專利名稱：尖吻蝮蛇血凝酶-b的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種絲氨酸蛋白酶，具體地說是一種尖吻蝮蛇蛇毒血凝酶-B，本發(fā)明還涉及其分離純化方法。
背景技術(shù)：
蝮亞科(Crotalinae)蛇毒中存在一類與血液凝固相關(guān)的蛋白酶，通常稱之為“類凝血酶”(thrombin-like enzyme,簡(jiǎn)稱TLC)。類凝血酶與凝血酶(thrombin)的表觀作用相似，均可以使血漿中纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白而“凝固”。然而，兩種酶作用機(jī)理不同，類凝血酶不激活凝血系統(tǒng)中X III因子，其與纖維蛋白原作用僅產(chǎn)生非交聯(lián)纖維蛋白，不會(huì)導(dǎo)致血栓形成，其形成的凝血塊可被5M尿素溶解；而凝血酶能夠激活凝血系統(tǒng)中X III 因子，其與纖維蛋白原作用形成交聯(lián)纖維蛋白，可導(dǎo)致血栓形成，其形成的凝血塊不能被5M尿素溶解。近50年來的科學(xué)研究發(fā)現(xiàn)在40多種蛇毒中含有類凝血酶成分，有30余種得到分離純化，其中有10余種類凝血酶的全部或部分氨基酸序列得到闡明。已發(fā)現(xiàn)的TLC分子量多在29 45kD之間，大多數(shù)為酸性糖蛋白。在以往已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的蛇毒TLC中，蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)多為單鏈。其商品化典型代表產(chǎn)品“立 Ε雪”(Reptilase)系由瑞士 Solco Basle公司生產(chǎn)，是由巴西矛頭蝮蛇(Bothrops.atiOx)蛇毒中分離出的一種凝血酶，該酶前體由255個(gè)氨基酸構(gòu)成，N端有24個(gè)氨基酸形成的引導(dǎo)肽，活性酶含231氨基酸，SDS-PAGE分子量34kD。含6個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵(位點(diǎn)7_139，26-42,74-230,1 18-184，150-163，174-199)，為單鏈糖蛋白(糖基化位點(diǎn)為 Asn146’ 225)，脫去糖基后的分子量為255 17Da。另一個(gè)已經(jīng)商品化的產(chǎn)品是意大利RAVIZZ公司生產(chǎn)的“Botropase”,該凝血酶是從美洲矛頭蝮蛇(Bothrops. jararaca)蛇毒中分離得到的?；钚悦负?31氨基酸，在氨基酸序列上與Iteptilase比較在14個(gè)位點(diǎn)上有差別。此外，國(guó)內(nèi)學(xué)者沈居仁等2006年從中國(guó)尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒中分離得到一種高活性血凝酶，該酶為單鏈，SDS-PAGE分子量36±2kD，等電點(diǎn)為6. 59，比活為2000U-3000U/mg，N-末端15個(gè)氨基酸序列為VIGGNECDTNEEHFL。以蛇毒原料重量計(jì)收得率為O. 03%。到目前為止，商品化的蛇毒血凝酶種類較少，因此尋找適合產(chǎn)業(yè)化的高活性高收率的蛇毒血凝酶新品種尤顯必要。本發(fā)明人從我國(guó)廣西尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus,俗稱五步蛇)的蛇毒中分離純化得到一種高活性血凝酶-B。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種蛇毒血凝酶-B，其是從尖吻蝮蛇蛇毒中分離得到的一種類凝血酶(TLC)。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了一種分離純化上述血凝酶-B的方法。
本發(fā)明血凝酶-B是從中國(guó)尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus)蛇毒中分離得到的高活性血凝酶(命名為“血凝酶-B”)，其具有SEQ ID No. I所示的氨基酸序列。該酶具有如下特征①由236個(gè)氨基酸構(gòu)成的單鏈，SDS-PAGE分子量約為35kD，等電點(diǎn)pi為6. 0，②含6個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵(位點(diǎn)7-141，28-44，78-234，120-188，152-167，178-203)。③在 Asn77’100’229位點(diǎn)上具有由5種不同單糖構(gòu)成的雜合多聚糖修飾。④酶活性可被苯甲基磺酰氟(PMSF)完全抑制，表明其是一種絲氨酸蛋白酶。⑤具有較好的熱穩(wěn)定性，40°C恒溫60天酶活性可保持 90%ο應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員可根據(jù)本發(fā)明公開的 氨基酸序列，在不影響其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，得到所述蛋白的突變序列。因此，本發(fā)明蛋白還包括SEQ ID No. I所示氨基酸序列經(jīng)取代、替換和/或增加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，具有同等活性的由所述蛋白衍生得到的蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)本發(fā)明血凝酶-B的N端氨基酸序列，設(shè)計(jì)合成寡核苷酸探針，從尖吻蝮蛇毒腺組織提取mRNA，反轉(zhuǎn)錄并構(gòu)建cDNA文庫(kù)，通過上述探針篩選cDNA文庫(kù)，并對(duì)篩選出的陽(yáng)性克隆子分別進(jìn)行測(cè)序克隆分析，從而得到編碼本發(fā)明蛋白的基因。也可以根據(jù)本發(fā)明血凝酶-B的氨基酸序列直接設(shè)計(jì)合成編碼本發(fā)明蛋白的基因。本發(fā)明還提供上述血凝酶-B的純化方法，其包括如下步驟I)、蛇毒預(yù)處理；2)、將預(yù)處理后的蛇毒溶液上經(jīng)預(yù)平衡的DEAE — Sephrose FF陰離子交換層析柱，用 O. OlM pH7. O 7. 5 的 PBS 洗柱，再用含 O. 02 和 O. 06M NaCl 的 O. OlM pH7. O 7. 5的PBS分段洗脫，收集O. 06MNaCl溶液的洗脫液；3)、將上述洗脫液超濾濃縮至小體積后經(jīng)透析去除NaCl ；4)、將透析后的溶液再次上樣至經(jīng)過預(yù)平衡的DEAE — S^hrose FF層析柱，用O. OlM ρΗ7· O 7. 5 的 PBS 洗柱，再用含 O. 02,0. 04,0. 06Μ NaCl 的 O. OlM ρΗ7· O 7. 5 的PBS分段洗脫，收集O. 06Μ NaCl溶液洗脫液中的第三個(gè)洗脫峰；5)、將上述收集液超濾濃縮至小體積后經(jīng)80%硫酸銨沉淀，12000g離心30分鐘分
離沉淀。6)、用PBS適量溶解沉淀,經(jīng)Sephadex_G75進(jìn)一步純化,再經(jīng)透析除鹽后直接冷凍干燥。其中，步驟I)蛇毒預(yù)處理的方法是將蛇毒用適量預(yù)冷的O. 01MpH7. O 7. 5PBS溶解，離心取上清液進(jìn)行透析(透析袋截留分子量為7，000D 10，000D)。通過預(yù)處理可以去除不溶的雜質(zhì)以及小分子多肽，并降低溶液離子強(qiáng)度。具體地說可通過如下步驟進(jìn)行蛇毒的預(yù)處理稱取蛇毒若干克，用蛇毒重量5 10倍體積預(yù)冷的O. OlM pH7. O 7. 5的PBS于4 8 V的層析柜中攪拌溶解3(Γ60分鐘，于O0C >5, 000^10, OOOg離心1(Γ20分鐘，將離心上清液傾入透析袋中，離心沉淀再次加入蛇毒重量5 10倍體積預(yù)冷的PBS攪拌懸浮，再次離心。合并兩次離心上清液于透析袋中，于4 8C對(duì)O. OlM ρΗ7· O 7. 5的PBS透析12 24小時(shí)，期間換液2 4次，以去除小分子多肽和降低溶液離子強(qiáng)度。其中，步驟2)和步驟4)采用O. OlM ρΗ7· O 7. 5的PBS預(yù)平衡DEAE — SephroseFF層析柱，然后再上樣。
其中，步驟3)透析的目的是去除溶液中存在的NaCl。步驟3)和步驟5)中大體積洗脫液濃縮方式為超濾濃縮(膜截留值5000-10000Da)。其中，步驟6)中采用S印hadeX_G75分子篩的目的是進(jìn)一步將兩次陰離子柱層析收集物中的蛋白質(zhì)按分子量大小進(jìn)行分離純化。具體地將沉淀用PBS溶解后上柱，用O. OlMpH7. 4PBS洗脫液洗脫，收集洗脫液第一個(gè)峰。經(jīng)本發(fā)明方法純化的血凝酶-B比活力不低于2000U/mg，還原和非還原SDS-PAGE均為一條帶；HPLC分析純度95%以上。該酶具有較好的熱穩(wěn)定性，40°C恒溫60天酶活性可保持90%。以蛇毒凍干粉原料重量計(jì)，本法純化收得率為O. 25% - O. 3%。本發(fā)明血凝酶-B具有良好的凝血活性，可作為制成各種止血藥物的原料藥，即本發(fā)明還包括含有所述尖吻蝮蛇血凝酶-B的止血藥物。該藥物可以是凍干粉原藥、凍干粉注射劑、止血貼劑、止血粉劑、止血片劑、止血膏劑或者止血液體噴霧劑，用于需要止血以減少出血量的各種醫(yī)療情況。也可用來預(yù)防出血，避免或減少手術(shù)部位及手術(shù)后出血。


圖I顯示純化后血凝酶-B的SDS-PAGE —條帶。圖2顯示純化后血凝酶-B的HPLC分析結(jié)果。圖3血凝酶-B雜合糖基化結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所采用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)技術(shù)。本發(fā)明中涉及到的百分號(hào)“％”，若未特別說明，是指質(zhì)量百分比；但溶液的百分t匕，除另有規(guī)定外，是指溶液IOOml中含有溶質(zhì)若干克；液體之間的百分比，是指在20°C時(shí)容量的比例。本發(fā)明中類似“用蛇毒重量10倍體積預(yù)冷的”表述，其中的重量和體積的單位分別是g和ml。實(shí)施例I蛇毒血凝酶-B的純化取30g尖吻蝮蛇蛇毒凍干粉(批號(hào)20090701，廣西蛇毒研究所)，用蛇毒重量10倍體積預(yù)冷的O. OlM pH7. 4的PBS于4°C的層析柜中攪拌溶解30分鐘，于4°C、IOOOOg離心15分鐘，將離心上清液傾入透析袋中，離心沉淀再次加入蛇毒重量10倍體積預(yù)冷的PBS攪拌懸浮，再次離心。合并兩次離心上清液于透析袋(截留分子量為10，000D)中，在4°C層析柜中對(duì)O. OlM pH7. 4的PBS透析24小時(shí)，期間換液3次。將預(yù)處理后的蛇毒溶液上樣到經(jīng)過O. OlM pH7. 4PBS預(yù)平衡的DEAE — Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱,先用O. OlMpH7. 4PBS洗柱，再分別用含O. 02Μ、0. 06Μ NaCl的O. OlM ρΗ7. 4的PBS分段洗脫，收集O. 06ΜNaCl溶液的洗脫峰，共得1960ml。經(jīng)酶活測(cè)定(參照附錄①或②方法)和電泳分析，目的物出現(xiàn)在O. 06M NaCl溶液的洗脫峰收集液中。采用Millipore Pellicon 2切向流超濾器(O. IM2CUt off IOk膜)超濾濃縮至200ml，將該200ml超濾濃縮液傾入透析袋(10，000D)中，用2000ml O. OlM pH7. 4的PBS于4°C透析24小時(shí)，期間更換溶液3次。將透析后的酶溶液上樣到經(jīng)過預(yù)平衡的DEAE — Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱,用O. OlM pH7. 4的PBS洗柱,再分別用O. 02M、0. 04M、0. 06M NaCl 的 O. OlM ρΗ7· 4 的 PBS 分段洗脫，收集 O. 06Μ NaCl 溶液洗脫液的第三個(gè)洗脫峰，共得660ml。用Millipore Pellicon 2切向流超濾器(O. IM2CUt off 5k膜)超濾濃縮至120ml，將該120ml經(jīng)80%硫酸銨沉淀4°C過夜，次日12，OOOg 4°C離心30分鐘，離心沉淀用IOml的O. OlM pH7. 4PBS懸浮溶解，立即上樣到S印hdex_G75層系柱，用O. OlMpH7. 4PBS洗脫液洗脫，收集洗脫液第一個(gè)峰65ml，經(jīng)酶活測(cè)定確認(rèn)存在目的產(chǎn)物。將該65ml濃縮液裝入透析袋中，用無離子水進(jìn)行透析24小時(shí)，期間更換溶液3次，每次2000ml。透析后體積為73ml，直接冷凍干燥。獲得凍干物81mg，測(cè)定酶比活為2500U/mg，最終收率O. 27%。還原和非還原SDS-PAGE均為一條帶(見圖1)，電泳分子量大致為35kD。HPLC純度96.2% (見圖2)。等電聚焦電泳測(cè)定該酶等電點(diǎn)pi為6. O。經(jīng)Edman酶解和肽圖質(zhì)譜進(jìn)行氨基酸和糖基化測(cè)定，其氨基酸序列如SEQ ID No. I所示。該血凝酶含236個(gè)氨基酸，僅按氨基酸計(jì)算分子量為26116. 7Dalton ;鏈內(nèi)含6個(gè)
一 XiT 蝕 /-i-. I- Wr n 7 n 141 η 28 η 44 η 78 η 234 η 120 η 188 η 152 η 167 η 178 η
—硫鍵，位點(diǎn)為Cys-Cys，Cys -Cys，Cys -Cys，Cys -Cys，Cys -Cys，Cys -Cys2°3。糖基化位點(diǎn)為Asn77G2F4S，Asn1(l° - Hybrid, Asn229_G2F4S，糖基化結(jié)構(gòu)由5種不同單糖的雜合多聚糖構(gòu)成(見圖3)。實(shí)施例2蛇毒血凝酶-B的純化取30g尖吻蝮蛇蛇毒凍干粉(批號(hào)20090701，廣西蛇毒研究所)，按與實(shí)施例I相同的方法進(jìn)行預(yù)處理。將經(jīng)預(yù)處理的蛇毒溶液按實(shí)例I相同的方法進(jìn)行第一次DEAE-Sephrose FF柱層析，經(jīng)酶活測(cè)定和電泳分析目的物出現(xiàn)在O. 06MNaCl的洗脫峰中，合并洗脫收集液，共得2000ml,采用Millipore Pellicon 2切向流超濾器(O. IM2CUtofflOk膜)超濾濃縮至210ml，將該210ml超濾濃縮液傾入透析袋(10，000D)中，用2000ml O. OlM pH7. 4PBS于4°C透析24小時(shí)，期間更換溶液3次。透析后的酶液上樣至DEAE-Sephrose FF柱中，按實(shí)例I相同的方法進(jìn)行第二次層析。血凝酶出現(xiàn)在O. 06MNaCl溶液洗脫液的第三個(gè)洗脫峰中，收集該峰洗脫液得648ml。用Millipore Pellicon 2切向流超濾器(O. IM2CUt off 5k膜)超濾濃縮至130ml,將該130ml經(jīng)80%硫酸銨沉淀4°C過夜，12，OOOg 4°C離心30分鐘，沉淀用IOml的0.01M pH7. 4PBS懸浮溶解，立即上樣到Sephdex-G75層系柱，收集洗脫液第一個(gè)峰68ml，經(jīng)酶活測(cè)定確認(rèn)。將該68ml按實(shí)例I相同的方法進(jìn)行透析后體積為78ml，直接冷凍干燥。獲得凍干物85mg，測(cè)定酶比活力為2460U/mg，最終收率O. 28%。SDS-PAGE為一條帶，其電泳分子量大致為35kD。HPLC純度96. 0%。實(shí)施例3尖吻蝮蛇血凝酶-B的絲氨酸蛋白屬性實(shí)驗(yàn)將實(shí)施例I分離得到的血凝酶-B用生理鹽水稀釋至酶活lU/ml。用生理鹽水配制I %的牛纖維蛋白原(Sigma公司)溶液。用異丙醇溶解苯甲基磺酰氟(PMSF, Merck公司),溶液濃度為4mg/ml。實(shí)驗(yàn)操作步驟如下(I)取1%牛纖維蛋白原溶液2ml，37°C下恒溫5分鐘。(2)取三支小試管，分別標(biāo)注1#、2#、3#，每管加入20(^1的lU/ml血凝酶-C溶液。(3)分別向1#試管加入10 μ I蒸餾水，2#試管加入10 μ I異丙醇，3#試管加入10 μ I PMSF,于37° C水浴保溫5分鐘。(4)按試管編號(hào)順序分別單獨(dú)進(jìn)行凝集試驗(yàn)觀察。向試管中加入恒溫好的1%牛纖維蛋白原溶液200 μ 1，立即計(jì)時(shí)，同時(shí)輕輕搖動(dòng)混勻，于37°C水浴中靜置，觀察試管中凝集反應(yīng)的情況。以溶液呈現(xiàn)完全凝固狀態(tài)時(shí)終止計(jì)時(shí)。結(jié)果見表一表一、PMSF對(duì)凝集時(shí)間的影響
權(quán)利要求
1.尖吻蝮蛇血凝酶-B，其具有SEQID No. I所示的氨基酸序列或該序列經(jīng)替換、缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸得到的具有同等功能的氨基酸序列。
2.如權(quán)利要求I所述的尖吻蝮蛇血凝酶-B，其特征在于，鏈內(nèi)含有6對(duì)二硫鍵，在Asn77'100' 229位點(diǎn)上具有雜合多聚糖修飾。
3.含有權(quán)利要求I或2所述尖吻蝮蛇血凝酶-B的藥物。
4.如權(quán)利要求3所述的藥物，其為凍干粉原藥、凍干粉注射劑、止血貼劑、止血粉劑、止血片劑、止血膏劑或止血液體噴霧劑。
5.權(quán)利要求I或2所述血凝酶-B的純化方法，其包括如下步驟 1)、蛇毒預(yù)處理； 2)、將預(yù)處理后的蛇毒溶液上經(jīng)預(yù)平衡的DEAE— S^harose Fast Flow陰離子交換層析柱，用 O. OlM ρΗ7· O 7. 5 的 PBS 洗柱，再用含 O. 2 和 O. 6Μ NaCl 的 O. OlM ρΗ7· O 7. 5的PBS分段洗脫，收集O. 06MNaCl溶液的洗脫峰； 3)、將上述洗脫液超濾濃縮后透析去除NaCl； 4)、將透析后的溶液再次上經(jīng)預(yù)平衡的DEAE— Sepharose Fast Flow層析柱,用O. OlMpH7. O 7. 5 的 PBS 洗柱，再用含 O. 02,0. 04,0. 06M NaCl 的 O. OlM pH7. O 7. 5 的 PBS 分段洗脫，收集O. 06M NaCl溶液的第三個(gè)洗脫峰； 5)、將上述洗脫收集液用80%硫酸銨沉淀，離心收集沉淀； 6)、用PBS適量溶解沉淀,經(jīng)Sephadex_G75進(jìn)一步純化,再經(jīng)透析除鹽，冷凍干燥。
6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，步驟I)蛇毒預(yù)處理的方法是將蛇毒用適量預(yù)冷的O.OlM pH7. O 7. 5的PBS溶解，離心取上清液進(jìn)行透析。
7.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，步驟I)蛇毒預(yù)處理的方法是稱取蛇毒若干克，用蛇毒重量5 10倍體積預(yù)冷的O. 01MpH7. O 7. 5的PBS于4 8°C的層析柜中攪拌溶解30 60分鐘，于4°C、5，000^10, OOOg離心1(Γ20分鐘，將離心上清液傾入透析袋，離心沉淀再用蛇毒重量5 10倍體積預(yù)冷的PBS攪拌懸浮，再次離心，合并兩次離心上清液裝入透析袋中，于4 8。。對(duì)O. OlM ρΗ7· O 7. 5的PBS透析12 24小時(shí)，期間更換溶液2 4次。
8.如權(quán)利要求5所述的方法，其中，步驟2)和步驟4)采用O.OlM ρΗ7. O 7. 5的PBS預(yù)平衡DEAE — Sepharose Fast Flow層析柱,然后上樣。
9.如權(quán)利要求5 8任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟3)采用分子截留值為5，00(T10，000D的超濾膜進(jìn)行超濾濃縮。
10.如權(quán)利要求51任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟6)純化的方法是將步驟5)收集的沉淀用PBS溶解后，上SephadeX-G75層析柱，用O. OlM pH7. 4PBS洗脫液洗脫，收集洗脫液第一個(gè)峰。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種尖吻蝮蛇血凝酶-B，其是從尖吻蝮蛇蛇毒中分離到的一種高活性血凝酶，該酶為由236個(gè)氨基酸組成的單鏈糖蛋白，具有SEQ ID No.1所示的氨基酸序列。鏈內(nèi)含有6對(duì)二硫鍵；SDS-PAGE分子量約35kD，脫糖基化后的酶分子量26116.7Da；等電點(diǎn)pI 6.0。酶分子在Asn77,100,229位點(diǎn)上具有雜合多聚糖修飾。該酶為絲氨酸蛋白酶。本發(fā)明還提供了該酶的分離純化方法，包括通過預(yù)處理去除不溶物，再通過兩次陰離子交換柱層析和一次Sephdex-G75分子篩層析，收集活性洗脫峰，經(jīng)透析、凍干，即得高純度蛇毒血凝酶。其比活力不低于2000U/mg，HPLC分析純度可達(dá)95%以上，以蛇毒原料重量計(jì)收得率為0.25%－0.30%。
文檔編號(hào)C12N9/74GK102925422SQ20121045898
公開日2013年2月13日 申請(qǐng)日期2012年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月14日
發(fā)明者孫狄, 王錫娟 申請(qǐng)人:北京康辰藥業(yè)有限公司