制備恩拉霉素抗原的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及制備恩拉霉素抗原的方法，屬于生物【技術(shù)領域】。本發(fā)明所解決的技術(shù)問題是提供了一種偶聯(lián)比率更高的制備恩拉霉素抗原的方法。本發(fā)明制備恩拉霉素抗原的方法包括如下步驟：a、取牛血清白蛋白，加入PBS溶液使牛血清白蛋白溶解；b、于a步驟所得的溶液中加入恩拉霉素，并使恩拉霉素溶解；c、恩拉霉素溶解后，在加入1,4-二氧六環(huán)，混勻；d、c步驟混勻后的溶液于25～30℃反應3～5h，并加入體積濃度為0.25%的戊二醛溶液；其中，加入的戊二醛溶液與1,4-二氧六環(huán)溶液的體積比為0.35～0.45:1，反應時的pH值控制在7.5～7.9；e、透析，干燥后得到恩拉霉素抗原。
【專利說明】制備恩拉霉素抗原的方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及制備恩拉霉素抗原的方法，屬于生物【技術(shù)領域】。
【背景技術(shù)】
[0002]恩拉霉素，又名安來霉素和持久霉素，該藥于1966年日本武田藥品研究所由土壌中分離出來的放線菌(Streptomyces fungicidiousN0.B5477)經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生的一種由不飽和脂肪酸和十二種氨基酸結(jié)合而成的多肽類(Polypepide)抗生素，其主要成分是恩拉霉素A -Cltl7H138N26O31C12R=CH3 和恩拉霉素 B:C108H140N26031C12R=C2H5OH15 該藥因具有很強的抗 G+菌的作用，用作飼料添加劑能促進畜禽生長和提高飼料效率，且長期使用不易產(chǎn)生耐藥性，與其它抗生素亦無交叉耐藥，化學性能穩(wěn)定，無致突、致畸、致癌作用，不易被吸收，殘留極少，適ロ性好等優(yōu)勢，現(xiàn)已成為當前最具發(fā)展前景的獸用抗生素添加剤。
[0003]目前，免疫分析法因其較傳統(tǒng)的微生物檢測法、理化檢測法具有簡潔、快速、廉價、特異性強、靈敏度高等優(yōu)點，已經(jīng)被國內(nèi)外廣泛地應用于獸藥殘留的檢測中，但至今國內(nèi)外尚無有關(guān)恩拉霉素酶免疫檢測技術(shù)報道，僅日本厚生省對該項殘留物質(zhì)有畜、水產(chǎn)性食品有常規(guī)檢測技術(shù)報道。因此開發(fā)我國自主產(chǎn)權(quán)的Enramycin殘留檢測方法非常必要，要建立相關(guān)免疫學分析方法，制備出特異性強、效價高的Er抗體非常關(guān)鍵，必須將其與蛋白質(zhì)載體等大分子載體偶聯(lián)形成人工合成的完全抗原進而制備相應抗體，這也是建立免疫分析過程的如提和關(guān)鍵所在。
[0004]申請?zhí)枮镃N201010556432.2，發(fā)明名稱為“ー種恩拉霉素完全抗原的合成方法”的專利申請中公開了ー種恩拉霉素完全抗原的合成方法，但是該方法制備的恩拉霉素抗原的偶聯(lián)比率較低，恩拉霉素抗原的效價較低。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種偶聯(lián)比率更高的制備恩拉霉素抗原的方法。
[0006]本發(fā)明制備恩拉霉素抗原的方法包括如下步驟:
[0007]a、取牛血清白蛋白，加入PBS溶液(即磷酸鹽緩沖溶液，下同)使牛血清白蛋白溶解；
[0008]b、于a步驟所得的溶液中加入恩拉霉素，并使恩拉霉素溶解；其中，恩拉霉素與牛血清白蛋白的質(zhì)量比為1:1.2~1.5 ;
[0009]C、恩拉霉素溶解后，在加入1，4-二氧六環(huán)，混勻；其中，所加入的1，4-二氧六環(huán)與PBS溶液的體積比為1: 1.1~1.2 ;
[0010]d、c步驟混勻后的溶液于25~30°C反應3~5h，并加入體積濃度為0.25%的戊二醛溶液；其中，加入的戊二醛溶液與1，4-二氧六環(huán)溶液的體積比為0.35~0.45:1，反應時的PH值控制在7.5~7.9 (通過PBS溶液控制pH值)；
`[0011]e、透析，干燥后得到恩拉霉素抗原。[0012]本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過實驗研究分析，發(fā)現(xiàn)影響恩拉霉素抗原的偶聯(lián)比率的因素較多，其中，恩拉霉素與牛血清白蛋白的質(zhì)量比、1，4-二氧六環(huán)與PBS溶液的體積比、戊二醛溶液的加入量、反應時的PH值和反應溫度為最主要的因素。按照上述方法制備的恩拉霉素抗原，其偶聯(lián)比率較高，相比申請?zhí)枮镃N201010556432.2的方法，其偶聯(lián)比率大幅提高，取得了意料不到的技術(shù)效果。
[0013]其中，上述的牛血清白蛋白的相對分子質(zhì)量優(yōu)選為67000。
[0014]進ー步的，作為更優(yōu)的技術(shù)方案，上述b步驟中所述的恩拉霉素與牛血清白蛋白的質(zhì)量比優(yōu)選為1:1.3。
[0015]進ー步的，作為更優(yōu)的技術(shù)方案，上述c步驟中的1，4_ 二氧六環(huán)與PBS溶液的體積比優(yōu)選為1:1.15。
[0016]進ー步的，作為更優(yōu)的技術(shù)方案，上述c步驟混勻后的溶液于28°C反應4h，并加入體積濃度為0.25%的戊二醛溶液；其中，加入的戊二醛溶液與1，4- 二氧六環(huán)溶液的體積比為0.4:1，反應時的pH值控制在7.7。
[0017]本發(fā)明方法相比現(xiàn)有方法，大幅提高了恩拉霉素抗原的偶聯(lián)比率，有利于更加精確的檢測肉制品中恩拉霉素的殘留含量，本發(fā)明具有廣闊的應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1是實施例2制備的恩拉霉素抗原的紫外光譜鑒定結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0019]本發(fā)明制備恩拉霉素抗原的方法包`括如下步驟:
[0020]a、取牛血清白蛋白，加入PBS溶液(即磷酸鹽緩沖溶液，下同)使牛血清白蛋白溶解；
[0021]b、于a步驟所得的溶液中加入恩拉霉素，并使恩拉霉素溶解；其中，恩拉霉素與牛血清白蛋白的質(zhì)量比為1:1.2~1.5 ;
[0022]C、恩拉霉素溶解后，在加入1，4-二氧六環(huán)，混勻；其中，所加入的1，4-二氧六環(huán)與PBS溶液的體積比為1: 1.1~1.2 ;
[0023]d、c步驟混勻后的溶液于25~30°C反應3~5h，并加入體積濃度為0.25%的戊二醛溶液；其中，加入的戊二醛溶液與1，4-二氧六環(huán)溶液的體積比為0.35~0.45:1，反應時的PH值控制在7.5~7.9 (通過PBS溶液控制pH值)；
[0024]e、透析，干燥后得到恩拉霉素抗原。
[0025]本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過實驗研究分析，發(fā)現(xiàn)影響恩拉霉素抗原的偶聯(lián)比率的因素較多，其中，恩拉霉素與牛血清白蛋白的質(zhì)量比、1，4-二氧六環(huán)與PBS溶液的體積比、戊二醛溶液的加入量、反應時的PH值和反應溫度為最主要的因素。按照上述方法制備的恩拉霉素抗原，其偶聯(lián)比率較高，相比申請?zhí)枮镃N201010556432.2的方法，其偶聯(lián)比率大幅提高，取得了意料不到的技術(shù)效果。
[0026]其中，上述的牛血清白蛋白的相對分子質(zhì)量優(yōu)選為67000。
[0027]進ー步的，作為更優(yōu)的技術(shù)方案，上述b步驟中所述的恩拉霉素與牛血清白蛋白的質(zhì)量比優(yōu)選為1:1.3。[0028]進ー步的，作為更優(yōu)的技術(shù)方案，上述c步驟中的1，4- 二氧六環(huán)與PBS溶液的體積比優(yōu)選為1:1.15。
[0029]進ー步的，作為更優(yōu)的技術(shù)方案，上述c步驟混勻后的溶液于28°C反應4h，并加入體積濃度為0.25%的戊二醛溶液；其中，加入的戊二醛溶液與1，4- 二氧六環(huán)溶液的體積比為0.4:1，反應時的pH值控制在7.7。
[0030]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的【具體實施方式】做進ー步的描述，并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。
[0031]實施例所用的主要試劑和主要儀器如下:
[0032]1、主要試劑
[0033]恩拉霉素(純度≥98%)、牛血清白蛋白(BSA，相對分子質(zhì)量:67000，上海博奧生物科技公司)、卵清蛋白(0VA，相對分子量:45000，上海基星生物科技公司)、弗氏完全佐劑(FCA)、弗氏不完全佐劑(FICA)，均購于Sigma公司、透析袋(截留分子量:14000), (Sigma公司)、戊二醛(成都金山化學試劑公司)、1，4-二氧六環(huán)(成都科龍化工試劑廠)，以上化學試劑均為分析純。
[0034]2、主要儀器
[0035]UV2501-PC型紫外掃描儀(日本島津Shimadzu公司)；BS124S型電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);BS100S型分析天平北京賽多利斯有限公司；ULT1386-3-V38型低溫冰箱(美國REVCO公司);DCD-172K型常規(guī)冰箱(美國伊萊克斯公司);Freeze6型冷凍干燥機(Labconco公司)；DF_101S型智能集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(河南省予華儀器有限公司)。`
[0036]實施例1采用本發(fā)明方法制備恩拉霉素抗原
[0037]配制PBS溶液(pH7.6):取磷酸二氫鉀27.22g，加水使溶解成1000ml，取50ml，加
0.2mol/L氫氧化鈉溶液42.4ml，再加水稀釋至200ml，即得。
[0038]稱取恩拉霉素20mg盛于IOOmL錐形瓶中，稱取牛血清蛋白(BSA)24mg于5號試管中。向試管中加入PBS溶液約3mL，待牛血清蛋白(BSA)完全溶解后轉(zhuǎn)移到有恩拉霉素的錐形瓶中，再用PBS溶液洗滌試管，將牛血清蛋白(BSA)完全移入錐形瓶，共用PBS溶液llmL。待恩拉霉素基本溶解后，向錐形瓶中加入1，4-二氧六環(huán)10mL，混勻。將磁力攪拌器放入反應器后把錐形瓶放在ー個含少量水的大燒杯中，再將燒瓶置于25°C水浴，開啟攪拌器，約5min后，保持攪拌狀態(tài)，向反應器內(nèi)逐滴加入體積濃度為0.25%的戊二醛溶液3.5mL,滴加完畢后仍保持攪拌狀態(tài)，反應4h，反應時的pH值控制在7.6 (通過PBS溶液控制pH值);即得恩拉霉素完全抗原混合液。
[0039]配制A液:配制含碳酸鈉(Na2CO3) 10g/L及こ二胺四こ酸二鈉(EDTA) lmol/L的堿性EDTA溶液，置于4°C下保存，以備處理透析袋
[0040]透析袋前處理:取20cm的透析袋，將其置于A溶液中，于沸水中煮沸30min，稍冷后用蒸餾水沖洗3min將其洗浄，另取IOOcm長的棉線ー根，用其一端將透析袋的一端扎緊，保證不會漏液，保存在4°C去離子水中備用；
[0041]透析:取15cm的三角漏斗ー個，將其下部插于透析袋的未封ロ端，將恩拉霉素完全抗原混合液由漏斗ロ轉(zhuǎn)移至透析袋內(nèi)，轉(zhuǎn)移完畢，利用棉線的另一端將透析袋封ロ。以ー個小鑷子作為梁將裝好的透析袋懸于盛有適量蒸餾水的大燒杯中，保證燒杯內(nèi)的水將透析袋內(nèi)的液體完全浸沒，將該裝置于4°C冰箱內(nèi)開始透析，透析72h，每天換水2次，最后使用冷凍干燥法將透析袋中的液體制成粉末，即得到恩拉霉素抗原:恩拉霉素-牛血清白蛋白。
[0042]實施例2采用本發(fā)明方法制備恩拉霉素抗原
[0043]配制PBS 溶液(pH7.8):
[0044]甲液:取磷酸氫二鈉35.9g，加水溶解，并稀釋至500ml ；
[0045]乙液:取磷酸二氫鈉2.76g，加水溶解，并稀釋至100ml ；
[0046]取上述甲液91.5ml與こ液8.5ml混合，搖勻，即得。
[0047]稱取恩拉霉素20mg盛于IOOmL錐形瓶中，稱取牛血清蛋白(BSA) 26mg于5號試管中。向試管中加入PBS溶液約3mL，待牛血清蛋白(BSA)完全溶解后轉(zhuǎn)移到有恩拉霉素的錐形瓶中，再用PBS溶液洗滌試管，將牛血清蛋白(BSA)完全移入錐形瓶，共用PBS溶液
11.5mL。待恩拉霉素基本溶解后，向錐形瓶中加入1，4-二氧六環(huán)10mL，混勻。將磁力攪拌器放入反應器后把錐形瓶放在ー個含少量水的大燒杯中，再將燒瓶置于28°C水浴，開啟攪拌器，約5min后，保持攪拌狀態(tài)，向反應器內(nèi)逐滴加入體積濃度為0.25%的戊二醛溶液4mL，滴加完畢后仍保持攪拌狀態(tài)，反應4h，反應時的pH值控制在7.8 (通過PBS溶液控制pH值)；即得恩拉霉素完全抗原混合液。
[0048]按實施例1的方法透析、干燥，得到恩拉霉素抗原。
[0049]實施例3采用本發(fā)明方法制備恩拉霉素抗原
[0050]配制PBS溶液(pH7.8~8.0):取磷`酸氫二鉀5.59g與磷酸二氫鉀0.41g,加水使溶解成1000ml，即得。
[0051]稱取恩拉霉素20mg盛于IOOmL錐形瓶中，稱取牛血清蛋白(BSA) 30mg于5號試管中。向試管中加入PBS溶液約3mL，待牛血清蛋白(BSA)完全溶解后轉(zhuǎn)移到有恩拉霉素的錐形瓶中，再用PBS溶液洗滌試管，將牛血清蛋白(BSA)完全移入錐形瓶，共用PBS溶液12mL。待恩拉霉素基本溶解后，向錐形瓶中加入1，4-二氧六環(huán)10mL，混勻。將磁力攪拌器放入反應器后把錐形瓶放在ー個含少量水的大燒杯中，再將燒瓶置于30°C水浴，開啟攪拌器，約5min后，保持攪拌狀態(tài)，向反應器內(nèi)逐滴加入體積濃度為0.25%的戊二醛溶液5mL，滴加完畢后仍保持攪拌狀態(tài)，反應4h，反應時的pH值控制在7.9 (通過PBS溶液控制pH值)；即得恩拉霉素完全抗原混合液。
[0052]按實施例1的方法透析、干燥，得到恩拉霉素抗原。
[0053]試驗例I恩拉霉素抗原的紫外光譜鑒定
[0054]采用UV2501-PC型紫外掃描儀對恩拉霉素、BSA和實施例1_3制備的恩拉霉素抗原進行紫外全波段掃描，波長范圍在200nm-400nm之間。結(jié)果得出，恩拉霉素標準品紫外最大吸收波長為279nm，BSA紫外最大吸收波長為278nm。當恩拉霉素與BSA偶聯(lián)形成免疫抗原后，其紫外最大吸收波長偏移至恩拉霉素和BSA特征峰之間，提示實施例1-3均偶聯(lián)成功且得到了恩拉霉素與BSA偶聯(lián)的免疫抗原Er-BSA，其中，實施例2制備的恩拉霉素抗原的紫外光譜鑒定結(jié)果如圖1所示。
[0055]試驗例2偶聯(lián)比率測定
[0056]偶聯(lián)比測定:是估算偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子的比率(偶聯(lián)比率)的方法，雖然測定方法種類很多，但都是依據(jù)檢測偶聯(lián)物中被偶聯(lián)的兩種分子含量(或相對含量)的原理建立起來的。分光光度法是利用物質(zhì)對光的吸收與其濃度呈比例關(guān)系的原理分別測定被偶聯(lián)的兩種分子濃度.在大分子與小分子偶聯(lián)物中，兩種分子均有各自不同的紫外掃描光譜,并表現(xiàn)出光譜圖迭加的性質(zhì)。
[0057]摩爾吸光系數(shù)e:配制恩拉霉素濃度為0，10，20，30^*111じ1，？11=7.2的？83溶液，通過紫外掃描可知恩拉霉素的最大吸收波長為278nm，在278nm處測吸光值，每個濃度做平行樣.摩爾吸光系數(shù)計算為:e =吸光值/摩爾濃度。本實驗計算得e =9264L ? mじ1。
[0058]偶聯(lián)物蛋白濃度測定:配制濃度為0，40，60，80，100ii g ? mじ1的牛血清蛋白溶液
1.5mL,加入5mL考馬斯亮藍染色液，立即混勻，30°C水浴溫熱5分鐘，每個濃度做平行樣，在595nm處測吸光值，繪制蛋白濃度與吸光值的關(guān)系曲線。將抗原溶液按ー定比例稀釋，在595nm處測定抗原溶液的吸光值，從曲線上得到抗原溶液的相應的蛋白濃度。
[0059]偶聯(lián)比測定:配制150 U g ?!!!じ1牛血清蛋白的pH=7.2的PBS溶液，將偶聯(lián)產(chǎn)物完全抗原用pH=7.2的PBS稀釋到 150 u g.mじ1，在278nm處測吸光值，以pH=7.2的PBS為空白，測出牛血清蛋白溶液的吸光值為Al，偶聯(lián)產(chǎn)物的吸光值為A2，則偶聯(lián)比率r為:[(A1-A2)/e ]/(150X10_3/67000)。
[0060]其中e為摩爾吸光系數(shù)(L^mor1)JTOOO為牛血清蛋白的分子量，150X10_3為牛血清蛋白濃度Og* mじ1)。
[0061]經(jīng)測定，實施例1、2、3制備的恩拉霉素抗原的偶聯(lián)比率r分別為:25.60,30.15，26.01。
[0062]另外，采用申請?zhí)枮镃N201010556432.2，發(fā)明名稱為“ー種恩拉霉素完全抗原的合成方法”的專利申請中公開的方法制備恩拉霉素抗原，并采用上述方法測定其偶聯(lián)比率，其偶聯(lián)比率約為22。
`[0063]從上述結(jié)果可以看出，本發(fā)明方法制備的恩拉霉素抗原的偶聯(lián)比率均高于現(xiàn)有方法，尤其是實施例2的方法制備的恩拉霉素抗原最好。
[0064]試驗例3采用本發(fā)明恩拉霉素抗原制備抗體
[0065]1、試驗材料與試驗方法
[0066]1.1試驗材料
[0067]新西蘭大白免；
[0068]恩拉霉素人工抗原(Er-BSA，分別由上述實施例1、2、3制備得到)；
[0069]弗氏完全佐劑(FCA, Sigma公司)；
[0070]弗氏不完全佐劑(FICA，Sigma公司)；
[0071]酶標二抗(山羊抗兔IgG-HRP，華美生物工程公司進ロ分裝);
[0072]96 孔酶標板(COSTAR)；
[0073]三甲基聯(lián)苯胺(TMB，AMRESC0公司)，其余化學試劑均為分析純。
[0074]1.2試劑的配制與用品準備
[0075]1.2.1配制試劑
[0076]0.85%生理鹽水溶液:0.85gNaCL溶于IOOmL去離子水；
[0077]萘氏試劑溶液:11.50gHgI和8.0OgKI溶于50mL蒸餾水中，攪拌溶解后，再加入50mL20%Na0H ；
[0078]飽和硫酸銨溶液:425g硫酸銨加入500mL去離子水中，然后邊加熱邊攪拌至基本溶解，趁熱過濾，待其冷卻到室溫后用氨水調(diào)PH到7.0 ；[0079]包被緩沖液(CBS，0.05M pH9.6):0.159g碳酸鈉和0.293g碳酸氫鈉溶解于離子水中，定容到IOOmL:
[0080]稀釋緩沖液(PBS,0.01M pH7.4):800gNaCL, 0.20gKCL, 0.20gKH2P04, 3.58g, Na2C03? 12H20，溶于800mL去離子水中，用NaCL或HCL i周pH7.2~7.4，定容到1000mL ；
[0081 ] 磷酸鹽洗滌緩沖液:將PBS緩沖液中添加0.05 % Tween-20 ；
[0082]TMB底物儲存液:IOmgTMB溶于2mLDMS0中，在4°C冰箱中避光保存；
[0083]檸檬酸緩沖液(pH5.0):2.3328g 檸檬酸，9.2006gNa2C03 ? 12H20,定容到 500mL ；
[0084]底物緩沖液:將檸檬酸緩沖液(pH5.0) 500mL中加入0.5mLTween-20 ；
[0085]樣品稀釋液；1.0LPBS 加 1.0mLTween-20 和 Ig 明膠；
[0086]終止液:2mol/LH2S04；
[0087]封閉液:明膠1.0g加入包被緩沖液(CBS) IOOmL ；
[0088]1.2.2主要儀器
[0089]酶標儀(Bio- Tek ELX800 型)；
[0090]各種規(guī)格移液槍(Eppendorf); [0091]BS100S型分析天平(北京賽多利斯公司);
[0092]DF-101S型恒溫加熱磁力攪拌器(河南予華儀器公司)；
[0093]漩渦振蕩儀；
[0094]恒溫水浴鍋；
[0095]ULT1386-3-V38型低溫冰箱(美國REVCO公司)；
[0096]D⑶-172K型常規(guī)冰箱(美國伊萊克斯公司)；
[0097]培養(yǎng)箱(浙江科通儀器公司)；
[0098]RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；
[0099]KQ-600型超聲波清洗器；
[0100]1.3試驗方法
[0101]1.3.1免疫方案
[0102]選10只健康的2月齡雄性實驗用清潔級新西蘭大白免，體重為2.0~2.50kg/只，用兔子分籠飼養(yǎng)，自由飲食；在免疫前采集陰性血清備用，免疫程序見表1。
[0103]表1實驗動物免疫方案程序
[0104]
【權(quán)利要求】
1.制備恩拉霉素抗原的方法，其特征在于包括如下步驟: a、取牛血清白蛋白，加入PBS溶液使牛血清白蛋白溶解； b、于a步驟所得的溶液中加入恩拉霉素，并使恩拉霉素溶解；其中，恩拉霉素與牛血清白蛋白的質(zhì)量比為1:1.2~1.5 ; C、恩拉霉素溶解后，在加入1,4-二氧六環(huán)，混勻；其中，所加入的1,4-二氧六環(huán)與PBS溶液的體積比為1:1.1~1.2 ; d、c步驟混勻后的溶液于25~30°C反應3~5h，并加入體積濃度為0.25%的戊二醛溶液；其中，加入的戊二醛溶液與1，4- 二氧六環(huán)溶液的體積比為0.35~0.45:1，反應時的pH值控制在7.5~7.9 ; e、透析，干燥后得到恩拉霉素抗原。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備恩拉霉素抗原的方法，其特征在于:所述的牛血清白蛋白的相對分子質(zhì)量為67000。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的制備恩拉霉素抗原的方法，其特`征在于:b步驟中所述的恩拉霉素與牛血清白蛋白的質(zhì)量比為1:1.3。
4.根據(jù)權(quán)利要求1~3任一項所述的制備恩拉霉素抗原的方法，其特征在于:c步驟中的1，4- 二氧六環(huán)與PBS溶液的體積比為1: 1.15。
5.根據(jù)權(quán)利要求1~4任一項所述的制備恩拉霉素抗原的方法，其特征在于:c步驟混勻后的溶液于28°C反應4h，并加入體積濃度為0.25%的戊二醛溶液；其中，加入的戊二醛溶液與1，4- 二氧六環(huán)溶液的體積比為0.4:1，反應時的pH值控制在7.7。
【文檔編號】C07K19/00GK103497256SQ201310487971
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年10月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年1月9日
【發(fā)明者】余華, 嚴玉寶, 葉健強, 廖黨金, 胡娟, 謝晶, 崔鵬博, 周岷江 申請人:中華人民共和國四川出入境檢驗檢疫局, 四川省畜牧科學研究院