專利名稱：一種使用actb基因分析arhgdib基因表達量的rt-pcr技術的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種使用ACTB基因mRNA作為內參，對ARHGDIB基因mRNA進行相對定 量的實時熒光RT-PCR擴增檢測技術，并形成相應試劑盒，屬于分子生物技術領域。
背景技術：
隨著人類基因組圖譜的完成，人們開始進入后基因組時代，重點也轉向了研究各基 因在生命中的作用，包括基因在生長發(fā)育、遺傳、疾病、外型體征等方面的作用。其中，對于 RhoGDP dissociation inhibitor (GDI)beta基因(ARHGDIB基因)表達的研究也越來越多。
基因表達的檢測有幾種方法。經(jīng)典的方法是根據(jù)在細胞或生物體中所觀察到的生 物化學或表型的變化來決定某一特定基因是否表達。隨著大分子分離技術的進步使得特異 的基因產物或蛋白分子的識別和分離成為可能。隨著重組DNA技術的運用，現(xiàn)在有可能檢 測、分析任何基因的轉錄產物。目前有好幾種方法廣泛應用于研究特定RNA分子。這些方 法包括RT-PCR、原位雜交、NORTHERN凝膠分析、打點或印跡打點、S-1核酸酶分析、RNA酶保 護研究以及基因芯片等。 熒光探針PCR技術是今年興起并得到快速發(fā)展的技術，是將同時帶有關聯(lián)的熒光 發(fā)光基團(能量供體)和淬滅基團(能量受體)的熒光探針結合PCR技術而產生的一種 新的檢測技術，具有靈敏度高、特異性強，且不易發(fā)生產物污染等特點，包括Taqman探針技 術、分子信標(Beacan探針)等，由于該技術操作簡便，檢測速度快，且各方面性能都有優(yōu) 勢，目前在臨床、研究等核酸檢測領域得到廣泛的應用。 Actin-beta(ACTB)基因為常用的看家基因，在人體細胞內表達情況較為穩(wěn)定，已 被廣泛用于基因表達的研究，利用A ACt值的方法能對其他基因的表達情況進行相對定 量分析。公式為F二2—AAet。 本發(fā)明將RT-PCR與熒光探針技術結合，通過廣泛篩選和優(yōu)化檢測引物和探針，同 時對細胞內的ACTB基因和ARHGDIB基因mRNA進行相對定量分析。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種快速、簡便的使用ACTB基因分析ARHGDIB基因表達量的 RT-PCR技術。 為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種使用一步法RT-PCR同時檢測ACTB基因mRNA 和ARHGDIB基因mRNA的技術。 根據(jù)GeneBank序列號為NC_000012的基因序列為模板，設計了一對引物及特異性 探針，檢測長度為139bp的目標mRNA，其引物探針序列分別為
引物1 :5—-ACCACAGAAGTCCCTGAAAGAGCT-3— (Seq No. 1)
引物2 :5— -GGTGAGCCGGGTGACAACGAC-3— (Seq No. 2)
探針1 :5—-TCGGATCTGTCACCACAGGACCA-3—(Seq No. 3)
4
或探針2 :5—-TGGTCCTGTGGTGACAGATCCGA-3— (Seq No. 4) 設計的探針跨越了 NCJ)00012基因序列中第111098-111743位核苷酸的內含子，
分別與其兩端的外顯子特異性匹配，這樣可非常有效的避免基因組DNA對實驗結果的影
響，同時也省去了使用DNA酶對樣本進行消化用以去除DNA干擾的步驟。 根據(jù)GeneBank序列號為ACJ)00050的基因序列為模板，設計了一對引物及特異性
探針，檢測長度為147bp的內參(ACTB基因)mRNA，其引物探針序列分別為 引物3 :5—-CAATGAGCTGCGTGTGGCAG-3— (Seq No. 5) 引物4 :5—-AGCACAGCCTGGATAGCAAC-3— (Seq No. 6)探針3 :5—-CGAGAAGATGACCCAGATCATGTTTG-3— (Seq No. 7) 設計的探針跨越了 AC_000050基因序列中第1427-1867位核苷酸的內含子，分別 與其兩端的外顯子特異性匹配，這樣可非常有效的避免基因組DNA對實驗結果的影B向，同 時也省去了使用DNA酶對樣本進行消化用以去除DNA干擾的步驟。 上述技術的探針(探針1、探針2和探針3)，其5—端的熒光發(fā)光基團可為FAM、 TET、 JOE、 Cy3、 Cy5、 Cy5. 5、 Fluorescein、 Rhodamine、 Rhodamine Red、 Rhodamine Green、 Rhodamine 6G、 Oregon Green 488、 Oregon Green 500、 Oregon Green 514、 Texas Red、 TAMRA、 Inosine、 HEX、 FITC、 Acridine orange或ROX中任意一種；3—端熒光淬滅基團可為 DABCYL、 DABSYL、 Eclipse、 TAMRA、 BHQ-l、 BHQ_2、 BHQ-3或MGB基團中的任意一種。
本發(fā)明提供的使用ACTB基因分析ARHGDIB基因表達量的RT-PCR技術是使用一步 法RT-PCR的技術，操作更為簡便、快速。使用表達量相對穩(wěn)定的ACTB基因與目標基因同時 檢測，能對標本中的ARHGDIB基因mRNA進行相對表達量進行定量分析。
本發(fā)明提供的使用ACTB基因分析ARHGDIB基因表達量的RT-PCR技術形成的試劑 盒中使用2個RNA陽性對照品，為人工合成的RNA序列，序列如下
(139bp)(Seq No. 8)
GCUGUGCU(147bp)(Seq No. 9) 其中，ARHGDIB基因mRNA檢測體系使用模板1作為陽性對照品，ACTB基因mRNA檢 測體系使用模板2作為陽性對照品。 本發(fā)明提供的使用ACTB基因mRNA分析ARHGDIB基因相對表達量的RT-PCR技術 形成的試劑盒組成為組成成分(20人份/盒)體積反應緩沖液A380 ii 1反應緩沖液B380 ii 1混合酶60 ii 1RNA陽性對照品A30 ii 1RNA陽性對照品B30 ii 1DEPC水1ml
其中，反應緩沖液的組分(終濃度)包括50mM Tris-HC1(PH 8.3)、50mM KC1、 300uMdNTP、3mM MgCl2，而且ARHGDIB基因mRNA檢測體系(反應緩沖液A)含200nM引物1、 200nM引物2和200nM探針1， ACTB基因mRNA檢測體系(反應緩沖液B)含200nM引物3、 200nM引物4和200nM探針3，其中，兩條探針的5—端標記的發(fā)光基團均為FAM，在3—端標 記的淬滅基團均為Eclipse?；旌厦傅慕M成成份(終濃度)包括0. 5U AMV酶、0. 5U RNase Inhibitor、0. lmg/ml BSA、5mM DTT、1.5U Taq酶、0. 05U UNG酶。RNA陽性對照品A和RNA 陽性對照品B分別為適當濃度的模板1和模板2。
本發(fā)明提供的技術形成的試劑盒操作步驟如下
PCR反應液的配制 A管按每人份反應緩沖液A 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反應液，并按22u1/ 管分裝到0. 2ml PCR管中，然后加入適量待檢的總RNA并補充DEPC水，使反應總體積為
30ul ; B管按每人份反應緩沖液B 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反應液，并按22u1/ 管分裝到0. 2ml PCR管中，然后加入適量待檢的總RNA并補充DEPC水，使反應總體積為
30ul ; RNA陽性對照品直接取8ul ， A管使用RNA陽性對照品A， B管使用RNA陽性對照品 B，按如下程序進行一步法RT-PCR檢測反應管先在5(TC反應5分鐘，然后95t:保溫5分 鐘，再按94°C 20秒一60°C 35秒循環(huán)40次(6(TC退火條件下采集熒光)。
采用比較Ct值的相對定量法，即通過標本的兩管檢測Ct值與正常對照品的兩管 檢測Ct值的A A Ct值，根據(jù)F = 2—A Aet公式計算ARHGDIB基因相對ACTB基因的表達量。
傳統(tǒng)的RT-PCR使用兩步法擴增，時間長，操作相對復雜，且因多了一個步驟而易 發(fā)生污染，所以本發(fā)明提供的技術采用一步法RT-PCR，將RT步驟與PCR步驟一步完成，無 須開管進行二次加樣，將少了污染的機會。由于反應體系中RT步驟是使用特異性引物進 行延伸，與傳統(tǒng)的隨機引物法相比，逆轉錄需要的時間更短，通?？稍?.5小時內完成全部 RT-PCR反應，并且由于使用熱穩(wěn)定性較強的AMV逆轉錄酶，可在5(TC進行RT反應，產品的 特異性非常高。


圖1為在ABI7300全自動熒光PCR儀上ARHGDIB基因熒光PCR擴增曲線圖
圖2為臨床標本總RNA稀釋產物熒光PCR擴增曲線圖
具體實施例方式
根據(jù)GeneBank中的人類基因組12號染色體ARHGDIB基因相關序列進行比對和分
析，設計和制備引物與探針(設計模板GeneBank序列號為NCJ)00012): 引物1 :5—-ACCACAGAAGTCCCTGAAAGAGCT-3— (Seq No. 1) 引物2 :5—-GGTGAGCCGGGTGACAACGAC-3— (Seq No. 2) 探針1 :5—-FAM-TCGGATCTGTCACCACAGGACCA-Eclipse-3— (Seq No. 3) 設計并制備人工合成RNA序列(Seq No.8) 根據(jù)GeneBank中的人類基因組7號染色體ACTB基因相關序列進行比對和分析， 設計和制備引物與探針(設計模板GeneBank序列號為ACJ)00050): 探針3 :5—-FAM-CGAGAAGATGACCCAGATCATGTTTG-Eclipse-3— (Seq No. 7)
設計并制備人工合成RNA序列
GCU(147bp)(SeqNo. 9) 將人工合成的兩條RNA序列用DEPC處理過的水溶解并稀釋至適當濃度，分別作為 ARHGDIB和ACTB基因mRNA的陽性對照品。 按如下配方配制反應緩沖液A(終濃度):50mM Tris-HC1(PH 8. 3)、50mM KCl、 300uMdNTP、3mM MgCl2、200nM引物1、200nM弓|物2禾P 200nM探針1。 按如下配方配制反應緩沖液B(終濃度)50mM Tris-HC1(PH 8. 3)、50mM KCl、 300uMdNTP、3mM MgCl2、200nM引物3、200nM弓|物4禾P 200nM探針3。 按如下配方配制混合酶(終濃度):0.5U AMV酶、0.5U RNase Inhibitor、0. lmg/ ml BSA、5mM DTT、1.5U Taq酶、0.05U UNG酶。試劑盒組成為組成成分(20人份/z盒)體積反應緩沖液A380 ii 1反應緩沖液B380 ii 1混合酶60 ii 1RNA陽性對照品A30 ii 1RNA陽性對照品B30 ii 1DEPC水1ml本發(fā)明提供的試劑盒未提供mRNA提取試劑，用戶可根據(jù)自身要求使用傳統(tǒng)的酚-氯仿提取方法或購買商業(yè)化的RNA提取試劑盒。
檢測步驟 PCR反應液的配制 A管按每人份反應緩沖液A 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反應液，并按22ul/ 管分裝到0. 2ml PCR管中，然后加入適量待檢的總RNA并補充DEPC水，使反應總體積為
30ul ; B管按每人份反應緩沖液B 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反應液，并按22u1/ 管分裝到0. 2ml PCR管中，然后加入適量待檢的總RNA并補充DEPC水，使反應總體積為
30ul ; RNA陽性對照品直接取8ul ， A管使用RNA陽性對照品A， B管使用RNA陽性對照品 B，按如下程序進行一步法RT-PCR檢測反應管先在5(TC反應5分鐘，然后95t:保溫5分 引物3 :5—-CAATGAGCTGCGTGTGGCAG-3—
引物4 :5 — -AGCACAGCCTGGATAGCAAC-3—
(Seq No. 5) (Seq No. 6)
7鐘，再按94°C 20秒一60°C 35秒循環(huán)40次(6(TC退火條件下采集熒光)。 結果分析與監(jiān)控 根據(jù)儀器分析的結果，在如下情況視實驗有效對照品A和對照品B的Ct值均 < 32且大于26。 根據(jù)公式F = 2—A Aet計算相對表達量。 也有部分全自動熒光PCR擴增儀可直接讀取A A Ct值。 SEQUENCE LISTING 〈110〉上海復星醫(yī)藥(集團)股份有限公司
上海復星醫(yī)學科技發(fā)展有限公司
劍軍，何
懿，夏 〈120〉 一種使用ACTB基因分析ARHGDIB基因表達量的RT-PCR技術 〈160>9 〈170>PatentIn version 3. 3 〈210>1 〈211>24 〈212〉DNA 〈213〉人工序列 〈400〉 1 accacagaag tccctgaaag agct 24 〈210>2 〈211>21 〈212>DNA 〈213〉人工序列 〈400>2 ggtgagccgg gtgacaacga c 21 〈210>3 〈211>23 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈400>3 tcggatctgt caccacagga cca 23 〈210>4 〈211>23 〈212>DNA 〈213>人工序列 〈400>4 tggtcctgtg gtgacagatc cga 23 〈210〉5
8:o川] :0112] :0113] :oii4]
〈211>20
〈212>DNA 〈213〉人工序列
<400>5
:0115]
caatgagctg cgtgtggcag
:0116] 〈210>6
:0117] 〈211>20
:0118] 〈212>DNA
:0119] 〈213>人工序列
:0120] 〈400>6
:0121] agcacagcct ggatagcaac 20
:0122] 〈210>7
:0123] <211>26
:0124] 〈212>DNA
:0125] 〈213>人工序列
:0126] 〈400>7
:0127] cgagaagatg acccagatca tgtttg 26
:0128] 〈210>8
:0129] 〈211>139
:0130] 〈212>RNA
:0131] 〈213>人工序列
:0132] 〈400>8
:0133] 3CC3C3g朋g UCCCUg朋3g 3gCUgC3gg3朋Ugg3C3朋g￡lUg￡lUg￡lg￡l gUCU￡l￡lUU￡l￡l 60
:0134] gu3c朋g朋3 acgcugcugg g3gauggucc uguggugaca g肌ccg朋ag ccccc朋ugu 120
:0135] cguugucacc cggcucacc 139
:0136] 〈210>9
:0137] 〈211>147
:0138] 〈212>RNA
:0139] 〈213>人工序列 <400>9 caaugagcug cguguggcuc ccgaggagca ccccgugcug cugaccgagg ccccccugaa 60 cccc朋ggcc朋ccgcg3g3 3g3Ug3ccc3 g肌c3Ugu皿gaggicc皿c3 3C3cccc3gc 120 caugimcguu gcuauccagg cugugcu 147
9
權利要求
一種使用ACTB基因分析ARHGDIB基因表達量的RT-PCR技術，其特征在于包含用于檢測ARHGDIB基因mRNA的一對特異性引物和一條特異性探針以及用于檢測ACTB基因mRNA的一對特異性引物和一條特異性探針，擴增目標片段長度分別為139bp和147bp，引物和探針序列分別為檢測ARHGDIB基因mRNA的引物和探針引物15`-ACCACAGAAGTCCCTGAAAGAGCT-3`(Seq No.1)引物25`-GGTGAGCCGGGTGACAACGAC-3`(Seq No.2)探針15`-TCGGATCTGTCACCACAGGACCA-3`(Seq No.3)或探針25`-TGGTCCTGTGGTGACAGATCCGA-3`(Seq No.4)檢測ACTB基因mRNA的引物和探針引物35`-CAATGAGCTGCGTGTGGCAG-3`(Seq No.5)引物45`-AGCACAGCCTGGATAGCAAC-3`(Seq No.6)探針35`-CGAGAAGATGACCCAGATCATGTTTG-3`(Seq No.7)或者上述引物序列的互補序列，或者上述序列同源性大于75％的序列。
2. 根據(jù)權利要求1所述的一種使用ACTB基因分析ARHGDIB基因表達量的RT-PCR技 術，其特征在于標記探針5—端的熒光發(fā)光基團可以為FAM、 TET、 J0E、 Cy3、 Cy5、 Cy5. 5、 Fluorescein、 Rhodamine、 Rhodamine Red、 Rhodamine Green、 Rhodamine 6G、 Oregon Green488、Oregon Green 500、Oregon Green 514、Texas Red、TAMRA、Inosine、HEX、FITC、 Acridine orange或R0X中任意一種；3—端熒光淬滅基團可以為DABCYL、DABSYL、Eclipse、 TAMRA、 BHQ-1 、 BHQ_2、 BHQ-3或MGB基團中的任意一種。
3. 根據(jù)權利要求1所述的一種使用ACTB基因分析ARHGDIB基因表達量的RT-PCR技 術，其特征在于使用一步法RT-PCR熒光檢測技術，對標本中的ARHGDIB基因mRNA和ACTB 基因mRNA進行同時進行檢測，對ARHGDIB基因的表達量進行相對定量分析。
4. 根據(jù)權利要求1所述的一種使用ACTB基因分析ARHGDIB基因表達量的RT-PCR技 術，其特征在于，可形成試劑盒，使用2個人工合成的RNA作為試劑盒的RNA陽性對照品，序 列如下UGCU(147bp)(Seq No. 9)。
5. 根據(jù)權利要求4所述的使用ACTB基因分析ARHGDIB基因表達量的RT-PCR技術，其 特征在于，形成的試劑盒，ARHGDIB基因mRNA檢測體系使用模板1作為陽性對照品，ACTB基 因mRNA檢測體系使用模板2作為陽性對照品。
6. 根據(jù)權利要求4所述的使用ACTB基因分析ARHGDIB基因表達量的RT-PCR技術，其 特征在于，形成的試劑盒組成為組成成分(20人份/盒)體積 反應緩沖液A 380 ill反應緩沖液B 380 ill混合酶 60 ii 1RNA陽性對照品A 30 illRNA陽性對照品B 30 illDEPC水 1ml其中，反應緩沖液的組分(終濃度)包括50mM Tris-HCl (PH 8. 3) 、50mM KCl、 300uMdNTP、3mM MgCl2，而且ARHGDIB基因mRNA檢測體系(反應緩沖液A)含200nM引物 1、200nM引物2和200nM探針1， ACTB基因mRNA檢測體系(反應緩沖液B)含200nM引物 3、200nM引物4和200nM探針3，其中，兩條探針的5—端標記的發(fā)光基團均為FAM，在3— 端標記的淬滅基團均為Eclipse。混合酶的組成成份(終濃度)包括0. 5U AMV酶、0. 5U RNaselnhibitor、0. lmg/ml BSA、5mM DTT、1.5U Taq酶、0. 05U UNG酶。RNA陽性對照品A和 RNA陽性對照品B分別為適當濃度的模板1和模板2。
7.根據(jù)權利要求6所述的一種使用ACTB基因分析ARHGDIB基因表達量的RT-PCR技術 形成的試劑盒，其特征在于，可使用如下操作步驟PCR反應液的配制A管按每人份反應緩沖液A 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反應液，并按22ul/管 分裝到O. 2ml PCR管中，然后加入適量待檢的總RNA并補充DEPC水，使反應總體積為30ul ;B管按每人份反應緩沖液B 19ul、混合酶3ul的配方配制PCR反應液，并按22ul/管 分裝到O. 2ml PCR管中，然后加入適量待檢的總RNA并補充DEPC水，使反應總體積為30ul ;RNA陽性對照品直接取8ul，A管使用RNA陽性對照品A，B管使用RNA陽性對照品B，按 如下程序進行一步法RT-PCR檢測反應管先在5(TC反應5分鐘，然后95"C保溫5分鐘，再 按94°C 20秒一60°C 35秒循環(huán)40次(6(TC退火條件下采集熒光)。結果分析，根據(jù)標本的兩管檢測Ct值與正常對照品的兩管檢測Ct值的A ACt值，對 ARHGDIB進行相對定量分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種使用ACTB基因分析ARHGDIB基因表達量的RT-PCR技術。本發(fā)明分別根據(jù)人的ARHGDIB基因mRNA和ACTB基因mRNA設計并篩選到最佳PCR檢測方案，能同時對標本中的兩個基因的mRNA進行檢測，根據(jù)兩個基因的mRNA檢測Ct值與正常對照兩個基因的mRNA檢測Ct值的ΔΔCt值，可分析ARHGDIB基因與看家基因-ACTB基因之間的相對表達量。同時本發(fā)明提供相應的一步RT-PCR檢測試劑盒。本發(fā)明還提供人工合成的兩種RNA，減少假陰性的發(fā)生率；本發(fā)明檢測速度快，能排除基因組DNA的干擾，特異性強，且靈敏度高，可用于ARHGDIB基因表達方面的研究和臨床。
文檔編號C12Q1/68GK101760523SQ20081020164
公開日2010年6月30日 申請日期2008年10月23日 優(yōu)先權日2008年10月23日
發(fā)明者何劍軍, 夏懿 申請人:上海復星醫(yī)藥(集團)股份有限公司;上海復星醫(yī)學科技發(fā)展有限公司