專利名稱：一種發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及發(fā)酵技術領域，具體為一種發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的方法。
背景技術：
恩拉霉素(Enramycin)，又名恩來霉素、恩素、安來霉素、持久霉素，它屬于一種多肽類抗生素，分子呈環(huán)狀結構，是不飽和脂肪酸與十幾種氨基酸結合的多肽類抗生素，氨基酸分子組成環(huán)狀多肽，在末端的天冬氨酸上連接脂肪酸分子，根據(jù)分子末端的脂肪酸分子不同可分為恩拉霉素A和恩拉霉素B，一般所說恩拉霉素是該兩種組分的混合物，恩拉霉素是由從土壤中分離得到的放線菌(Streptomyces fungiedious)發(fā)酵生產(chǎn)的一種多肽類抗生素。他對革蘭氏陽性菌有較強的抑制作用，作用機理是阻礙革蘭氏陽性菌細胞壁的合成。其敏感細菌主要有金黃色葡萄球菌等各種革蘭氏陽性球菌、枯草桿菌、炭蛆桿菌破傷風梭菌、肉毒梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等。長期大量使用恩來霉素不易產(chǎn)生抗藥性，并且它能改 善動物腸道內(nèi)細菌的菌落分布，有利于動物對飼料的消化吸收，能夠促進動物體重的增加和飼料的利用率，因此許多國家推薦此藥物為畜禽的抗生素和促生長劑。恩拉霉素的另一個特點是不易被動物吸收，畜禽體內(nèi)殘留很少。恩拉霉素于1966年由武田藥品工業(yè)株氏會社研發(fā)，并在1974年在日本正式注冊，其后許多被國家注冊和廣泛使用。我國農(nóng)業(yè)部在1993年批準該藥在我國注冊。2005年，國內(nèi)生產(chǎn)企業(yè)與美國先靈葆雅動物保健品有限公司(Schering Plough Animal Health Corp.)開始合作生產(chǎn)恩拉霉素預混劑。產(chǎn)恩拉霉素菌株對氧的需求量很高，當菌體濃度過高會造成發(fā)酵過程溶氧供應不足，影響發(fā)酵生產(chǎn)強度。如果菌濃度過低，恩拉霉素產(chǎn)出較慢，發(fā)酵周期過長，菌體老化，達不到較好效果。所以生產(chǎn)中需要通過改變流加糖的濃度改善發(fā)酵液的溶氧量，提高發(fā)酵水平。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的方法，以克服上述現(xiàn)有技術中存在的缺陷。本發(fā)明涉及的用于發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的菌株為殺真菌素鏈霉菌(Streptomycesfungicidious)FYFJ03，保藏號為 CGMCC No. 4113，已在中國專利 CN101974469A 中公開。本發(fā)明提供的發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的方法是通過使發(fā)酵菌株FYFJ03在發(fā)酵培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng)的發(fā)酵過程中，在不同階段分別流加不同的糖濃度，從而能夠改善發(fā)酵液中的溶解氧，實現(xiàn)提高恩拉霉素的發(fā)酵水平的技術效果。本發(fā)明的發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的方法中，發(fā)酵過程為將發(fā)酵用菌株接種于固體斜面培養(yǎng)基上，25_30°C恒溫培養(yǎng)。其中，流加的糖為淀粉水解糖。優(yōu)選地，流加的糖為葡萄糖、麥芽糖、糊精。其中于發(fā)酵過程中，在發(fā)酵36 60小時后，流加濃度為200 300g/L的糖；在發(fā)酵60 90小時后，流加濃度為350 450g/L的糖；在發(fā)酵90小時以后，流加濃度為500 600g/L的糖，從而可以較好地控制發(fā)酵液中溶氧，提高發(fā)酵生產(chǎn)強度，提高和加快恩拉霉素的生產(chǎn)，降低發(fā)酵周期，實現(xiàn)較好的技術效果。優(yōu)選地，發(fā)酵過程中，在發(fā)酵36-60小時后，流加濃度為225-275g/L的糖；在發(fā)酵60-90小時后，流加濃度為375-425g/L的糖；在發(fā)酵90小時以后，流加濃度為525_575g/L的糖。更優(yōu)選地，發(fā)酵過程中，在發(fā)酵36-60小時后，流加濃度為250g/L的糖；在發(fā)酵60-90小時后，流加濃度為400g/L的糖；在發(fā)酵90小時以后，流加濃度為550g/L的糖。本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)過程中，所述發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基包括下述組分玉米粉80-120g/L，玉米漿8-12g/L，硫酸銨2. 5-3. 5g/L，硫酸鋅O. 05-0. 15g/L，碳酸鈣18-22g/L。本發(fā)明用來發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基包括下述組分玉米粉100g/L，玉米漿10g/L，硫酸銨3g/L，硫酸鋅O. lg/L，碳酸鈣20g/L。本發(fā)明提供的發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的方法解決了菌株發(fā)酵過程中溶氧量不足的問題，操作簡單易行，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中通過該工藝發(fā)酵后，較普通方法(維持流加糖的濃度不變直到發(fā)酵)恩拉霉素發(fā)酵水平的可提高約20%，有效提高了發(fā)酵水平。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段，實施例1-5和比較例中，加入的各原料除特別說明外，均為市售。以下實施例中所用流加糖為糊精。實施例II)菌株的擴大培養(yǎng)在室溫25°C下，取菌株FYFJ03的斜面孢子，稀釋成IO7個孢子/ml孢子懸液，涂布于固體培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)7天，選取生長良好的單菌株接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28°C，220rpm搖床培養(yǎng)160h，檢測發(fā)酵液中恩拉霉素的產(chǎn)量，發(fā)酵單位為4000U/ml。2)斜面培養(yǎng)將I)篩選出的單菌株在無菌條件下接種于固體斜面培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)8天。其中所述固體斜面培養(yǎng)基包括如下組分玉米粉20g/L，蛋白胨lg/L，硫酸鋅O. lg/L, g/L，氯化錳 O. 02g/L,瓊脂 15g/L。3)發(fā)酵培養(yǎng)將I)培養(yǎng)的菌種無菌條件下接種到預先滅菌的50L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)。發(fā)酵36h開始流加糖，分階段調整糖的流加濃度，發(fā)酵周期8天。發(fā)酵36 60小時，流加濃度為250g/L的糖；發(fā)酵60 90小時，流加濃度為400g/L的糖；在發(fā)酵90小時以后，流加濃度為550g/L的糖。發(fā)酵8天后平均發(fā)酵水平為6240U/ml。
其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下組分玉米粉100g/L，玉米漿10g/L，硫酸銨3g/L，硫酸鋅O. lg/L，碳酸鈣20g/L。實施例2I)菌株的擴大培養(yǎng)在室溫下，取菌株FYFJ03的斜面孢子，稀釋成IO5個孢子/ml孢子懸液，涂布于固體培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)7天，選取生長良好的單菌株接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28°C，200rpm搖床培養(yǎng)170h，檢測發(fā)酵液中恩拉霉素的產(chǎn)量，發(fā)酵單位為5000U/ml。2)斜面培養(yǎng)將I)篩選出的單菌株在無菌條件下接種于固體斜面培養(yǎng)基上，25°C恒溫培養(yǎng)8天。其中所述固體斜面培養(yǎng)基包括如下組分玉米粉20g/L，蛋白胨lg/L，硫酸鋅O. lg/L, g/L,氯化錳 O. 02g/L,瓊脂 15g/L。3)發(fā)酵培養(yǎng)將I)培養(yǎng)的菌種無菌條件下接種到預先滅菌的100L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基中，25°C培養(yǎng)。發(fā)酵36h開始流加糖，分階段調整糖的流加濃度，發(fā)酵周期8天。發(fā)酵36 60小時，流加濃度為200g/L的糖；發(fā)酵60 90小時，流加濃度為350g/L的糖；在發(fā)酵90小時以后，流加濃度為500g/L的糖。發(fā)酵8天后平均發(fā)酵水平為5450U/ml。其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下組分玉米粉80g/L，玉米漿9g/L，硫酸銨3. 5g/L，硫酸鋅O. 15g/L，碳酸鈣18g/L。實施例3I)菌株的擴大培養(yǎng)在室溫下，取菌株FYFJ03的斜面孢子，稀釋成IO5個孢子/ml孢子懸液，涂布于固體培養(yǎng)基，29°C培養(yǎng)7天，選取生長良好的單菌株接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于29°C，210rpm搖床培養(yǎng)180h，檢測發(fā)酵液中恩拉霉素的產(chǎn)量，發(fā)酵單位為5000U/ml。2)斜面培養(yǎng)將I)篩選出的單菌株在無菌條件下接種于固體斜面培養(yǎng)基上，30°C恒溫培養(yǎng)8天。其中所述固體斜面培養(yǎng)基包括如下組分玉米粉20g/L，蛋白胨lg/L，硫酸鋅O. lg/L, g/L,氯化錳 O. 02g/L,瓊脂 15g/L。3)發(fā)酵培養(yǎng)將I)培養(yǎng)的菌種無菌條件下接種到預先滅菌的50L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)。發(fā)酵36h開始流加糖，分階段調整糖的流加濃度，發(fā)酵周期8天。發(fā)酵36 60小時，流加濃度為300g/L的糖；發(fā)酵60 90小時，流加濃度為450g/L的糖；在發(fā)酵90小時以后，流加濃度為600g/L的糖。發(fā)酵8天后平均發(fā)酵水平為5860U/ml。其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下組分玉米粉120g/L，玉米漿12g/L，硫酸銨2. Sg/L，硫酸鋅O. 12g/L，碳酸鈣22g/L。實施例4I)菌株的擴大培養(yǎng)在室溫下，取菌株FYFJ03的斜面孢子，稀釋成IO6個孢子/ml孢子懸液，涂布于固體培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)7天，選取生長良好的單菌株接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28°C，215rpm搖床培養(yǎng)165h，檢測發(fā)酵液中恩拉霉素的產(chǎn)量，發(fā)酵單位為4900U/ml。2)斜面培養(yǎng)將I)篩選出的單菌株在無菌條件下接種于固體斜面培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)8天。其中所述固體斜面培養(yǎng)基包括如下組分玉米粉20g/L，蛋白胨lg/L，硫酸鋅O. lg/L, g/L,氯化錳 O. 02g/L,瓊脂 15g/L。3)發(fā)酵培養(yǎng)將I)培養(yǎng)的菌種無菌條件下接種到預先滅菌的50L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基中，27°C培 養(yǎng)。發(fā)酵36h開始流加糖，分階段調整糖的流加濃度，發(fā)酵周期8天。發(fā)酵36 60小時，流加濃度為275g/L的糖；發(fā)酵60 90小時，流加濃度為425g/L的糖；在發(fā)酵90小時以后，流加濃度為550g/L的糖。發(fā)酵8天后平均發(fā)酵水平為6040U/ml。其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下組分玉米粉90g/L，玉米漿llg/L，硫酸銨3. 2g/L，硫酸鋅O. 05g/L，碳酸鈣19g/L。實施例5I)菌株的擴大培養(yǎng)在室溫下，取菌株FYFJ03的斜面孢子，稀釋成IO6個孢子/ml孢子懸液，涂布于固體培養(yǎng)基，28°C培養(yǎng)7天，選取生長良好的單菌株接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28°C，200rpm搖床培養(yǎng)175h，檢測發(fā)酵液中恩拉霉素的產(chǎn)量，發(fā)酵單位為5100U/ml。2)斜面培養(yǎng)將I)篩選出的單菌株在無菌條件下接種于固體斜面培養(yǎng)基上，28°C恒溫培養(yǎng)8天。其中所述固體斜面培養(yǎng)基包括如下組分玉米粉20g/L，蛋白胨lg/L，硫酸鋅
O.lg/L, g/L,氯化錳 O. 02g/L,瓊脂 15g/L。3)發(fā)酵培養(yǎng)將I)培養(yǎng)的菌種無菌條件下接種到預先滅菌的50L發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)基中，29°C培養(yǎng)。發(fā)酵36h開始流加糖，分階段調整糖的流加濃度，發(fā)酵周期8天。發(fā)酵36 60小時，流加濃度為250g/L的糖；發(fā)酵60 90小時，流加濃度為400g/L的糖；在發(fā)酵90小時以后，流加濃度為550g/L的糖。發(fā)酵8天后平均發(fā)酵水平為6100U/ml。其中所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括如下組分玉米粉100g/L，玉米漿9g/L，硫酸銨2. 5g/L，硫酸鋅O. 15g/L，碳酸鈣18g/L。比較例菌種擴大培養(yǎng)和斜面培養(yǎng)參見實施例I 5相應的方法,不同的是在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，保持流加糖濃度不變。發(fā)酵36小時開始補加500g/L的糖，維持流加濃度不變，直至發(fā)酵結束。發(fā)酵8天后平均發(fā)酵水平為5210U/ml。以上實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實質的情況下，對本發(fā)明所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
權利要求
1.一種發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的方法，其特征在于，將殺真菌素鏈霉菌(StreptomycesfUngicidiOUS)FYFJ03在發(fā)酵培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng)，在發(fā)酵過程不同階段流加不同的糖濃度，改善發(fā)酵液中的溶解氧，提高恩拉霉素的發(fā)酵水平。
2.如權利要求I所述的方法，其特征在于，將發(fā)酵用菌株接種于固體斜面培養(yǎng)基上，發(fā)酵條件為25-30°C恒溫培養(yǎng)。
3.如權利要求I所述的方法，其特征在于，流加的糖為葡萄糖、麥芽糖、糊精或其他淀粉水解糖。
4.如權利要求I 3任一所述的方法,其特征在于,發(fā)酵過程中,在發(fā)酵36 60小時后，流加濃度為200 300g/L的糖；在發(fā)酵60 90小時后，流加濃度為350 450g/L的糖；在發(fā)酵90小時以后，流加濃度為500 600g/L的糖。
5.如權利要求I 3任一所述的方法,其特征在于,發(fā)酵過程中,在發(fā)酵36 60小時后，流加濃度為200 275g/L的糖；在發(fā)酵60 90小時后，流加濃度為375 425g/L的糖；在發(fā)酵90小時以后，流加濃度為525 575g/L的糖。
6.如權利要求I 3任一所述的方法,其特征在于，發(fā)酵過程中，在發(fā)酵36 60小時后，流加濃度為250g/L的糖；在發(fā)酵60 90小時后，流加濃度為400g/L的糖；在發(fā)酵90小時以后，流加濃度為550g/L的糖。
7.如權利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基包括下述組分玉米粉80-120g/L，玉米漿8-12g/L，硫酸銨2. 5-3. 5g/L，硫酸鋅O. 05-0. 15g/L，碳酸鈣 18-22g/L。
8.如權利要求1-3任一項所述的方法，其特征在于，所述發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基包括下述組分玉米粉100g/L，玉米漿10g/L，硫酸銨3g/L，硫酸鋅O. lg/L，碳酸鈣20g/L。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種發(fā)酵生產(chǎn)恩拉霉素的方法。該方法以殺菌素鏈霉菌FYFJ03為發(fā)酵菌株，在恒溫培養(yǎng)的發(fā)酵過程中，不同階段流加不同的糖濃度，改善發(fā)酵液的溶解氧，提高恩拉霉素的發(fā)酵水平。本發(fā)明簡單易行，在發(fā)酵培養(yǎng)過程中通過該工藝發(fā)酵后，恩拉霉素發(fā)酵水平的可提高約20％。
文檔編號C12P21/02GK102943101SQ201210466719
公開日2013年2月27日 申請日期2012年11月19日 優(yōu)先權日2012年11月19日
發(fā)明者張雪鋒, 潘聲龍, 鄭輝 申請人:安徽豐原發(fā)酵技術工程研究有限公司