專利名稱：一種檢測M BCR融合基因mRNA表達(dá)量的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測M BCR融合基因mRNA表達(dá)量的試劑盒。
背景技術(shù)：
慢性粒細(xì)胞白血病(chronic myelocytic leukemia, CML)患者的血細(xì)胞中除了90%出現(xiàn)Phl染色體陽性以外，還多伴隨有t (9 ；22) (q34 ；qll)易位，即位于9號染色體長臂上的abl原癌基因易位到22號染色體長臂的斷裂點(diǎn)集中區(qū)bcr，形成M BCR融合基因。該融合基因負(fù)責(zé)編碼具有增強(qiáng)酪氨酸激酶的活性的P210蛋白，從而改變細(xì)胞多種蛋白質(zhì) 酪氨酸磷酸化水平和細(xì)胞微絲機(jī)動蛋白的功能，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)異常，使細(xì)胞喪失對周圍環(huán)境的反應(yīng)性，延緩凋亡的發(fā)生。BCR-ABL融合基因轉(zhuǎn)陰率和Ph+細(xì)胞消失率與慢性粒細(xì)胞白血病患者的疾病進(jìn)展密切相關(guān)。一旦BCR-ABL融合基因轉(zhuǎn)陰率和Ph+細(xì)胞消失率得不到及時改善，慢性粒細(xì)胞白血病將有可能從慢性期發(fā)展到加速期和急變期。酪氨酸激酶抑制劑是治療慢性粒細(xì)胞白血病的主要藥物，但有患者對此類藥物存在原發(fā)性抵抗或者由于長期給予此藥而出現(xiàn)繼發(fā)性抵抗，發(fā)生藥物抵抗的主要原因與M BCR融合基因的表達(dá)水平有關(guān)。M BCR融合基因表達(dá)水平高的急變期多表現(xiàn)對此類藥物的敏感性降低，同時誘變出對此類藥物抵抗的突變克隆的時間縮短。實(shí)時突光定量PCR (Polymerase Chain Reaction,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)實(shí)現(xiàn)了 PCR從定性到真正意義的定量的飛躍，為人類疾病基因的定量檢測提供了一個行之有效的檢測工具，與普通PCR相比具有更強(qiáng)的特異性和靈敏度，而且檢測快速、降低了污染等優(yōu)點(diǎn)，但目前尚未有關(guān)實(shí)時熒光定量PCR方法檢測M BCR融合基因。

發(fā)明內(nèi)容
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明實(shí)施例提供了一種檢測M BCR融合基因mRNA表達(dá)量的試劑盒。本發(fā)明所提供的檢測M BCR融合基因mRNA表達(dá)量的試劑盒，包括檢測用引物、熒光探針、cDNA第一鏈合成試劑、熒光定量PCR混合液、陰性對照和陽性對照，所述檢測用引物、熒光探針包括M BCR融合基因引物、內(nèi)參基因ABL引物及Taqman熒光探針，其中M BCR融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: I所示；M BCR融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:2所示；M BCR融合基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO: 3所示；ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:4所示；ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:5所不；ABL基因Taqman突光探針如序列表中SEQ ID NO:6所示；所述cDNA第一鏈合成試劑含有MgCl2、逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、dNTPs、RNA酶抑制劑、Oligo (dT) 15、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和無RNase去離子水；所述熒光定量PCR混合液含有PCR預(yù)混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、UNG 酶和無 RNase 去離子水。進(jìn)一步地，所述試劑盒還包括內(nèi)部陽性控制序列、內(nèi)部陽性控制序列的引物和Taqman熒光探針，其中內(nèi)部陽性控制序列如序列表中SEQ ID NO: 7所示；內(nèi)部陽性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID N0:8所示；內(nèi)部陽性控制序列的下游引物如序列表中SEQIDNO:9所示；內(nèi)部陽性控制序列的Taqman突光探針如序列表中SEQ ID NO: 10所示。進(jìn)一步地，所述M BCR融合基因Taqman熒光探針和ABL基因Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報告基團(tuán)FAM，3’端均連接有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，所述內(nèi)部陽性控制序列Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報告基團(tuán)TET，3’端連接有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。具體地，所述內(nèi)參基因ABL的核酸序列如序列表中SEQ ID NO: 11所示。具體地，所述陰性對照為去離子水；所述陽性對照為含有M BCR融合基因的總RNA樣品。 具體地，所述cDNA第一鏈合成試劑為25mmol/L MgCl24uL, IOX逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液2u L, IOmmoI/L dNTP 2 u L, RNA 酶抑制劑 0. 5 u L, Oligo (dT) 150. 5 u g, AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶 I. 5U和無RNase去離子水,總體積11 ii L。具體地，所述熒光定量PCR的混合液(以反應(yīng)體系終濃度表示)為1X的PCR預(yù)混合液(原液為 2XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、
0.2U/ ii L的Taq酶和0. 01-0. 05U/ ii L的UNG酶以及無RNase去離子水。本發(fā)明試劑盒的優(yōu)點(diǎn)和效果如下(I)敏感性高可重復(fù)敏感度為0.01%，即10000個細(xì)胞中有一個含M BCR融合基因就可以被檢測出。(2)特異性強(qiáng)使用特異性探針對定量分子進(jìn)行識別，準(zhǔn)確性高，同時，靶序列由引物和探針雙重控制，特異性好且假陽性低。(3)簡便安全操作簡單、安全、自動化程度高而且防止污染。擴(kuò)增和檢測可以在同一管內(nèi)檢測，不需要開蓋，不易被污染，同時擴(kuò)增和檢測一步完成，不需要后期處理，無需要擔(dān)心放射性污染。(4)全程監(jiān)控本發(fā)明實(shí)施例提供的試劑盒引入了內(nèi)部陽性控制質(zhì)量控制體系，對檢測過程進(jìn)行全程質(zhì)量監(jiān)控，有效避免假陽性或者假陰性。(5)快速速度快并且高通量，檢測實(shí)驗(yàn)可在3-4小時完成。本發(fā)明的試劑盒能快速、準(zhǔn)確的定量檢測M BCR融合基因mRNA水平，有效杜絕了假陽性和假陰性的發(fā)生，用于慢性粒細(xì)胞白血病的診斷及治療過程中微小殘留病的監(jiān)測，為慢性粒細(xì)胞白血病的診斷、制定治療方案及療效評價和預(yù)后提供了重要的檢測手段。


為了更清楚地說明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖IA是本發(fā)明實(shí)施例2提供的試劑盒的熒光實(shí)時定量PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增I.OxlO6-L OxlO3拷貝的內(nèi)部陽性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品的熒光曲線圖；圖IB是由本發(fā)明實(shí)施例2提供的試劑盒的熒光實(shí)時定量PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增
I.OxlO6-L OxlO3拷貝的內(nèi)部陽性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品的熒光曲線圖得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖2A是本發(fā)明實(shí)施例2提供的試劑盒的熒光實(shí)時定量PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增I. OxlO6-L OxlO3拷貝的ABL標(biāo)準(zhǔn)品的熒光曲線圖；圖2B是由本發(fā)明實(shí)施例2提供的試劑盒的熒光實(shí)時定量PCR反應(yīng)體系擴(kuò)增
I.OxlO6-L OxlO3拷貝的ABL標(biāo)準(zhǔn)品熒光曲線圖得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面結(jié)合附圖對本發(fā)明實(shí)施方式作進(jìn)一步地詳細(xì)描述。實(shí)施例I.本發(fā)明試劑盒的制備I、特異性的引物和熒光探針的設(shè)計(jì)根據(jù)基因序列(ABL基因序列、BCR基因序列來源于美國國家生物技術(shù)信息中心核酸數(shù)據(jù)庫，其中ABL基因ID分別為25，參考序列號為NM 005157. 4 ;BCR基因ID分別為613，參考序列號為NG_009244. I)分別設(shè)計(jì)對上述各基因序列特異的引物和熒光探針。2、按照下列試劑盒的組成配制試劑盒的各組分本發(fā)明試劑盒組成如下①RNA 提取試劑Trizol 試劑(Invitrogen 公司，產(chǎn)品貨號15596_026/100ml)，每Iml骨髓組織加入ImlTrizol快速提取慢性粒細(xì)胞白血病患者骨髓組織RNA。②cDNA 第一鏈合成試劑盒(RT-PCR)(Fermentas 公司，產(chǎn)品貨號K1622):25mmol/LMgCl24 u L, IOX 逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 2u L, IOmmoI/L dNTP 2 u L, RNA 酶抑制劑(RNasin，一種酸性糖蛋白)0. 5 u L, Oligo (dT) 150. 5 u g, AMV逆轉(zhuǎn)錄酶I. 5U和無RNase去離子水,總體積11 u L0③引物、探針和標(biāo)準(zhǔn)品包括M BCR融合基因引物、內(nèi)部陽性控制序列引物、內(nèi)參基因ABL引物以及與引物對應(yīng)的Taqman熒光探針，具體如下M BCR融合基因上游引物序列為5’-AAACTCCAGACTGTCCACAGCAT-3’(序列表中序列I);M BCR融合基因下游引物序列為5’-TAGCCTAAGACCCGGAGCITT-3’(序列表中序列
2)；M BCR 融合基因 Taqman 熒光探針FAM 5’ -CGCTGACCATCAAT-3 ’ TAMRA (序列表中序列3)；內(nèi)部陽性控制序列為5’ -GUGUGAAACUCCAGACUGUCCACAGCAUUC CGCUGAGCAUGAAUAACGAAGACUAAAGGUGAAAAGCUCCGGGUCUUAGGCUAUAAUC-3，(序列表中序列 7 );內(nèi)部陽性控制序列上游引物序列為5’ -GTGTGAAACTCCAGACTGTCCACA-3’(序列表中序列8)；內(nèi)部陽性控制序列下游引物序列為5’-GTTATAGCCTAAGACCCGGAG-3’(序列表中序列9)；內(nèi)部陽性控制序列Taqman熒光探針TET 5’ -TCCGCUGAGCATG-3’ TAMRA (序列表中序列10)。ABL 基因序列為5，-CAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATCACGCCAGTCAACAGTCTGGAGAAACACTCCTGGTACCATGGGCCTGTGTCCCGCAATGCCGCTGAGTATCTGCTGAGCAGCGGGATCAATGGCAGCTTCTTGGTGCGTGAGAGTGAGAGCAGTCCTGGC-3’(序列表中序列11);ABL基因上游引物序列為5’ -CCGGGTCTTAGGCTATAATCACA-3，(序列表中序列4)；ABL基因下游引物序列為5’ -GCCTTGGCCATTTTTGGTT-3’(序列表中序列5)；ABL 基因 Taqman 熒光探針FAM 5’ -TGGTGTGAAGCCC-3’ TAMRA (序列表中序列 6);
其中，內(nèi)部陽性控制序列為人工合成序列，包含一部分已知的M BCR融合基因序列和一部分人工合成序列；內(nèi)部陽性控制序列和ABL基因序列分別用作標(biāo)準(zhǔn)品。上述引物序列、控制序列、基因序列、基因序列和探針序列均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。④陰性對照和陽性對照以去離子水為陰性對照，以含有M BCR融合基因的總RNA樣品為陽性對照，采用上述實(shí)施例I中提供的本發(fā)明試劑盒組成①RNA提取試劑=Trizol試劑(Invitrogen公司，產(chǎn)品貨號15596-026/100ml),按每Iml骨髓組織加入Iml Trizol試劑的比例，快速提取已經(jīng)確診的含有M BCR融合基因的慢性粒細(xì)胞白血病患者的骨髓組織RNA，作為陽性對照。⑤M BCR融合基因熒光定量PCR的反應(yīng)液由熒光定量PCR混合液和檢測MBCR融合基因的引物、探針組成1X的PCR預(yù)混合液(Qiagen公司，產(chǎn)品貨號210212，2 XPCRPremix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/u L的Taq酶和0. 01-0. 05U/ y L的UNG酶、0. 25pmol/y L的M BCR融合基因上游引物(序列表中序列1)、0. 25pmol/u L的M BCR融合基因下游引物(序列表中序列2)、0. 3pmol/u L的M BCR融合基因Taqman熒光探針(序列表中序列3)、0. 25pmol/uL的內(nèi)部陽性控制序列上游引物(序列表中序列8)、0. 25pmol/uL的內(nèi)部陽性控制序列下游引物(序列表中序列9)、0. 3pmol/uL的內(nèi)部陽性控制序列Taqman熒光探針(序列表中序列10)(以上所有的濃度都是指PCR反應(yīng)體系的終濃度)。通常取1-2 u L的模板(包括被測樣品RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA和內(nèi)部陽性控制序列RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA)，其余為無RNase去離子水，反應(yīng)總體積通常為20 u L0⑥ABL內(nèi)參基因熒光定量PCR反應(yīng)液由熒光定量PCR混合液和檢測ABL內(nèi)參基因的引物、探針組成=IX的PCR預(yù)混合液(Qiagen公司，產(chǎn)品貨號210212, 2XPCRPremix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/u L 的 Taq 酶和0. 01-0. 05U/ u L的UNG酶、0. 25pmol/u L的ABL內(nèi)參基因上游引物(序列表中序列4)、0. 25pmol/ ii L的ABL內(nèi)參基因下游引物(序列表中序列5)、0. 3pmol/ u L的ABL基因Taqman熒光探針(序列表中序列6)(以上所有的濃度都是指PCR反應(yīng)體系的終濃度)。檢測時，力口A ABL基因標(biāo)準(zhǔn)品模板2 u L,其余為無RNase去離子水,反應(yīng)總體積通常為20 u L。⑦內(nèi)部陽性控制序列熒光定量PCR反應(yīng)液由熒光定量PCR混合液和檢測內(nèi)部陽性控制序列的引物、探針組成=IX的PCR預(yù)混合液(Qiagen公司，產(chǎn)品貨號=210212,2 XPCRPremix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ y L 的Taq酶和0. 01-0. 05U/ U L的UNG酶、0. 25pmol/uL的內(nèi)部陽性控制序列上游引物(序列表中序列8)、0. 25pmol/uL的內(nèi)部陽性控制序列下游引物(序列表中序列9)、0. 3pmol/uL的內(nèi)部陽性控制序列Taqman熒光探針(序列表中序列10)(以上所有的濃度都是指PCR反應(yīng)體系的終濃度)。檢測時，通常取1-2 U L的模板(內(nèi)部陽性控制序列RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA)，其余為無RNase去離子水,反應(yīng)總體積通常為20 u L。3、PCR擴(kuò)增程序的設(shè)定在Iightcycler儀器上先經(jīng)過50°C 10s, 95°C lOmin,然后再經(jīng)過95°C 15s，60°C lmin，共40個循環(huán)。實(shí)施例2.用實(shí)施例I制備的試劑盒檢測M BCR融合基因mRNA的表達(dá)量以檢測30例慢性粒細(xì)胞白血病患者骨髓組織標(biāo)本結(jié)果為例。
用實(shí)施例I提供的本發(fā)明的試劑盒檢測M BCR融合基因mRNA表達(dá)量的檢測流程為首先根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)特異性的引物和熒光探針。其次獲取臨床白血病患者骨髓組織樣本，快速提取組織RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR合成cDNA第一鏈；先配制ABL內(nèi)參基因和內(nèi)部陽性控制序列的熒光定量PCR反應(yīng)液，將內(nèi)部陽性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品和ABL標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至拷貝數(shù)/mL為I. OxlO3U. OxlO4U. OxlO5和I. OxlO6，分別制作內(nèi)部陽性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖IA和圖IB所ttO和ABL基因標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖2A和圖2B所ttO，然后再配制M BCR融合基因熒光定量PCR反應(yīng)液，進(jìn)行熒光定量PCR檢測樣品，在熒光定量PCR儀數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)中讀出CT值結(jié)果。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，首先分析內(nèi)部陽性控制序列擴(kuò)增結(jié)果，如果其Ct值小于33，提示整個檢測過程有效，如果其Ct值大于35，提示檢測失敗，則需要重新進(jìn)行檢測，如果其Ct值位于33 35之間，需要重復(fù)檢測。當(dāng)內(nèi)部陽性控制序列Ct值小于33時，將實(shí)時熒光定量PCR所得數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，分別計(jì)算M BCR融合基因及ABL基因的Ct值，兩者之差即為ACt值。最后，熒光定量PCR結(jié)果采用軟件分析，并標(biāo)化計(jì)算樣本數(shù)據(jù)。具體步驟如下①慢性粒細(xì)胞白血病骨髓組織總RNA的抽提按RNA抽提純化的方法抽提慢性粒細(xì)胞白血病骨髓組織樣品的總RNA。提取的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性，通過紫外分光光度計(jì)測定260nm與280nm光密度值計(jì)算RNA的純度與濃度，用0. 1% DEPC處理的水調(diào)節(jié)抽提的各樣品RNA至相同濃度。②反轉(zhuǎn)錄合成cDNA :取L上述RNA提取液，在70°C保溫lOmin，隨后加入實(shí)施例I提供的本發(fā)明試劑盒組成②cDNA第一鏈合成試劑盒，即25mmol/L MgCl24uL,10X逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 2u L, IOmmoI/L dNTPs 2 u L, RNA 酶抑制劑 0. 5 u L, Oligo (dT) 150. 5 y g 和 AMV逆轉(zhuǎn)錄酶I. 5U,補(bǔ)加無RNase去離子水至總體積20 ii L,于42°C保溫15min,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA第一鏈。反應(yīng)結(jié)束后，加熱至99°C，5min以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，加20 y L無菌水混勻置冰箱_20°C保存。取I ii L濃度為2 U g/ml內(nèi)部陽性控制序列RNA(序列表中序列7)，在70°C保溫IOmin,隨后加入實(shí)施例I提供的本發(fā)明試劑盒組成②cDNA第一鏈合成試劑盒，即25mmol/L MgCl24ii L，10X 逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 L，10mmol/L dNTPs 2 y L，RNA 酶抑制劑 0. 5 y L，Oligo (dT) 150. 5 ii g和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶I. 5U，補(bǔ)加無RNase去離子水至總體積20 y L，于42°C保溫15min,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng),合成cDNA。反應(yīng)結(jié)束后,加熱至99°C, 5min以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，加20 ii L無菌水混勻置冰箱_20°C保存。取I ii L濃度為2 U g/ml的陽性對照RNA，在70°C保溫lOmin，隨后加入實(shí)施例I提供的本發(fā)明試劑盒組成②cDNA第一鏈合成試劑盒，即25mmol/L MgCl24uL,10X逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 2u L, IOmmoI/L dNTPs 2 u L, RNA 酶抑制劑 0. 5 u L, Oligo (dT) 150. 5 y g 和 AMV逆轉(zhuǎn)錄酶I. 5U,補(bǔ)加無RNase去離子水至總體積20 ii L,于42°C保溫15min,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA。反應(yīng)結(jié)束后，加熱至99°C，5min以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，加20 y L無菌水混勻置冰箱-20°C保存。③將內(nèi)部陽性控制基因序列標(biāo)準(zhǔn)品和ABL標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至拷貝數(shù)/mL為I. OxlO3U. OxlO4U. OxlO5和l.OxlO6，用實(shí)施例I提供的內(nèi)部陽性控制序列和ABL內(nèi)參基因的熒光定量PCR反應(yīng)液，分別制作內(nèi)部陽性控制序列標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖IA和圖IB所示)和ABL標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖2A和圖2B所示)。
④M BCR融合基因熒光定量PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為20 y L :含I X PCR預(yù)混合液(Qiagen 公司，產(chǎn)品貨號:210212, 2 XPCR Premix) 10. Ou L, 2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ y L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ y L 的 UNG 酶，M BCR 融合基因上游引物終濃度0. 2iimol/L，M BCR融合基因下游引物終濃度0. 2iimol/L，M BCR融合基因Taqman熒光探針終濃度0. 3 U mol/L,被測樣品RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNAl. 0 y L，同時加入內(nèi)部陽性控制序列的上、下游引物終濃度均為0. 2iimol/L，內(nèi)部陽性控制序列Taqman熒光探針終濃度0. 3 u mol/L,終濃度為0. 2 u mol/L的內(nèi)部陽性控制序列RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA(②中反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA),加入超純水至總體積20 y L。在Iightcycler突光定量PCR儀上反應(yīng)擴(kuò)增條件95°C IOmin預(yù)變性，然后95 V 15s，60。。lmin擴(kuò)增40個循環(huán)，擴(kuò)增過程中儀器自動收集熒光信號。⑤ABL內(nèi)參基因熒光定量PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為20 ii L :含2XPCR混合液(Qiagen 公司，產(chǎn)品貨號:210212, 2XPCR Premix) 10. Ou L, 2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ y L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ y L 的 UNG 酶，ABL 基因上、下游引物終濃度均為0. 2 ii mol/L, ABL基因的Taqman熒光探針終濃度0. 2 y mol/L, ABL基因cDNAl. OuL,加入無RNase去離子水補(bǔ)至總體積20 y L。在Iightcycler突光定量PCR儀上反應(yīng)擴(kuò)增條件為95°C IOmin預(yù)變性，然后95°C 15s, 60°C lmin擴(kuò)增40個循環(huán)，擴(kuò)增過程中儀器自動收集熒光信號。⑥陽性對照、陰性對照熒光定量PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)體系為20 ii L :含2XPCR混合液(Qiagen公司，產(chǎn)品貨號:210212, 2XPCR Premix)10. 0 u L, 2. 5-4. OmM的Mg2+、0. 2-0. 4mM的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ y L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ y L 的 UNG 酶，M BCR融合基因上、下游引物終濃度均為0. 2iimol/L，M BCR融合基因Taqman熒光探針終濃度0. 3 u mol/L,陽性對照RNA反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA LOuL或者陰性對照去離子水I. 0 y L，加入無RNase去離子水補(bǔ)至總體積20 y L。在Iightcycler熒光定量PCR儀上反應(yīng)擴(kuò)增條件為95°C IOmin預(yù)變性，然后95°C 15s，60°C lmin擴(kuò)增40個循環(huán)，擴(kuò)增過程中儀器自動收集突光信號。⑦數(shù)據(jù)收集處理和分析PCR擴(kuò)增結(jié)束后，首先分析內(nèi)部陽性控制序列擴(kuò)增結(jié)果，如果其Ct值小于33，提示整個檢測過程有效，如果其Ct值大于35，則需要重新進(jìn)行檢測。當(dāng)內(nèi)部陽性控制序列Ct值小于33時，將實(shí)時熒光定量PCR所得數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，得出M BCR融合基因相對于ABL內(nèi)參基因的相對表達(dá)量后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以比值大于或等于0. 0001為陽性表達(dá)，小于0. 0001為陰性表達(dá)(具體參見表I)表I為熒光定量PCR分析M BCR融合基因在慢性粒細(xì)胞白血病患者骨髓中的表達(dá)
權(quán)利要求
1.一種檢測M BCR融合基因mRNA表達(dá)量的試劑盒，包含檢測用引物、熒光探針、cDNA第一鏈合成試劑、熒光定量PCR混合液、陰性對照和陽性對照，其特征在于，所述檢測用引物、熒光探針包括M BCR融合基因引物、內(nèi)參基因ABL引物及Taqman熒光探針，其中 M BCR融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: I所示； M BCR融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:2所示； M BCR融合基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO: 3所示； ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:4所不； ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 5所不； ABL基因Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO:6所示； 所述cDNA第一鏈合成試劑含有MgCl2、逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液、dNTPs、RNA酶抑制劑、Oligo (dT) 15、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶和無RNase去離子水；所述熒光定量PCR混合液含有PCR預(yù)混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、UNG 酶和無 RNase 去離子水。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括內(nèi)部陽性控制序列、內(nèi)部陽性控制序列的引物和Taqman熒光探針，其中內(nèi)部陽性控制序列如序列表中SEQIDN0:7所示；內(nèi)部陽性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID N0:8所示；內(nèi)部陽性控制序列的下游引物如序列表中SEQ ID N0:9所示；內(nèi)部陽性控制序列的Taqman熒光探針如序列表中SEQ ID NO: 10所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述MBCR融合基因的Taqman熒光探針和ABL基因的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報告基團(tuán)FAM，3’端均連接有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，所述內(nèi)部陽性控制序列的Taqman熒光探針的5’端連接有熒光報告基團(tuán)TET，3’端連接有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述內(nèi)參基因ABL的核酸序列如序列表中 SEQ IDN0:11 所示。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述陰性對照為去離子水；所述陽性對照為含有M BCR融合基因的總RNA樣品。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述cDNA第一鏈合成試劑為25mmol/LMgC 124 u L, IOX 逆轉(zhuǎn)錄酶緩沖液 2 ii L，IOmmoI/L dNTP 2 u L, RNA 酶抑制劑 0. 5 y L,Oligo (dT) 150. 5 u g, AMV逆轉(zhuǎn)錄酶I. 5U和無RNase去離子水,總體積11 ii L。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光定量PCR的混合液為1X的PCR 預(yù)混合液、2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ y L 的 Taq酶、0. 01-0. 05U/ i! L的UNG酶和無RNase去離子水。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測M BCR融合基因mRNA的熒光定量PCR診斷試劑盒，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。包含檢測用引物、熒光探針、cDNA第一鏈合成試劑、熒光定量PCR混合液、陰性對照和陽性對照，所述檢測用引物、熒光探針包括M BCR融合基因引物、內(nèi)參基因ABL引物及Taqman熒光探針。能有效地檢測e14a3、e13a3、e14a2和e13a2等M BCR融合基因形式。M BCR融合基因是多能造血干細(xì)胞惡性克隆的基因標(biāo)志，是慢性粒細(xì)胞白血病典型的分子標(biāo)志物，其與抑制白血病細(xì)胞的凋亡有關(guān)。采用敏感性及特異性均較高的熒光定量PCR檢測M BCR融合基因mRNA表達(dá)量，其檢測結(jié)果的特異性和敏感度均顯著提高。本發(fā)明試劑盒為臨床慢性粒細(xì)胞白血病患者制定治療方案以及預(yù)測預(yù)后提供了一種全新的快速簡便的基因診斷技術(shù)。
文檔編號C12Q1/68GK102965433SQ20121044368
公開日2013年3月13日 申請日期2012年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2012年9月29日
發(fā)明者李艷, 童永清 申請人:李艷, 童永清