專利名稱：尖吻蝮蛇血凝酶基因及其表達(dá)載體、宿主細(xì)胞和重組蛋白的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,特別涉及尖吻蝮蛇(4§· ·5Ζ Γθ￡/ο/7 acwiiAs)的血凝酶(haemocoagulase HCA)基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在蛇毒眾多復(fù)雜的活性成分當(dāng)中，其中一類絲氨酸蛋白酶，具有精氨酸酯酶活性，能使纖維蛋白原特定部位Arg-Gly肽鍵斷裂，釋放出血纖肽而轉(zhuǎn)換為纖維蛋白，作用與血漿凝血酶十分相似，稱之為類凝血酶。大多數(shù)蛇毒類凝血酶只能裂解纖維蛋白原的Aa鏈或Ββ鏈，釋放出血纖肽A (FPA)或B (FPB)，并形成非交聯(lián)的纖維蛋白単體。蛇毒類凝血酶在體外所起凝血作用與凝血酶相似，可不通過體內(nèi)各種凝血因子直接使纖維蛋白原凝 聚，但在體內(nèi)，由于生成的非交聯(lián)的纖維蛋白凝塊較脆弱，極易被血液中的纖溶系統(tǒng)降解而從血液循環(huán)中清除。雖然類凝血酶在體外都能使血漿和血纖維蛋白原凝固，但在體內(nèi)，不同的類凝血酶卻表現(xiàn)為截然相反的兩種藥理作用ー種為具有抗凝作用的類凝血酶，以來(lái)自馬來(lái)紅ロ蝮rhodostoma)的Ancrod為代表，因其能有效降低血液的纖維蛋白原水平而廣泛應(yīng)用于治療各種血栓疾病當(dāng)中；另ー種為具有止血作用的類凝血酶，也稱蛇毒血凝酶，以來(lái)自巴西矛頭蝮atrox)的巴曲酶(Batroxobin)為代表，體內(nèi)注射后能夠加速出血部位的血液凝結(jié)，減少傷ロ的出血時(shí)間，因而在各種外科手術(shù)和治療各種出血性疾病當(dāng)中得到廣泛的應(yīng)用。由于人凝血酶直接入血易導(dǎo)致血栓形成，除局部外用外，不能用于體內(nèi)出血性疾病的治療。因此，用蛇毒血凝酶替代人凝血酶一直是止血藥物技術(shù)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)，目前應(yīng)用最廣泛的是立止血。立止血中包含兩種成分巴曲酶和微量的凝血因子X脂依賴性激活劑(FXA)，巴曲酶是分離自巴西矛頭蝮蛇毒的單鏈糖蛋白，其分子量為43KD。國(guó)內(nèi)已有臨床使用的蛇毒血凝酶是白眉蝮蛇毒血凝酶，該酶由3種組分構(gòu)成，其組分的相對(duì)分子量分別為 54000±5000 Da、34000±5000 Da 和 15000±3000Da，相對(duì)百分含量為 7. 0% 12. 0%, 76. 0% 82. 0%和7. 0% 12. 0%，由類凝血酶和類凝血激酶組成。另ー種由尖吻蝮iAgkistrodon acutus)蛇毒提取的血凝酶,該酶分子量為30KDa,由A、B兩個(gè)亞基構(gòu)成，A鏈由135個(gè)氨基酸組成，B鏈由126個(gè)氨基酸組成。本發(fā)明人此前曾提出“尖吻蝮蛇毒36KD單鏈血凝酶及其制備方法”(發(fā)明專利ZL200610048673X)，其分離純化方法為 DEAE-S印harose XK50/60 ；Metal Sepharose F. FXK50/30 柱；Superdex 75 XK50/100 柱和 S印hacryl S — 100 XK50/100 柱層析。以下HCA 含義為尖吻峻蛇acutus)的血凝酶(haemocoagulase)的英文縮寫。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是基于上述理論研究和技術(shù)，提供一種尖吻蝮蛇血凝酶基因及其氨基酸的全序列結(jié)構(gòu)，該基因表達(dá)的蛋白具有在體內(nèi)出血處快速止血的效果，其核苷酸序列既可以通過分子生物學(xué)方法從尖吻蝮蛇毒腺中獲得，也可通過人工合成方法獲得。本發(fā)明的目的還包括了利用該基因構(gòu)建表達(dá)載體，利用宿主細(xì)胞獲得重組尖吻蝮蛇毒36KD單鏈血凝酶的方法。本發(fā)明的目的通過如下方法實(shí)現(xiàn)
(一)36KDa單鏈尖吻蝮蛇血凝酶基因
該基因自5’端至3’端由783個(gè)核苷酸編碼組成，DNA序列為SEQ ID NO 2 ;該基因編碼的單鏈糖蛋白的成熟蛋白含236個(gè)氨基酸殘基，氨基酸序列為SEQ ID NO :1，其中含24 個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽部分；該基因編碼的單鏈糖蛋白的分子量為36±3 KDa，等電點(diǎn)為6.59。(SEQ ID N0:1和SEQ ID NO :2如氨基酸和核苷酸序列表所示。)
(ニ)一種克隆36KDa單鏈尖吻蝮蛇血凝酶基因的方法 包括步驟
(O活體尖吻蝮蛇提取尖吻蝮蛇毒腺總RNA ；
(2)cDNA第一鏈合成(mRNA)反轉(zhuǎn)錄
在DEPC處理的PCR管中加入以下溶液
權(quán)利要求
1.36KDa單鏈尖吻蝮蛇血凝酶基因，其特征是該基因自5’端至3’端由783個(gè)核苷酸編碼組成，DNA序列為SEQ ID NO 2 ;該基因編碼的單鏈糖蛋白的成熟蛋白含236個(gè)氨基酸殘基，氨基酸序列為SEQ ID NO :1，其中含24個(gè)氨基酸殘基的信號(hào)肽部分；該基因編碼的單鏈糖蛋白的分子量為36±3 KDa，等電點(diǎn)為6.59。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的血凝酶基因，其特征是該基因具有以下特征 (1)精氨酸酯酶活性 該基因編碼的蛋白(36KDa-HCA)能水解精氨酸甲酯(TAME)和精氨酸乙酯(BAEE)，活性分別為 158435 U/mg 和 332518 U/mg ； 以TAME為底物測(cè)定36KDa-HCA精氨酸酯酶活性，該酶在溫度20°C 50 V和pH·6. 0-10. 0的條件下較穩(wěn)定；在溫度高于60°C時(shí)活性下降，70°C下降40 45%、80°C活性下降45 55%、90°C活性下降50 60% ； 在pH2. O、3. O、11. 0條件下，活性分別為pH7. 4時(shí)的40 45%、45 55%和65 75% ；Zn2+、Cu2+、苯甲基磺酰氟(PMSF)、￠-巰基乙醇、抑肽酶和苯甲脒能夠抑制該基因蛋白的精氨酸酯酶活性，其中，Zn2+和PMSF的抑制率分別為35 40%和90 98% ； (2)纖維蛋白原水解活性 該36KDa-HCA在15min內(nèi)優(yōu)先降解牛纖維蛋白原的A a鏈，且水解活性呈劑量與時(shí)間依賴性關(guān)系。
3.一種克隆如權(quán)利要求I所述的36KDa單鏈尖吻蝮蛇血凝酶基因的方法，其特征是 (1)活體尖吻蝮蛇提取尖吻蝮蛇毒腺總RNA； (2)cDNA第一鏈合成(mRNA)反轉(zhuǎn)錄 在DEPC處理的PCR管中加入以下溶液:
4.一種如權(quán)利要求I所述的尖吻蝮蛇36KDa單鏈血凝酶基因的原核表達(dá)方法，包括以下步驟 (1)表達(dá)載體的構(gòu)建 血凝酶 36KDa-HCA cDNA 克隆作為模板，引物 EXl (SEQ ID NO 7)5-GCGAATTCATGGTCATTGGAGGTGATGAATG-3 和 EX2 (SEQ ID NO :8):5-TACTCGAGTCACGGGGGGCAGGTTGCATC_3:擴(kuò)增目的片段，EcoRI和Xho I雙酶切后，與同樣雙酶切的載體pET-28a進(jìn)行連接，得到表達(dá)載體； (2)表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 連接好的表達(dá)載體通過熱擊轉(zhuǎn)化到BL21表達(dá)菌株上,涂布于含有50mg/mL卡那霉素的平板，37°C培養(yǎng)過夜，挑取陽(yáng)性克??； (3)誘導(dǎo)表達(dá) 陽(yáng)性克隆接種到含有卡那霉素的液體培養(yǎng)基試管內(nèi)，搖菌過夜后按1%接種量擴(kuò)大培養(yǎng)，當(dāng)菌液0D_值達(dá)到0. 6^0. 8時(shí)加入異丙基-P -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，使IPTG終濃度達(dá)到lmmol/L后繼續(xù)培養(yǎng)2 6小時(shí)； (4)包涵體純化 取培養(yǎng)菌液經(jīng)3000 8000rpm離心，收集沉淀即菌體，凍融三次后，將得到的菌體按I 10懸于0. 05mol/L, pH7. 5 8. 5Tris_HCl緩沖液，冰浴超聲破碎，再離心，取沉淀，即得pET-28a-36KDa 包涵體； (5 )表達(dá)蛋白的變性、復(fù)性及純化 表達(dá)獲得的pET-28a-36KDa包涵體加入裂解液，攪拌過夜后離心，取上清，即為包涵體變性液； 將包涵體變性液加入到復(fù)性緩沖液(lOmmol/LPB，pH8. 0)中，蛋白終濃度為0. 05mg/mL，4°C復(fù)性 12h 30h ； 復(fù)性液經(jīng)Ni2 + -NTA瓊脂糖柱純化后，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測(cè)，其分子量為36 土 3KDa，純度97. 6% ;經(jīng)western-blot檢測(cè)與兔抗血凝酶抗體呈陽(yáng)性反應(yīng)，即為原核表達(dá)純化的尖吻蝮蛇36KDa單鏈血凝酶。
5.一種表達(dá)如權(quán)利要求I所述的尖吻蝮蛇36KDa單鏈血凝酶的真核的方法，包括以下步驟 (1)pPIC9K-36KDaHCA表達(dá)載體的構(gòu)建 血凝酶 36KDa-HCA cDNA 克隆作為模板，引物 EX3 (SEQ ID NO 9)5-GCGAATTCATGGTCATTGGAGGTGATGAATG-3 和 EX2(SEQ ID NO 8)5-TACTCGAGTCACGGGGGGCAGGTTGCATC-3 擴(kuò)增該血凝酶基因，PCR 擴(kuò)增條件94°C 3 min; 94°C 0. 5min, 57°C 0. 5min,72°C 4min 或 2min，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸IOmin ； PCR產(chǎn)物與pPIC9K空質(zhì)粒分別經(jīng)通o I和油a I雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，涂布于含25iig/mL的氨芐抗性的大腸桿菌培養(yǎng)基2X YT平板上，16 h后，挑選陽(yáng)性克隆即為重組的pPIC9K-36KDaa -HCA質(zhì)粒； (2)重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 重組的pPIC9K-36KDaa-HCA質(zhì)粒以汝"/ II酶切線性化后，用濃度為I U g/ U L滅菌去離子水溶解，取5uL溶解液與80 y L GSl 15感受態(tài)酵母菌混合進(jìn)行電轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后涂于酵母培養(yǎng)基MD平板，挑取陽(yáng)性克隆接種于含有G418質(zhì)量濃度分別為0. 25,0. 50,0. 75和Img /mL的YPD平板上，篩選出耐受高濃度G418的轉(zhuǎn)化子； (3)培養(yǎng) 將篩選的轉(zhuǎn)化子接種到IOmlYPG培養(yǎng)基過夜，以10%的接種量轉(zhuǎn)接到酵母發(fā)酵BSM無(wú)機(jī)培養(yǎng)基中，搖瓶30°C、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)36 52 h，加入甲醇誘導(dǎo)，甲醇終濃度在0. 5% I. 0%，80 100小時(shí)后停止發(fā)酵，培養(yǎng)液離心后取上清，上清即含有目的蛋白。
全文摘要
尖吻蝮蛇血凝酶基因及其表達(dá)載體、宿主細(xì)胞和重組蛋白的制備方法，屬于生物醫(yī)學(xué)。本發(fā)明血凝酶成熟蛋白為含236個(gè)氨基酸殘基，分子量36000±3000Da，等電點(diǎn)6.59的單鏈糖蛋白，該蛋白氨基酸全序?yàn)镾EQNO1；編碼該蛋白的基因?yàn)?83個(gè)核苷酸組成的序列SEQNO2。該酶具有精氨酸酯酶活性和纖維蛋白原水解活性，能優(yōu)先降解纖維蛋白原Aα鏈。本發(fā)明所述基因能應(yīng)用于基因工程制備，提供了利用該基因構(gòu)建表達(dá)載體及用宿主細(xì)胞獲得重組該血凝酶蛋白的方法，并重述了分子生物學(xué)獲得該基因的方法。
文檔編號(hào)C12N15/10GK102660565SQ201210123508
公開日2012年9月12日 申請(qǐng)日期2012年4月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年4月25日
發(fā)明者葉鋒平, 沈居仁, 范泉水, 鄭穎 申請(qǐng)人:范泉水, 鄭穎