請日期2012年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月24日
發(fā)明者齊來俊 申請人:江陰齊氏生物科技有限公司