專利名稱：兩步酶促法制備結(jié)合態(tài)熊去氧膽酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種7 α -羥基類固醇脫氫酶(7 a -HSDH)和 羥基類固醇脫氫酶(7i3-HSDH)聯(lián)用，兩步法催化結(jié)合態(tài)鵝去氧膽酸轉(zhuǎn)化為結(jié)合態(tài)熊
去氧膽酸的方法。
背景技術(shù)：
熊膽是名貴的中藥材，用于治療膽結(jié)石疾病以及各種急性、慢性肝病，具有良好的治療效果。牛磺熊去氧膽酸(TUDCA)是中藥材熊膽的主要有效成份之一。然而，中藥熊膽粉主要的獲取方式為“活熊引流取膽”，這有違野生動(dòng)物保護(hù)法，并且被認(rèn)為是非常不“人道” 的獲取方式。不過禽畜膽汁中存在眾多膽酸類物質(zhì)，尤其是雞鴨鵝膽汁中含有豐富的?；蛆Z去氧膽酸(T⑶CA)。T⑶CA與TUDCA的差別不僅在于7位羥基的差向異構(gòu)，而且它們的生物活性也相差甚遠(yuǎn)。目前TUDCA除可以從熊膽中提取外，其制備的方法還有化學(xué)合成法和生物轉(zhuǎn)化法?；瘜W(xué)合成牛磺熊去氧膽酸，國(guó)內(nèi)外報(bào)道主要有三種化學(xué)半合成法①用熊去氧膽酸(UDCA)與氯甲酸乙酯或特戊酰氯反應(yīng)形成混合酸酐，在堿性條件下與?；撬岱磻?yīng)，再經(jīng)離子交換柱純化制得TUDCA，總收率約62%[Arosio R, Rossetti V. US5565587.1995-10-15. (CA1994, 122:265776);Dayal B, et al. Bioorg Med Chem, 1996, 4]；②UDCA和?；撬嵩趬A性條件下分別在N-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2- 二氫喹啉(EEDQ，N-ethoxy-carbonyl-ethoxy-1, 2-dihydroquinoline)或氰基憐酸二乙酉旨(DEPC, diethylphosphorocyanidate)作用下直接縮合得TUDCA,收率分別為67%和90%,此法試劑價(jià)格昂貴[Momose T, et al. Lipids, 1997,32] ;@UDCA和氯甲酸乙酯形成混合酸酐后，與對(duì)輕基苯丙酮縮合，得熊去氧膽酸的活性酚酯，再與?；撬岱磻?yīng)制得TUDCA，總收率約64%，此法反應(yīng)步驟較多[Bonaldi A and Molinari E. US, 5362891. 1994-11]。比較三種合成方法，后兩種需用有機(jī)試劑EEDQ和DEPC，價(jià)格昂貴，制備也較煩瑣。上述合成中的原料UDCA，也主要是通過化學(xué)合成的方法得到。比如，工業(yè)上生產(chǎn)UDCA的7步合成法，以牛、羊膽酸(CA)為原料，經(jīng)膽酸甲酯化，二乙酰化，12位羥基CrO3-HOAc氧化，黃鳴龍還原合成鵝去氧膽酸(⑶CA)，再將⑶CA氧化成7-羰基石膽酸(7-KLCA)，然后在正丙醇中用金屬鈉還原得UDCA。另外，以鵝去氧膽酸(⑶CA)為原料，⑶CA甲酯化，3位羥基選擇性保護(hù)后用Jones試劑或NBS氧化7位羥基，然后在叔丁醇中用金屬鈉、二氯化鎳還原得UDCA[莊治平，等·有機(jī)化學(xué)，1986，(4) :281]。上述描述的化學(xué)合成法制備?；切苋パ跄懰岬倪^程復(fù)雜，要使用大量有機(jī)溶劑，存在有機(jī)溶劑殘留等缺點(diǎn)。這些化學(xué)合成法的最大缺點(diǎn)是只能在有機(jī)溶劑中進(jìn)行，且所用的底物是單體純物質(zhì)，無(wú)法對(duì)混合狀態(tài)存在的膽汁酸(如禽畜膽汁中的TCDCA或CDCA)進(jìn)行原位轉(zhuǎn)化而不影響其他成分。生物轉(zhuǎn)化也分微生物轉(zhuǎn)化和酶催化法。熊安明和法幼華采用泡木賊鐮刀菌將石膽酸轉(zhuǎn)化為M)CA[熊安明和法幼華.微生物學(xué)報(bào)，1995，35:204-208]。劉光澤等利用不和諧梭菌(C. absonum)將水解雞膽汁(不含結(jié)合態(tài)膽汁酸T⑶CA)中的⑶CA轉(zhuǎn)化成為UDCA [劉光澤等，中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1998，18:74-76]，但微生物本身的代謝會(huì)產(chǎn)生多種物質(zhì)，也給水解雞膽汁引入了很多雜質(zhì)，使產(chǎn)物的純化更加困難，且操作復(fù)雜，效率較低。Ferrandi EE 等米用來(lái)自撒丁島梭菌(Clostridium sardiniense, ATCC27555)的7 α -羥基類固醇脫氫酶能催化⑶CA轉(zhuǎn)化成7-羰基石膽酸(7-KLCA)，另外發(fā)現(xiàn)7 β -羥基類固醇脫氫酶能催化 7-KLCA 轉(zhuǎn)化成 UDCA [Ferrandi EE, et al. Appl MicrobiolBiotechnol 2012，95 (5) : 1221-1233]，但沒有報(bào)道以純CDCA作為底物，在這兩個(gè)酶的作用下連續(xù)催化直接轉(zhuǎn)化成UDCA。Pedrini P等采用來(lái)自嗜麥芽窄食單胞菌(Xanthomonasmaltophilia, CBS 897. 97)的7 α -羥基類固醇脫氫酶和7 β -羥基類固醇脫氫酶能將 CDCA 轉(zhuǎn)化成 UDCA[Pedrini P et al. Steroids, 2006，71:189 - 198], Tanaka N 等采用來(lái)自大腸桿菌(Escherichia coli)的7 α -輕基類固醇脫氫酶能將甘氨鵝去氧膽酸(GCDCA)催化成 7_ 擬基-甘氨鵝去氧膽酸(7-oxo-GCDCA) [Tanaka N, et al. Biochemistry1996，35:7715-7730]。
上述生物轉(zhuǎn)化法主要是將游離態(tài)的CDCA催化轉(zhuǎn)化為游離態(tài)的UDCA，沒有提到將T⑶CA (或G⑶CA)轉(zhuǎn)化為TUDCA (或GUDCA)。而且游離態(tài)的⑶CA和UDCA的水溶性差，不利于生物轉(zhuǎn)化在水溶液中進(jìn)行，而且第一步反應(yīng)完成后需要處理，再進(jìn)行第二步反應(yīng)，反應(yīng)比較麻煩，后處理多。綜上所述，TUDCA主要是以UDCA、CA或⑶CA為原料通過化學(xué)合成法來(lái)制備。目前為止還沒有文獻(xiàn)報(bào)道在動(dòng)物體外采用生物轉(zhuǎn)化方法將結(jié)合態(tài)鵝去氧膽酸(TCDCA和GCDCA)轉(zhuǎn)化成結(jié)合態(tài)熊去氧膽酸(TUDCA和⑶DCA)。另外將禽畜膽汁中的T⑶CA原位轉(zhuǎn)化為TUDCA的方法也未見報(bào)道。這是因?yàn)閯?dòng)物體內(nèi)的TCDCA轉(zhuǎn)化成TUDCA的過程相當(dāng)復(fù)雜，體外很難模擬。在動(dòng)物體內(nèi)T⑶CA轉(zhuǎn)化成TUDCA要依賴于體內(nèi)的膽汁酸肝腸循環(huán)過程，主要包括以下5個(gè)步驟(見下式)
權(quán)利要求
1.兩步酶促法制備結(jié)合態(tài)熊去氧膽酸的方法，包括如下步驟(I)在7α -羥基類固醇脫氫酶和氧化型輔酶NAD+或NADP+存在的條件下將溶于水溶液中的底物結(jié)合態(tài)鵝去氧膽酸的7位α -羥基氧化成羰基，形成中間產(chǎn)物結(jié)合態(tài)7-羰基-石膽酸；(2)在步驟(I)反應(yīng)后的混合物中，向混合物中加入7 β -羥基類固醇脫氫酶和還原型輔酶NADH或NADPH，將中間產(chǎn)物7位羰基還原成β-羥基得到結(jié)合態(tài)熊去氧膽酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述的水溶液的pH值為7-9。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述的水溶液為PH8.5磷酸鹽緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述步驟(1)、(2)的反應(yīng)溫度為30°C，反應(yīng)時(shí)間為1-3 小時(shí)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述的結(jié)合態(tài)鵝去氧膽酸包括?；蛆Z去氧膽酸見式 (I )、甘氨鵝去氧膽酸見式(2);結(jié)合態(tài)熊去氧膽酸包括牛磺熊去氧膽酸見式(3)、甘氨熊去氧膽酸見式(4)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述的7a -HSDH和7 β -HSDH轉(zhuǎn)化的底物是以單體形式存在或者以天然混合物狀態(tài)存在。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述的天然混合物狀態(tài)包括禽畜膽汁。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，禽畜膽汁包括雞、鴨、鵝、牛、狗、兔、羊的膽汁。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述的7α -羥基類固醇脫氫酶和7 β -羥基類固醇脫氫酶來(lái)自于微生物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述7α-羥基類固醇脫氫酶來(lái)自撒丁島梭菌(Clostridium sardiniense, ATCC27555)和脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis ATCC25825);所述7 β -輕基類固醇脫氧酶來(lái)自撒丁島梭菌(Clostridium sardiniense, ATCC27555)和產(chǎn)氣柯林斯菌(Collinsella aerofaciens，ATCC25986)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述的7a -HSDH和7β -HSDH是在非致病微生物中的表達(dá)產(chǎn)物。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述非致病微生物為大腸桿菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及兩步酶促法制備結(jié)合態(tài)熊去氧膽酸的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明在水溶液狀態(tài)下，能在7α-HSDH和7β-HSDH存在下轉(zhuǎn)化底物結(jié)合態(tài)鵝去氧膽酸為結(jié)合態(tài)熊去氧膽酸，而且中間步驟不需要分離，非常簡(jiǎn)單，而且轉(zhuǎn)化率非常高。特別是作為混合物狀態(tài)的雞膽汁，鴨膽汁或鵝膽汁，不需要將結(jié)合態(tài)鵝去氧膽酸分離純化就能發(fā)生反應(yīng)，該制備工藝簡(jiǎn)單，易行，為結(jié)合態(tài)熊去氧膽酸原料提供了新的簡(jiǎn)便的制備方法。
文檔編號(hào)C12P33/00GK102994604SQ20121047348
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月21日
發(fā)明者王伯初, 譚君, 婁德帥, 祝連彩, 劉紹勇, 岑小惜, 季慶治 申請(qǐng)人:上海凱寶藥業(yè)股份有限公司