專利名稱：一種新型對蝦多價載體疫苗及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因生物工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種新型對蝦白斑綜合癥病毒(WSSV)和弧菌病多價載體疫苗及其應(yīng)用，具體地說是用于防治對蝦白斑綜合癥和弧菌病的多價載體疫苗及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
對蝦是主要在亞洲和拉丁美洲特別為出口目的生產(chǎn)的高價值水產(chǎn)品，目前我國主要的養(yǎng)殖品種為南美白對蝦、斑節(jié)對蝦和中國對蝦。然而在過去的10多年里，對蝦養(yǎng)殖生產(chǎn)中出現(xiàn)了相當(dāng)嚴(yán)重的問題，其中白斑綜合癥病毒(White spot syndrome virus, WSSV )>桃拉病毒(Taura Syndrome Virus, TSV)和弧菌為重要病害元兇。對奸白斑綜合癥(whitespot syndrome, WSS)是由對蟲下白斑綜合征病毒(WSSV)引起的以感染對奸甲殼內(nèi)側(cè)出現(xiàn)直徑為0. 5 2 mm大小的白色斑點為主要特征的暴發(fā)性傳染病。該病感染率和死亡率都 極高，給養(yǎng)蝦業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。到目前為止，在世界大部分對蝦養(yǎng)殖區(qū)都爆發(fā)了白斑綜合癥，該病已成為全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)面臨的最嚴(yán)重的挑戰(zhàn)之一。除病毒病之外，弧菌病(Vibriosis)也是影響對蝦養(yǎng)殖業(yè)最為常見、危害較重的一類疾病，它多發(fā)于6-9月間，在蝦苗孵育階段臨床癥狀主要表現(xiàn)為發(fā)光，腸道破壞，病害爆發(fā)時可一夜間導(dǎo)致100%死亡率。白斑綜合癥和弧菌病已成為我國和全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展的嚴(yán)重制約因素。白斑綜合癥病毒(WSSV)是屬于Nimaviridae科Whispovirus屬的代表種，是一種無包涵體、有囊膜的桿狀病毒(van Hulten, et al. 2001. Virology. 286 (1):1_22)。它能高致死率地侵染絕大多數(shù)種類的對蝦，此外還可以侵染淡水及海洋生態(tài)中的多種蟹類、克氏鰲蝦類、端足類等甲殼綱動物，具有較廣泛的宿主范圍，給水產(chǎn)養(yǎng)殖造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。因此世界范圍內(nèi)針對對蝦白斑綜合癥病毒的防治技術(shù)開發(fā)受到廣泛關(guān)注。近年的研究表明，白斑綜合癥病毒(WSSV)的重組囊膜蛋白可以誘導(dǎo)對蝦產(chǎn)生抗病保護效應(yīng)。WSSV的主要結(jié)構(gòu)白蛋有VP28、VP19、VP24、VP26、VP15等。VP19和VP28是主要的囊膜蛋白。VP19在囊膜蛋白的成分中所占比例僅次于VP28，國內(nèi)外的研究將其作為設(shè)計免疫預(yù)防性藥物的祀位點(Van Hulten M. C. et al. 2001. Virology. 286: 7-22)。目前，VP19基因已在原核或真核生物表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)物具有顯著的抗病毒保護效應(yīng)，保護效應(yīng)次于VP28囊膜蛋白。VP281是WSSV的次要結(jié)構(gòu)蛋白，由0RF1050編碼，VP281中存在一細(xì)胞黏附序列(R⑶三肽序列)，提示此囊膜蛋白可能在介導(dǎo)WSSV感染時發(fā)揮重要作用(Huang C H, et al. 2002. Journal of General Virology 83: 2385-2392)。目前，國內(nèi)外在研究WSSV疫苗上取得了很大的進展。已研發(fā)的包括有核酸類疫苗(Rout N, et al. 2007. Vaccine. 25:2778-2786; Rajeshkumar S, et al. 2009. 26(3) :429-437 等)和重組疫苗(Witteveldt J，et al. 2004b. J Virol. 78:2057-2061 ；Witteveldt J, et al. 2004a. Fish Shellfish Immunol. 16:571-579 ; Mavichak R. etal. 2010. J Fish Dis. 33:69-74等)。Witteveldt J等發(fā)現(xiàn)VP28的亞單位疫苗對對奸免受WSSV的感染起到重要的保護作用，其免疫保護率達(dá)到70%。寧德剛等人(D. Ning, et al.2011 Journal of Applied Microbiology 111: 1327-1336)通過枯草芽抱桿菌芽抱衣殼蛋白展示系統(tǒng)將VP28蛋白展示到枯草芽孢桿菌的表面，通過口服的方式免疫克氏鰲蝦，21天的免疫保護率為30%。2011年美國Harris等人證明在注射的條件下VP19的免疫保護率要優(yōu)于 VP28 (J. Dustion Loy, DVM global aquaculture advocate May/June 2011)。2007年 Namita Rout 等人(Namita Rout，et al. 2007. Vaccine. 25:2778-2786)制備的 VP281 的DNA疫苗使對蝦免受病毒感染的保護作用達(dá)到了 50天?；谏鲜銮叭说难芯拷Y(jié)果，本發(fā)明采用的WSSV的抗原蛋白是VP281和VP19。弧菌是一類條件致病菌，分布廣泛，當(dāng)水體環(huán)境變化，弧菌尤其是致病性弧菌繁殖迅速，如數(shù)量超過閾值則容易引發(fā)對蝦弧菌病。目前對蝦弧菌病的主要病原為哈氏弧菌、副溶血弧菌和鰻弧菌等。多年來弧菌病主要采用抗生素治療，但抗生素治療帶來一系列嚴(yán)重后果，主要是產(chǎn)生耐藥菌株，造成水體污染。以抗生素為代表的化學(xué)療法已經(jīng)在水產(chǎn)病害防治中的成效逐漸喪失并在越來越多的國家受到限用或禁用。因此探索新的免疫和治療途徑勢在必行。3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為一個傳統(tǒng)糖酵解蛋白基因廣泛存在于幾乎所 有的生物體中。然而近年來的研究表明GAPDH在不同的亞細(xì)胞部位顯示出和糖酵解無關(guān)的多種生物學(xué)活性(Sirove，M. A.，1997，J Cell Biochem，66 (2) :133-40 ；Sirove, M. A.，1999, Biochim Biophys Acta, 1432 (2) :159_184)。在許多微生物(酵母，細(xì)菌和致病性寄生蟲)的研究中發(fā)現(xiàn)，GAPDH不僅存在于細(xì)胞質(zhì)中還定位于細(xì)胞膜上。從而GAPDH做為外膜蛋白的生物學(xué)功能受到廣泛的關(guān)注。1997年Gil Navarro等人首先在白色念珠菌中發(fā)現(xiàn)GAPDH 具有免疫原性(Gil Navarro et al.，1997，J Bacteriol，179 :4992_4999)。目前在布魯氏菌和遲鈍愛德華氏菌中已經(jīng)證實，GAPDH能夠激發(fā)宿主的保護性免疫反應(yīng)(Kawai K.et al,2004, Vaceine,22 :3411-3418 ；Rosinnha G. M. et al. ,2002, J Med Mierobiol, 51:661-671)。目前的研究也表明，許多致病弧菌的GAPDH的同源性非常高，具有很高的保守性。X. Li等已證實GAPDH是重要的廣譜性保護抗原，在不同的病原菌間具有顯著的交叉免疫力(X. Li et al. ,2012, Letters in Applied Microbiology, 54 (I): 1-9)。因此，以哈氏弧菌基因作為應(yīng)用靶點開發(fā)成為針對多種弧菌病的疫苗具有具大的應(yīng)用價值。目前尚未有利用GAPDH作為抗原開發(fā)蝦類疫苗的報道。但目前已有的研究工作也存在著很多不足之處1)給藥不方便，主要以注射的方式給藥，難以進行生產(chǎn)性養(yǎng)殖應(yīng)用；2)現(xiàn)有的疫苗免疫保護期難以超越28天，無法滿足對蝦生產(chǎn)養(yǎng)殖中對免疫保護期的實際需要(40天以上)，故沒有生產(chǎn)應(yīng)用價值和開發(fā)前景。枯草芽孢桿菌subtil is)作為一種好氧性的革蘭氏陽性細(xì)菌,是國際公認(rèn)的具有良好生物安全性的非致病性宿主菌，可作為多種抗原蛋白的表達(dá)載體宿主菌。它在營養(yǎng)缺乏或其他脅迫條件下，能形成具有抗逆性的休眠體芽孢，芽孢在腸道內(nèi)定植后可萌發(fā)成營養(yǎng)體，而營養(yǎng)體枯草芽孢桿菌是常用的益生菌之一，它在水產(chǎn)養(yǎng)殖中可起到凈化水質(zhì)的作用，同時枯草芽孢桿菌對水產(chǎn)中的弧菌、大腸桿菌和桿狀病毒等有害細(xì)菌有很強的抑制作用。而芽胞良好的抗逆性使疫苗能夠耐受胃液中的酸性環(huán)境，儲存時間長，可順利通過胃腸屏障，快速誘導(dǎo)機體產(chǎn)生保護性免疫反應(yīng)?？莶菅挎邨U菌芽孢的形成是一系列基因程序性表達(dá)的結(jié)果。這些基因包括芽孢衣殼蛋白基因以及其調(diào)控基因，如miAcoii 、coiG COiK Co招和cotX等20余種。利用枯草芽孢桿菌芽孢衣殼蛋白的基因為分子載體，通過分子生物學(xué)技術(shù)和芽孢表面展示技術(shù)將外源目的蛋白展示于重組枯草芽孢桿菌芽孢表面，構(gòu)建具有生物活性的重組芽孢備受關(guān)注。2001年Isticato R等人第一次利用CotB作為芽孢表面展示外源抗原的融合載體蛋白，成功地在枯草芽孢桿菌芽孢表面展示了破傷風(fēng)毒素(TTFC)C末端的片段。寧德剛等人(D. Ning, et al. 2011 Journal of AppliedMicrobiology 111: 1327-1336)通過基于CotB和CotC衣殼蛋白基因展示系統(tǒng)將VP28蛋白展示到枯草芽孢桿菌的表面，通過口服的方式免疫克氏鰲蝦，7天的免疫保護率為77%，21天的免疫保護率為30%。蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(protein transduction domain,PTD)或稱細(xì)胞穿膜肽是一條以肽為載體的有效運輸各物質(zhì)進入細(xì)胞及細(xì)胞核的系統(tǒng)。通過PTD攜帶的物質(zhì)有全產(chǎn)蛋白質(zhì)、DNA、化學(xué)藥物、寡核苷酸等?，F(xiàn)在研究最多的、應(yīng)用范圍最廣的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域來源于人免疫缺陷病毒I型的轉(zhuǎn)錄激活因子(trans-activating transcriptional activator,TAT)TAT蛋白。早在1994年，F(xiàn)awell等就已證實，TAT蛋白來源的多肽能夠攜帶外源分子 轉(zhuǎn)導(dǎo)進入細(xì)胞，但是到目前為止，關(guān)于TAT蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域進入細(xì)胞的分子機制還沒有完全研究清楚。盡管其進入細(xì)胞的機制還沒有完全研究透徹，但是TAT已經(jīng)廣泛應(yīng)用于藥物的研究(L. Crombez, et al. 2009, Mol. Ther. , 17 95 - 103 ；S. C. Pero, et al. Cancer96 :1520-1525)和疫苗的開發(fā)(Zhang Y et al, 2012, Journal of virological methods181 ( I ) : 59-67)。2012 年孟小林等人(Yi Z, et al. 2012. Journal of VirologicalMethod 181:59-67)將TAT-VP28制備成亞單位疫苗免疫克氏鰲蝦，發(fā)現(xiàn)14天的免疫保護率提高了 14%，達(dá)到67. 8%。因此，TAT在疫苗方面有著潛在的應(yīng)用價值，但是將TAT蛋白應(yīng)用于水產(chǎn)載體疫苗的開發(fā)目前還處于空白。雖然目前已有將VP28展示于枯草芽孢桿菌表面制備成載體疫苗的研究，也有將TAT-VP28融合蛋白制備成亞單位疫苗的研究，但是其免疫保護期相對較短，在大規(guī)模的水產(chǎn)養(yǎng)殖應(yīng)用上存在諸多弊端。目前國際上只有2007年Namita Rout等人(Namita Rout，etal. 2007. Vaccine. 2778-2786)將對蝦疫苗的免疫保護期提高到50天。作者將VP281和VP28制備成DNA疫苗以注射的方式免疫黑虎蝦，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著檢測免疫保護期的延長VP281的保護效果要優(yōu)于VP28 (25天時VP28免疫保護率是53%，VP281的免疫保護率是50% ；50天時VP28免疫保護率是30%，VP281的免疫保護率是35%)。綜上所述，本發(fā)明的目的在于提供一種可口服并且具有較長免疫保護期的抗對蝦白斑綜合癥和弧菌病的多價載體疫苗，該載體疫苗由枯草芽孢桿菌經(jīng)基因工程改造而獲得，在該重組枯草芽孢桿菌形成芽孢時，芽孢表面展示有對蝦白斑綜合癥病毒VP281蛋白，在該重組枯草芽孢桿菌形成營養(yǎng)體細(xì)胞時，胞外分泌表達(dá)穿膜肽TAT、白斑綜合癥病毒VP19和哈氏弧菌GAPDH構(gòu)建的融合蛋白。在本發(fā)明作出以前，這樣的載體疫苗迄今尚未見于任何類似的報道或發(fā)明專利。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供一種可口服并且具有較長免疫保護期的抗對蝦白斑綜合癥和弧菌病的多價載體疫苗，該疫苗是以枯草芽孢桿菌重組菌株作為核心制備而成的一種新型的口服劑型多價載體疫苗，該疫苗在營養(yǎng)細(xì)胞狀態(tài)時可以分泌穿膜肽、白斑綜合癥病毒VP19和哈氏弧菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)形成的融合蛋白，而在誘導(dǎo)形成芽孢后可產(chǎn)生表面展示對蝦白斑綜合癥病毒VP281蛋白的芽孢。按照本發(fā)明提供的技術(shù)方案一種新型對蝦載體疫苗，其特征在于所述疫苗包括利用基因工程方法得到的枯草芽孢桿菌重組菌株，該菌株的分類命名是枯草芽孢桿菌{Bacillus subti I is) HT5303,已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCNo M2012395。作為本發(fā)明的進一步改進，所述枯草芽孢桿菌重組菌株在營養(yǎng)細(xì)胞狀態(tài)時能夠分泌白斑綜合癥病毒VP19和哈氏弧菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)形成的融合蛋白。作為本發(fā)明的進一步改進，所述枯草芽孢桿菌重組菌株的染色體上還重組整合有由枯草芽孢桿菌分泌信號肽基因、人工合成tat基因、白斑綜合癥病毒VP19基因和哈氏弧菌3-磷酸甘油醒脫氫酶基因形成的相融合所獲得的融合基因序列(SEQ ID NO: I)，該枯草芽孢桿菌重組菌株在營養(yǎng)細(xì)胞時能夠胞外分泌表達(dá)穿 膜肽、白斑綜合癥病毒VP19和哈氏弧菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)形成的融合蛋白。作為本發(fā)明的進一步改進，所述枯草芽孢桿菌重組菌株在芽孢狀態(tài)時能夠在芽孢表面展示對蝦白斑綜合癥病毒VP281蛋白。作為本發(fā)明的進一步改進，所述枯草芽孢桿菌重組菌株的染色體上重組整合有以枯草芽孢桿菌衣殼蛋白基因cotB為分子載體并與對蝦白斑綜合癥病毒VP281蛋白相融合的融合基因片段(SEQ ID NO: 2)，通過誘導(dǎo)該枯草芽孢桿菌重組菌株形成芽孢后，可產(chǎn)生表面展示對蝦白斑綜合癥病毒VP281蛋白。本發(fā)明還提供了所述新型對蝦多價載體疫苗在對蝦養(yǎng)殖中防治白斑綜合癥病和弧菌病的應(yīng)用。作為所述應(yīng)用的進一步改進，所述新型對蝦多價載體疫苗是以枯草芽孢桿菌芽孢形式添加到對蝦飼料及飼料添加劑中，以口服方式免疫。
生物材料樣品保藏枯草芽孢桿菌HT5303 {Bacillus) HT5303，于2012年
10月11日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國武漢，武漢大學(xué)，保藏號CCTCCNo M2012395。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，優(yōu)點在于本發(fā)明的枯草芽孢桿菌疫苗株，形成芽孢后能夠在芽孢表面展不對蟲下白斑綜合癥病毒VP281蛋白，在形成營養(yǎng)細(xì)胞時分泌表達(dá)白斑綜合癥病毒VP19和哈氏弧菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)形成的融合蛋白。本發(fā)明利用芽孢所具有的獨特抗逆性，將該枯草芽孢桿菌多價載體疫苗以芽孢形式添加到對蝦飼料中口服免疫。本發(fā)明構(gòu)建的多價載體疫苗，相對于其它疫苗具有多價交叉保護和保護期長(35天以上)，并且該疫苗能夠添加到飼料中，耐受飼料的高溫定型，具有實際的生產(chǎn)應(yīng)用開發(fā)價值。


圖I是口服免疫接種多價載體疫苗的南美白對蝦在停止免疫一段時間時，攻對蝦白斑綜合癥病毒后的各實驗組的累計死亡率統(tǒng)計曲線圖。圖2是口服免疫接種多價載體疫苗的中國對蝦在停止免疫一段時間時，攻對蝦白斑綜合癥病毒后的各實驗組的累計死亡率統(tǒng)計曲線圖。圖3是口服免疫接種多價載體疫苗的南美白對蝦和中國對蝦在停止免疫28天時，攻弧菌病原菌后的各實驗組的累計死亡率統(tǒng)計曲線圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體附圖和實施例對本發(fā)明做進一步描述。實施例I :抗對蝦白斑綜合癥和弧菌病多價載體疫苗的制備
I、培養(yǎng)基配制
(I)DSM 液體培養(yǎng)基細(xì)菌營養(yǎng)肉湯(Difco) 8g，10% (w/v) KCl 10ml, I. 2% (w/v)MgSO4 ·7Η20 10ml, IM NaOH I. 5ml，調(diào) pH 至 7· 6，ddH20 定容至 1000ml。高壓滅菌后，冷卻至50°C，在使用前分別加入已滅菌的IM Ca (NO3)2、O. OIMMnCl2、ImMFeSO4各lml。(2) PBS 緩沖液=Na2HPO4 · 2H20 2. 74g/L，NaH2PO4 · H2O O. 63g/L，將所述成份溶解 于IOOOml蒸餾水，于121°C滅菌20分鐘。(3)LB 培養(yǎng)基胰蛋白胨(Tryptone) 10g/L,酵母提取物(Yeast extract) 5g/L,氯化鈉(NaCl) 10g/L，調(diào) pH 至 7. O。2、平板培養(yǎng)基復(fù)蘇取_80°C保存的保藏號為CCTCCNo M 2012395的枯草芽孢桿菌重組菌株種子劃線接種于LB固體平板上，在37°C培養(yǎng)過夜，使枯草芽孢桿菌重組菌株復(fù)壯，形成單菌落。3、種子的制備挑取單菌落接種于100ml DSM液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)18h，0D600至2. O,作為種子液。4、發(fā)酵液的制備制備的種子液按照1%的接種量接種到5L生物反應(yīng)器中，采用DSM液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度37°C，通氣量2L/分鐘，pH7. 5，培養(yǎng)25_30h，至芽孢形成率90%以上，終止發(fā)酵，得發(fā)酵液。5、枯草芽孢桿菌芽孢菌粉的制備將上述發(fā)酵液于室溫以5000g離心10分鐘，收集菌泥，向菌泥中加入15%重量百分比的淀粉，噴霧干燥，得到水分重量百分含量〈5%的枯草芽孢桿菌芽孢菌粉，該枯草芽孢桿菌芽孢菌粉即為所述的枯草芽孢桿菌多價載體疫苗。6、疫苗飼料的制備將上述的枯草芽孢桿菌芽孢菌粉與對蝦飼料原料混合制粒，包被大約I X IOltl個芽孢/ g飼料，飼料經(jīng)微粉碎后過40目篩，混合均勻后用小型顆粒飼料機加工成直徑I. 5mm的顆粒飼料備用，飼料加工過程中溫度65-70°C持續(xù)時間約lOmin。
實施例2 : 口服免疫接種南美白對蝦對白斑綜合癥的免疫保護力評價南美白對蝦的飼養(yǎng)購置的試驗用蝦(南美白對蝦)經(jīng)無WSSV攜帶檢測后暫養(yǎng)于3000L養(yǎng)殖水槽內(nèi)，配以過濾的新鮮海水(海水鹽度為25g/L)，養(yǎng)殖水溫維持26±2°C，暫養(yǎng)I周后，剔除不健康個體。繼續(xù)養(yǎng)殖一周后(平均體重10±1. 2g/尾)后，隨機分組，每組30尾，每組平行3水槽(100L/槽)。WSSV病毒懸浮液制備解剖病蝦的鰓和胰腺，稱量lg，剪碎后在液氮下研磨，按1/10 (w/V)的比例，加入 TN 緩沖液(50 mmol/ L Tris-HCl,pH 7. 6,0. 4 mol/ L NaCl)，用玻璃勻漿器在冰浴下勻漿，勻漿液經(jīng)4°C，7000 g離心20 min,棄沉淀；上清經(jīng)0. 45 μ m微孔濾膜過濾后，4°C，20000 g離心50 min,沉淀用TN緩沖液懸浮至終濃度為I X 106IU/ml,
實驗室保存?zhèn)溆?。免疫效力評價上述已分組水族箱分別設(shè)置空白對照組、口服對照組A、口服對照組B、免疫對照組A、免疫對照組B、免疫組A、免疫組B。其中空白對照組、口服對照組A和口服對照組B飼喂正常基礎(chǔ)飼料，免疫對照組A和免疫對照組B飼喂普通枯草芽孢桿菌混拌的基礎(chǔ)飼料，免疫組A和免疫組B飼喂用實施例I制備的疫苗飼料，每組設(shè)置3個平行。將上述各組南美白對蝦連續(xù)飼喂免疫I周，每尾蝦每天免疫Ig飼料，免疫I周后各組停止免疫，均改喂普通基礎(chǔ)飼料，其中口服對照組A、免疫對照組A和免疫組A停止免疫28天后攻毒；口服對照組B、免疫對照組B和免疫組B停止免疫35天后攻毒，攻毒的方式為每尾蝦肌肉注射實驗室儲存的病毒懸液100 μ I。在以后的每天中，觀察并記錄各組對蝦的死亡情況，20天后，各組的累計死亡率穩(wěn)定，統(tǒng)計各組對蝦的累計死亡率，統(tǒng)計結(jié)果如圖I所示。按下述公式計算免疫保護率
免疫保護率％ =(對照組死亡率-試驗組死亡率)/對照組死亡率X100%
經(jīng)計算，對于停止免疫28天后的南美白對蝦來說，實施例I制備的多價載體疫苗對白·斑綜合癥病毒的免疫保護率是70%，僅飼喂枯草芽孢桿菌也有一定的免疫保護作用，其免疫保護率大約是20% ;對于停止免疫35天后的南美白對蝦來說，實施例I制備的多價載體疫苗對白斑綜合癥病毒的免疫保護率是50%，僅飼喂枯草芽孢桿菌的免疫保護率大約是17%。從此結(jié)果可看出本發(fā)明的多價載體疫苗對對蝦白斑綜合癥具有很好的免疫防治效果，可大大降低南美白對蝦的死亡率。同時本發(fā)明提供的疫苗將免疫保護期延長了一個星期，具有更大的應(yīng)用價值。從以上結(jié)果還可看出，枯草芽孢桿菌作為益生菌，可以提高南美白對蝦的免疫力，抵抗外界病原體的侵染。
實施例3 : 口服免疫接種中國對蝦對白斑綜合癥的免疫保護力評價中國對蝦的飼養(yǎng)從天津購置的試驗用蝦(中國對蝦)經(jīng)無WSSV攜帶檢測后暫養(yǎng)于3000L養(yǎng)殖水槽內(nèi)，配以過濾的新鮮海水(海水鹽度為35g/L)，養(yǎng)殖水溫維持25±2°C，暫養(yǎng)I周后，剔除不健康個體。繼續(xù)養(yǎng)殖一周后(平均體重10g±0. 9g/尾)后，隨機分組于100L水槽內(nèi)，每組30尾，每組平行3水槽(100L/槽)。WSSV病毒懸浮液制備解剖病蝦的鰓和胰腺，稱量lg，剪碎后在液氮下研磨，按1/10 (w/V)的比例，加入 TN 緩沖液(50 mmol/ L Tris-HCl,pH 7. 6,0. 4 mol/ L NaCl)，用玻璃勻漿器在冰浴下勻漿，勻漿液經(jīng)4°C，7000 g離心20 min,棄沉淀；上清經(jīng)O. 45 μπι微孔濾膜過濾后，4°C，20000 g離心50 min，沉淀用用TN緩沖液懸浮至終濃度為lX106IU/ml，
實驗室保存?zhèn)溆?。免疫效力評價上述已分組水族箱分別設(shè)置空白對照組、口服對照組A、口服對照組B、免疫對照組A、免疫對照組B、免疫組A、免疫組B。其中空白對照組、口服對照組A和口服對照組B飼喂正常基礎(chǔ)飼料，免疫對照組A和免疫對照組B飼喂普通枯草芽孢桿菌混拌的基礎(chǔ)飼料，免疫組A和免疫組B飼喂用實施例I制備的疫苗飼料。每組設(shè)置3個平行。將上述各組中國對蝦連續(xù)飼喂免疫I周，每尾蝦每天免疫Ig飼料，免疫I周后各組停止免疫，均改喂普通基礎(chǔ)飼料，其中口服對照組A、免疫對照組A和免疫組A停止免疫28天后攻毒；口服對照組B、免疫對照組B和免疫組B停止免疫35天后攻毒，攻毒的方式為每尾蝦肌肉注射實驗室儲存的病毒懸液100 μ I。在以后的每天中，觀察并記錄各組對蝦的死亡情況，20天后，各組的累計死亡率穩(wěn)定，統(tǒng)計各組對蝦的累計死亡率，統(tǒng)計結(jié)果如圖2所示。按下述公式計算免疫保護率
免疫保護率％ =(對照組死亡率-試驗組死亡率)/對照組死亡率X100%
經(jīng)計算，對于停止免疫28天后的中國對蝦來說，實施例I制備的多價載體疫苗對白斑綜合癥病毒的免疫保護率是69% ;對于停止免疫35天后的中國對蝦來說，實施例I制備的多價載體疫苗對白斑綜合癥病毒的免疫保護率是41%。從此結(jié)果可看出本發(fā)明的多價疫苗對對蝦白斑綜合癥具有很好的免疫防治效果，可大大降低中國對蝦的死亡率。同時本發(fā)明提供的疫苗將免疫保護期延長了一個星期，具有更大的應(yīng)用價值。從以上結(jié)果還可看出，枯草芽孢桿菌作為益生菌，可以提高中國對蝦的免疫力，抵抗外界病原體的侵染。實施例4 : 口服免疫接種南美白對蝦和中國對蝦對弧菌病的免疫保護評價
南美白對蝦的飼養(yǎng)購置的試驗用蝦(南美白對蝦)經(jīng)無WSSV攜帶檢測后暫養(yǎng)于3000L 養(yǎng)殖水槽內(nèi)，配以過濾的新鮮海水(海水的含鹽量為25g/L)，養(yǎng)殖水溫維持26 ± 2 °C，暫養(yǎng)I周后，剔除不健康個體。繼續(xù)養(yǎng)殖一周后(平均體重10±1. 2g/尾)后，隨機分組，每組30尾，每組平行3水槽(100L/槽)。中國對蝦的飼養(yǎng)購置的試驗用蝦(中國對蝦)暫養(yǎng)于3000L養(yǎng)殖水槽內(nèi)，配以過濾的新鮮海水(海水的含鹽量為35g/L)，養(yǎng)殖水溫維持25±2°C，暫養(yǎng)I周后，剔除不健康個體。繼續(xù)養(yǎng)殖一周后(平均體重10±0. 9g/尾)后，隨機分組，每組30尾，每組平行3水槽(100L/槽)。病原菌懸浮液的制備在TSB (2% NaCl)液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)哈氏弧菌至0D600為O. 6，然后于室溫以5000rpm離心10分鐘，收集沉淀菌體，用PBS緩沖液懸浮至終濃度為I X 107cfu/ml，實驗室保存?zhèn)溆?。免疫效力評價上述南美白對蝦已分組水族箱分別設(shè)置空白對照組A、口服對照組A、免疫對照組A、免疫組A ;將中國對蝦已分組水族箱分別設(shè)置空白對照組B、口服對照組B、免疫對照組B、免疫組B。其中空白對照組A、空白對照組B、口服對照組A和口服對照組B飼喂正常基礎(chǔ)飼料，免疫對照組A和免疫對照組B飼喂普通枯草芽孢桿菌混拌的基礎(chǔ)飼料，免疫組A和免疫組B飼喂用實施例I制備的載體疫苗。每組設(shè)置3個平行。將上述各組對蝦連續(xù)飼喂免疫I周，每尾蝦每天免疫Ig飼料，免疫I周后各組停止免疫，均改喂普通基礎(chǔ)飼料，停止免疫28天后，對除空白對照組外的各組南美白對蝦分別攻毒，攻毒的方式為注射實驗室保存的哈氏弧菌病原菌懸浮液，每尾蝦的注射劑量為100μ I。在以后的15天中，每天觀察并記錄各組對蝦的死亡情況，15天后，各組的累計死亡率穩(wěn)定，統(tǒng)計各組對蝦的累計死亡率，統(tǒng)計結(jié)果如圖3所示。按下述公式計算免疫保護率
免疫保護率％ =(對照組死亡率-試驗組死亡率％) /對照組死亡率X100%
經(jīng)計算，對于停止免疫28天后的南美白對蝦來說，實施例I制備的多價載體疫苗對弧菌病的免疫保護率是80% ;對于停止免疫28天后的中國對蝦來說，實施例I制備的多價載體疫苗對弧菌病的免疫保護率是74%。從此結(jié)果可看出本發(fā)明的多價疫苗對弧菌病具有很好的免疫防治效果，可大大降低對蝦的死亡率。并且枯草芽孢桿菌作為益生菌，可以提高對蝦的免疫力，抵抗外界病原體的侵染。
權(quán)利要求
1.一種新型對蝦多價載體疫苗，其特征在于所述疫苗包括利用基因工程方法得到的枯草芽孢桿菌重組菌株，該菌株的分類命名是枯草芽孢桿菌(Mcillus subtilism^Q >,已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCCNo M 2012395。
2.如權(quán)利要求I所述的新型對蝦多價載體疫苗，其特征在于所述枯草芽孢桿菌重組菌株在營養(yǎng)細(xì)胞狀態(tài)時能夠分泌白斑綜合癥病毒VP19和哈氏弧菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)形成的融合蛋白。
3.如權(quán)利要求2所述的新型對蝦多價載體疫苗，其特征在于所述枯草芽孢桿菌重組菌株的染色體上有由枯草芽孢桿菌sacB基因、人工合成tat基因和白斑綜合癥病毒VP19基因和哈氏弧菌3-磷酸甘油醒脫氫酶基因相融合所獲得的sacB-tat-vpl9-gapdh融合基因序列(SEQ ID NO: I)。
4.如權(quán)利要求I所述的對蝦多價載體疫苗，其特征在于所述枯草芽孢桿菌重組菌株在形成芽孢后能夠在芽孢表面展示對蝦白斑綜合癥病毒VP281蛋白。
5.如權(quán)利要求4所述的對蝦多價載體疫苗，其特征在于所述枯草芽孢桿菌重組菌株的染色體上整合有以枯草芽孢桿菌衣殼蛋白基因cotB為分子載體并與對蝦白斑綜合癥病毒VP281基因相融合的融合基因片段(SEQ ID NO: 2)。
6.權(quán)利要求Γ5任一項所述的新型對蝦多價載體疫苗在對蝦養(yǎng)殖中防治白斑綜合癥病毒和弧菌引發(fā)病害的防治應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述抗對蝦白斑綜合癥和弧菌病多價載體疫苗是以枯草芽孢桿菌芽孢形式添加到對蝦飼料及飼料添加劑中，以口服方式免疫。
8.如權(quán)利要求6或7所述的應(yīng)用，其特征在于所述的對蝦為中國對蝦和南美白對蝦。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型對蝦多價載體疫苗，其特征在于所述疫苗包括利用基因工程方法得到的枯草芽孢桿菌重組菌株，該菌株的分類命名是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)HT5303，已保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC NOM 2012395。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌疫苗株，形成芽孢后能夠在芽孢表面展示對蝦白斑綜合癥病毒VP281蛋白，在形成營養(yǎng)細(xì)胞時分泌表達(dá)穿膜肽、白斑綜合癥病毒VP19和哈氏弧菌3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)形成的融合蛋白。本發(fā)明的多價載體疫苗相對于其它疫苗具有交叉保護和保護期長，并且該疫苗能夠添加到飼料中，耐受飼料的高溫定型，具有廣闊的商業(yè)開發(fā)景。
文檔編號C12N15/34GK102895677SQ20121042486
公開日2013年1月30日 申請日期2012年10月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月30日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請人:無錫海健生物科技有限公司