重組g-csf(15-75)多肽載體的構(gòu)建及表達(dá)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域，具體涉及一種G-CSF(15-75)多肽的表達(dá)載體構(gòu)建及 其在畢赤酵母菌中的表達(dá)。
【背景技術(shù)】
[0002] 粒細(xì)胞刺激因子（granulocyte colony stimulating factor，G-CSF)的主要作用 是刺激中性粒細(xì)胞系造血細(xì)胞的增殖、分化，增加外周血中性粒細(xì)胞數(shù)量，活化中性粒細(xì)胞 功能，化療后腫瘤患者注射G-CSF后可提高血循環(huán)中性粒細(xì)胞的水平，這種作用可能與縮 短某些骨髓細(xì)胞進(jìn)入S期的時(shí)間以及增加生成粒細(xì)胞的祖細(xì)胞數(shù)量有關(guān)。
[0003] G-CSF于1991年被美國(guó)FDA投放市場(chǎng)，用于治療放療后中性粒細(xì)胞減少癥，現(xiàn)在已 經(jīng)有多家在生產(chǎn)銷售，并且開發(fā)出大腸桿菌表達(dá)復(fù)性的人G-CSF蛋白上市，長(zhǎng)效的PEG化的 G-CSF也獲得FDA的批準(zhǔn)，國(guó)內(nèi)開發(fā)的G-CSF二聚體F-627也已完成II期臨床，并取得較好 的效果。
[0004] 中國(guó)專利CN03132702. 3中公開了表達(dá)人粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子的酵母重 組株及rhGM-CSF的純化方法，其中將克隆修飾的M-CSF基因插入pGAPZa-A的載體中，最后 表達(dá)產(chǎn)物的比活性在3. 4X 107IU/mg以上。
[0005] 中國(guó)專利CN103233053A中公開了一種重組人粒細(xì)胞刺激因子的生產(chǎn)方法，采用 重組質(zhì)粒PKG931作為表達(dá)載體，以大腸桿菌HB101作為受體菌，提高生產(chǎn)效率，蛋白純度為 95 %左右，但是獲得了重組人粒細(xì)胞刺激因子的表達(dá)量?jī)H僅有50 %。
[0006] 中國(guó)專利CN103114115中公開一種一種重組人粒細(xì)胞集落刺激生長(zhǎng)因子用微生 物篩選而制備的方法，其藥物組合物及制劑選用重組人粒細(xì)胞集落刺激因子的工程菌進(jìn)行 發(fā)酵培養(yǎng)；對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基所得菌體進(jìn)行超聲破碎，收集包涵體，用包涵體洗滌液進(jìn)行洗滌后 低溫離心；包涵體中加入包涵體溶解液，4°C條件下8~12小時(shí)后，離心得到包涵體提取液； 采用SephacrylS-200凝膠柱對(duì)提取液進(jìn)行分離，收集復(fù)性的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子 餾分；再采用Sephade XG25柱進(jìn)行分離，最終得到的的高純度、高活性的G-CSF，但回收率只 有 47. 5%。
[0007] 中國(guó)專利CN103233053中該開一種一種重組人粒細(xì)胞刺激因子的生產(chǎn)方法，其中 公開了大腸桿菌表達(dá)重組人粒細(xì)胞刺激因子的工程菌株進(jìn)行培養(yǎng)獲得包涵體，所述大腸桿 菌表達(dá)重組人粒細(xì)胞刺激因子的工程菌株為PKG931/HB101，培養(yǎng)方法包括擴(kuò)增培養(yǎng)和發(fā)酵 罐培養(yǎng)，均采用含酵母和蛋白胨的無抗生素培養(yǎng)基，采用高壓均質(zhì)機(jī)破菌，經(jīng)過變性、復(fù)性 和層析，得到G-CSF表達(dá)量為50 %。
[0008] 目前，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)的G-CSF大多數(shù)為大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物，使用大腸桿菌在生產(chǎn)過程 中需要復(fù)性，且復(fù)性率低，比活性也相對(duì)較低；使用聚乙二醇修飾的G-CSF，其生物活性會(huì) 下降；釀酒酵母工程菌株的表達(dá)屬于非整合性表達(dá)，表達(dá)過程不穩(wěn)定、產(chǎn)物表達(dá)量低和基因 容易丟失的缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 針對(duì)以上缺陷，本發(fā)明的目的之一在于提供一種重組的表達(dá)G-CSF(15_75)多肽 載體及其該載體構(gòu)建、表達(dá)方法，本發(fā)明通過對(duì)G-CSF (15-75)基因進(jìn)行優(yōu)化，該多肽含有 G-CSF生物功能所必需的活性中心，優(yōu)化后的多肽片段較小，表達(dá)量在2. 8g/L以上，且比活 性為 1. 5X108IU/mg 以上。
[0010] 本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供優(yōu)化后G-CSF(15-75)基因以及優(yōu)化后該基因編碼 的氨基酸序列。
[0011] 本發(fā)明的第三個(gè)目的在于一種含有上述載體的重組畢赤酵母菌 pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115。
[0012] 本發(fā)明的第四個(gè)目的提供提供上述畢赤酵母菌pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115的 制備方法。
[0013] 本發(fā)明的畢赤酵母菌pPIC9K-G-CSF(15-75)-GSll已經(jīng)于2015年4月13日在中 國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心保藏（CGMCC)，并收到保藏登記號(hào)CGMCC N0 10713。
[0014] 本發(fā)明的保藏菌種為一株巴斯德畢赤酵母菌（Pichia pastoris)G-CSF(15_75) CGMCC NO : 10713。
[0015] 本發(fā)明的目的是通過如下方法實(shí)現(xiàn)的：
[0016] 首先，pPIC9K-G-CSF(15-75)表達(dá)載體的構(gòu)建，本發(fā)明選取G-CSF中起生物學(xué)活性 所必需的的氨基酸序列，即第15至75氨基酸序列，包含2個(gè)完整的二硫鍵，利于保持其活 性。然后用畢赤酵母常偏愛密碼子對(duì)所選氨基酸序列的G-CSF(15-75)多肽基因進(jìn)行優(yōu)化， 并在5'端加EcoR I位點(diǎn)和kex2酶切位點(diǎn)，3'端加TAA終止密碼子和Not I位點(diǎn)。進(jìn)一步 的，將優(yōu)化的G-CSF (15-75)基因克隆入pP IC9K表達(dá)載體中，制備成pP IC9K-G-CSF (15-75) 表達(dá)載體，并將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5 a中，LB氨芐培養(yǎng)基篩選陽(yáng) 性克隆。
[0017] 然后將pPIC9K-G-CSF(15-75)重組質(zhì)粒線性化后電轉(zhuǎn)化到畢赤酵母菌GS115中， 電轉(zhuǎn)化的條件為2mm電擊杯，電壓1500v，電擊時(shí)間5ms，再利用不同濃度的G418-YPD平 板篩選陽(yáng)性克隆，對(duì)pP IC9K-G-CSF (15-75) -GS115菌落進(jìn)行PCR鑒定，以驗(yàn)證目的基因 片段是否整合到畢赤酵母GS115中，所得Tricine-SDS-PAGE電泳和Western Blot鑒定 G-CSF(15-75)多肽的表達(dá)。
[0018] 本發(fā)明為了進(jìn)一步驗(yàn)證G-CSF(15-75)多肽的作用，對(duì)重組畢赤酵母 pPIC9K_G_CSF(15-75)-GS115 進(jìn)行 30L 上罐發(fā)酵，發(fā)酵液經(jīng)過 phenyl sephrose 6fast flow疏水層析柱純化、DEAE sephrose fast flow層析柱純化、Syperdex75層析柱純化， 所獲得的純品按照"中華人民共和國(guó)藥典三部"方法測(cè)定其生物學(xué)比活性在1. 5X108IU/mg 以上。
[0019] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0020] (1)采用pPIC9K-G-CSF(15-75)最為表達(dá)載體，并將其整合到畢赤酵母GS115中， 利用畢赤酵母菌PPIC9K-G-CSF (15-75) -GS115作為表達(dá)G-CSF (15-75)多肽的工程菌，所得 到的G-CSF(15-75)多肽片段小且分泌表達(dá)，表達(dá)量在2. 8g/L以上。
[0021] (2)G-CSF(15-75)多肽直接分泌到培養(yǎng)液中，純化方法簡(jiǎn)單，經(jīng)過普通的疏水層 析、陰離子交換和凝膠過濾之后，經(jīng)HPLC檢測(cè)蛋白純度在99. 5 %以上，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
[0022] (3)G-CSF(15_75)多肽表達(dá)量較高，易于純化，純化后純品的生物學(xué)比活性在 1. 5X108IU/mg 以上。
[0023] (4)采用畢赤酵母菌pPIC9K-G-CSF(15-75)-GS115作為發(fā)酵菌種，整個(gè)發(fā)酵過程 需要的時(shí)間為100小時(shí)，發(fā)酵周期較短，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。
【附圖說明】
[0024] 圖l、pPIC9K-G-CSF(15_75)多肽質(zhì)粒載