專利名稱：雙峰駝PPARγ蛋白基因、重組蛋白及其克隆方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，是一種雙峰駝PPAR Y蛋白基因、重組蛋白及其克隆方法。
背景技術(shù)：
過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proIiferatorac-tivated receptor, PPAR)因?yàn)槟軌蚴剐∈笫艿疆惙N刺激后引起肝臟過氧化物酶體降低而被命名， 是一種核受體，同時(shí)本身也是配體激活轉(zhuǎn)錄因子，屬于激素核受體家族。能夠被一些降脂藥物和脂肪酸類物質(zhì)激活，與配體結(jié)合后被激活，然后與視黃醇類受體形成二聚體，再與所調(diào)節(jié)基因上游的過氧化物酶體增物反應(yīng)元件(peroxiome proliferator respon-civa alamant, PPRE)結(jié)合而發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，激活某些與脂肪代謝相關(guān)的蛋白或酶基因， PPARs調(diào)控多種在脂類代謝不同途徑的基因，包括脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞吸收、細(xì)胞內(nèi)結(jié)合以及分解(β氧化和ω氧化)和儲(chǔ)存；參與脂肪細(xì)胞的生成和轉(zhuǎn)化；不僅能促進(jìn)前脂肪細(xì)胞的分化，而且也能促進(jìn)非脂肪細(xì)胞系細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞，促進(jìn)脂肪沉積。PPAR基因在不同物種中存在α，β和Υ 3種亞型，它們由不同的基因編碼，結(jié)構(gòu)、功能及在不同組織的表達(dá)量都有較大差異，其中對(duì)脂肪代謝有影響的主要是PPARa和PPAR Y。
PPARy協(xié)同C/EBP (CCAAT)轉(zhuǎn)錄因子影響脂肪酸在脂肪組織中的貯存，能誘導(dǎo)脂肪前體細(xì)胞成熟為脂肪細(xì)胞，是脂肪細(xì)胞分化的一部分。并且，大多數(shù)PPARy目的基因直接參與脂肪合成途徑。PPARy可以激活脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶，完成脂肪酸向肝臟的轉(zhuǎn)運(yùn)；PPARy能上調(diào)長(zhǎng)鏈脂肪酸基因的表達(dá)，形成酯酰輔酶A15PPARy誘導(dǎo)小脂肪細(xì)胞的形成，調(diào)控脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase, LPL)、脂肪型脂肪酸結(jié)合蛋白(adlipocyte fatty acid-binding proteins, A-FABP)、乙酸輔酶 A 合成酶(acetyl coenzyme A synzyme, ACAS)、脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase, FAS)與脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(fatty acid transport protein, FATP)等的表達(dá),抑制瘦素(Ieptin)的表達(dá)，能防止高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖。PPARy在脂肪、肌肉、肝臟等多種與胰島素作用有關(guān)的組織中表達(dá)，激活后可調(diào)控與葡萄糖的產(chǎn)生、轉(zhuǎn)運(yùn)、利用及脂肪代謝的調(diào)節(jié)相關(guān)的基因的表達(dá)。在人PPARy基因多態(tài)性研究方面，發(fā)現(xiàn)了 Prol2Ala多態(tài)位點(diǎn)，血清載脂蛋白B在不同基因型個(gè)體間差異顯著，該位點(diǎn)得到了廣泛的研究，認(rèn)為其與脂肪代謝異常、增強(qiáng)胰島素敏感性及降低糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)。
PPARy在脂肪酸代謝中有著關(guān)鍵的調(diào)控作用，因此，通過對(duì)PPAR Y從基因、蛋白質(zhì)、酶活性和抑制劑等多方面的研究，必然會(huì)為肥胖、胰島素抵抗綜合癥、糖尿病等疾病的預(yù)防和治療帶來新的希望。
雙峰駝?dòng)休^強(qiáng)的耐旱和沉積脂肪能力，尤其是在水草充足的季節(jié)，駝峰能在短時(shí)間內(nèi)沉積大量脂肪，很適合進(jìn)行脂類代謝研究。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種雙峰駝PPARy蛋白基因，該基因是一種影響脂肪酸在脂肪組織中的貯存和轉(zhuǎn)運(yùn)，能誘導(dǎo)脂肪前體細(xì)胞成熟為脂肪細(xì)胞，并且直接參與脂肪合成途徑，與機(jī)體組織對(duì)糖的利用、胰島素敏感性、脂質(zhì)合成和能量平衡等密切相關(guān)的基因，其核苷酸序列與馬的PPAR Y蛋白核酸序列XM_001499929. 2具有95%的相似性。
本發(fā)明的技術(shù)方案之一是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的一種雙峰駝PPAR Y蛋白基因， 該基因具有SEQ ID NO.1中從核苷酸第33-2276位的核苷酸序列；其同牛、人、鼠、豬PPAR Y 基因編碼蛋白序列同源性為95. 00%，編碼氨基酸序列同源性為86. 00%。
本發(fā)明的技術(shù)方案之二是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的一種雙峰駝PPAR Y蛋白基因的重組蛋白。
下面是對(duì)上述發(fā)明技術(shù)方案之二的進(jìn)一步優(yōu)化或/和改進(jìn)上述重組蛋白的核苷酸序列為SEQ ID NO.1。
上述重組蛋白具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、 或其活性片段、或其活性衍生物。
上述重組蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO. 2。
上述重組蛋白通過設(shè)計(jì)一對(duì)引物從雙峰駝PPAR Y蛋白中得到雙峰駝PPARy蛋白基因，該引物對(duì)的核苷酸序列為SEQ ID NO. 3 (正向)和SEQ ID NO. 4 (反向)，序列信息如下SEQ ID NO. 3 (正向)5，- ATGGCGTGGGACATGTGC-3，，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。
本發(fā)明的技術(shù)方案之三是通過以下措施來實(shí)現(xiàn)的一種雙峰駝PPARy蛋白基因的克隆方法，按下述步驟進(jìn)行第一步，組織分離(Isolation);第二步，總RNA的分離 (Total RNA isolation),總 RNA 的分離(Total RNA isolation)包括提取RNA 的準(zhǔn)備工作、 組織總RNA提取、組織總RNA的鑒定；第三步,全長(zhǎng)cDNA的克隆(Cloning of Full-length cDNA)，全長(zhǎng)cDNA 的克隆(Cloning of Full-length cDNA)包括引物設(shè)計(jì)及合成、RT-PCI^r 增、克隆和測(cè)序，該引物對(duì)的核苷酸序列為SEQ ID NO. 3 (正向WPSEQ ID NO. 4 (反向)，序列信息如下SEQ ID NO. 3 (正向)5，- ATGGCGTGGGACATGTGC-3，，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。
本發(fā)明雙峰駝PPAR Y蛋白是一種具有多種生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)，它不僅在糖代謝和脂肪酸代謝中有著關(guān)鍵的調(diào)控作用，因此，通過對(duì)PPAR Y從基因、蛋白質(zhì)、酶活性和抑制劑等多方面的研究，必然會(huì)為肥胖、胰島素抵抗綜合癥、糖尿病等疾病的預(yù)防和治療帶來新的希望，因此本發(fā)明具有很大的應(yīng)用價(jià)值。


附圖1為本發(fā)明雙峰駝PPAR Y蛋白基因RT-PCR產(chǎn)物電泳圖。
附圖2為為雙峰駝和牛、人、鼠、豬等14種動(dòng)物用Clustal X中對(duì)齊的PPARy蛋白氨基酸序列同源性比較結(jié)果圖。
附圖3為本發(fā)明雙峰駝PPARy蛋白氨基酸序列和牛、人、鼠、豬等14種動(dòng)物 PPARy蛋白氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明不受下述實(shí)施例的限制，可根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案與實(shí)際情況來確定具體的實(shí)施方式。
實(shí)施例1 :一種雙峰駝PPAR Y蛋白基因，該基因具有SEQ ID NO.1中從核苷酸第 33-2276位的核苷酸序列；其同牛、人、鼠、豬PPARy基因編碼蛋白序列同源性為95. 00%，編碼氨基酸序列同源性為86. 00%。
實(shí)施例2 :—種雙峰駝PPAR Y蛋白基因的重組蛋白。
實(shí)施例3 :重組蛋白的核苷酸序列為SEQ ID NO.1。
實(shí)施例4 :重組蛋白具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
實(shí)施例5 :重組蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO. 2。
實(shí)施例6 :重組蛋白通過設(shè)計(jì)一對(duì)引物從雙峰駝PPAR Y蛋白中得到雙峰駝PPAR Y 蛋白基因，該引物對(duì)的核苷酸序列為SEQ ID NO. 3 (正向)和SEQ ID NO. 4 (反向)，序列信息如下SEQ ID NO. 3 (正向)5，- ATGGCGTGGGACATGTGC-3，，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。
實(shí)施例7 :—種雙峰駝PPAR Y蛋白基因的克隆方法，按下述步驟進(jìn)行第一步， 組織分離(Isolation);第二步，總RNA的分離(Total RNA isolation),總RNA的分離 (Total RNA isolation)包括提取RNA的準(zhǔn)備工作、組織總RNA提取、組織總RNA的鑒 定；第三步，全長(zhǎng) cDNA 的克隆(Cloning of Full-length cDNA),全長(zhǎng) cDNA 的克隆(Cloning of Full-length cDNA)包括引物設(shè)計(jì)及合成、RT-PCR擴(kuò)增、克隆和測(cè)序，該引物對(duì)的核苷酸序列為SEQ ID NO. 3 (正向)和SEQ ID NO. 4 (反向)，序列信息如下SEQ ID NO. 3 (正向)5，- ATGGCGTGGGACATGTGC-3，，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。
雙峰駝PPAR Y蛋白基因cDNA序列的克隆1.組織分離(Isolation)從內(nèi)蒙古阿拉善盟采得雙峰駝，快速屠宰并取肝臟樣，將組織樣迅速放入液氮中冷凍后于-70°C保存，拿回實(shí)驗(yàn)室準(zhǔn)備提取組織總RNA。
2.總 RNA 的分離(Total RNA isolation)(I)提取RNA的準(zhǔn)備工作玻璃制品用0. lmol/L的NaOH浸泡過夜，用自來水反復(fù)沖洗，再用蒸餾水沖洗2 遍，180°C烘烤4小時(shí)。
勻漿器、電泳槽用3%的雙氧水浸泡20分鐘至30分鐘，再用0. 1%的DEPC水沖洗.由于未滅活的DEPC對(duì)PCR反應(yīng)有影響，可用0. 5%的SDS處理。
Tip頭、EP管用0. 1%的DEPC水浸泡過夜，高壓滅菌使DEPC失活。
雙蒸水和溶液用DEPC處理，即每IOOml水或溶液加0.1mlDEPC液，室溫放置過夜，高壓滅菌30分鐘DEPC失活。
(2)組織總RNA提取取IOOmg在液氮中凍存的組織樣放入有Iml Trizol (trizal reagent, invitrogen BRL, USA)的勻漿器管中勻漿。4°C、12000g離心10分鐘；吸取上清液，15°C至30°C溫育5 分鐘；加O. 2ml氯仿，蓋上蓋子，用手劇烈震蕩15秒，15°C至30°C溫育2分鐘至3分鐘； 4°C、12000g離心15分鐘，吸取上清液，加O. 8ml異丙醇，混合均勻；15°C至30°C溫育10分鐘，4°C、12000g離心10分鐘，離心管底部白色沉淀即為RNA ;倒掉上清，加Iml 75%乙醇洗滌RNA，40C 7500g離心10分鐘；自然干燥或真空干燥RNA.溶于水(RNase free)中分裝，-70°C保存。
(3)組織總RNA的鑒定通過分光光度計(jì)上測(cè)定RNA含量并且用瓊脂糖電泳分析RNA的質(zhì)量，具體方法如下電泳槽用RNA清洗液(IOOmM NaOH, ImM EDTA)浸泡4小時(shí)至5小時(shí)，再用DEPC處理過的水反復(fù)沖洗數(shù)次后倒入I XTBE待用；瓊脂糖凝膠用IXTBE配制；在IOul上樣緩沖液(2XTBE， 13%菲可，O. 1%溴酚蘭，7M尿素)中加入Iul以上組織總RNA，65°C變性10分鐘后立即放入冰水中2分鐘至3分鐘。點(diǎn)樣于瓊脂糖凝膠中電泳。
3.全長(zhǎng) cDNA 的克隆(Cloning of Full-length cDNA)(1)引物設(shè)計(jì)及合成根據(jù) GenBanK 發(fā)表的牛(Accession No: AB106107.1) 、人(Accession No: AF159714.1)、鼠(Accession No: BC066868.1)等物種的 PPAR Y 蛋白基因 mRNA 序列 ORF側(cè)翼同源序列，設(shè)計(jì)如下引物用于以雙峰駝PPARy蛋白cDNA為模版的PCR擴(kuò)增，以獲得雙峰駝PPARy蛋白基因cDNA序列。引物用Primer Premier 5.0自行設(shè)計(jì)，由上海桑尼生物科技有限公司合成，該引物對(duì)的核苷酸序列為SEQ ID NO. 3 (正向WPSEQ ID NO. 4 (反向)， 序列信息如下SEQ ID NO. 3 (正向)5，- ATGGCGTGGGACATGTGC-3，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT(2)RT-PCR 擴(kuò)增按大連寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒(BcaBEST RNA PCR Kit Ver.1.1)要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液組成IOul 2 XBca 1st Buffer, 4ul 25Mm MgS04, Iul dNTP Mixtur, 0. 5ul Rnase Inhibitor (40U/ul),Iul BcaBEST Polymerase(22U/ul), Iul Oligo dT Primer,Iul RNA Sample,1. 5ul Rnase Free dH20，總體系為 20 ul。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件65°C I 分鐘，30°C 5 分鐘(15分鐘至30分鐘內(nèi)勻速升溫)，65°C 25分鐘，98°C 5分鐘，5°C 5分鐘。PCR擴(kuò)增條件 970C變性5分鐘；95°C 30秒一55°C 30秒一72°C I分鐘，如此進(jìn)行30次循環(huán)；72°C延伸 10分鐘，4°C保存。
(3)克隆和測(cè)序PCR擴(kuò)增片段的回收片段回收按上海華舜小量膠回收試劑盒說明進(jìn)行，操作過程如下盡可能小的割下含DNA的瓊脂糖塊，放入1.5mlEP管中，按每IOOmg瓊脂糖加入 300ulSl液的比例加SI液，50°C水浴10分鐘；將溶化的瓊脂糖液移入吸附柱，IOOOOg離心I分鐘，倒掉管中液體；在吸附柱中加入500ul Wl液，IOOOOg離心15秒，倒掉管中液體；在吸附柱中加入500ul Wl液，靜置I分鐘后，IOOOOg離心15秒，倒掉管中液體， 離心I分鐘；將吸附柱放入一個(gè)干凈的1. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入30ulTl液，靜置I分鐘后，IOOOOg離心I分鐘，EP管中液體即為回收的DNA。
回收片段同T載體的連接連接用TaKaRa pMD18_T Vector試劑盒，操作過程如下，在 EP 管中制備下列連接反應(yīng)液pMD 18-T Vector (50ng/ul) O. 5ul, DNA 20_40ng， Solution I 5ul，加dH20至IOul ;將上述反應(yīng)液在16°C反應(yīng)30分鐘(過夜也可以)，產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。
質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化從_70°C冰箱中取出保存的感受態(tài)細(xì)胞，冰浴助溶；IOOul感受態(tài)細(xì)胞加入IOul連接產(chǎn)物，冰浴30分鐘；42°C水浴熱應(yīng)激90秒鐘，立即置入冰浴中2分鐘；力口 400ul液體LB培養(yǎng)基，37°C復(fù)活50分鐘；取IOOul鋪于LB平板上，平板含O. 1%(V/V)的氨節(jié)青霉Amp (100mg/ml) ;37°C恒溫培養(yǎng)10-15小時(shí)。
轉(zhuǎn)化菌落的PCR鑒定與培養(yǎng)用記號(hào)筆標(biāo)記轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的單菌落，用滅菌的牙簽蘸取單菌落；將牙簽頭放入在加有PCR反應(yīng)液(不含模板)的EP管中晃動(dòng)，使單菌落充當(dāng)模板； 用獲得該片段的PCR條件進(jìn)行擴(kuò)增；PCR產(chǎn)物同Marker —起進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，鑒別T載體上是否含有目的片段；若得到目的片段，可用滅菌槍頭挑取在平板上的與之對(duì)應(yīng)的單菌落，放入40 ml LB液體培養(yǎng)基中，先在液體中加入0. 1%(V/V)的青霉素鈉(100mg/ml)，37°C 過夜搖菌培養(yǎng)，用于質(zhì)?；厥?。
質(zhì)粒的回收質(zhì)粒回收用上海華舜小量質(zhì)粒抽提純化試劑盒，操作步驟如下將轉(zhuǎn)化培養(yǎng)的菌液加入1. 5mlEP管中，4000轉(zhuǎn)/分鐘離心，倒掉液體獲細(xì)菌沉淀，細(xì)菌沉淀不夠時(shí)可再加一次菌液離心；在細(xì)菌沉淀中加入250ulPl液，振蕩懸浮，加入250ulP2液， 溫和搖勻，室溫靜置4分鐘；加入350ulP3液，溫和搖勻，離心10分鐘，將上清液小心移入吸附柱，離心15秒，倒掉液體；在吸附柱中加入500ulWl，離心15秒，倒掉液體；在吸附柱中加入500ulWl，靜置I分鐘，離心15秒，倒掉液體，離心I分鐘；將吸附柱放入一個(gè)干凈的1. 5mlEP管中，在吸附膜中央加入25-30ulTl液，靜置I分鐘后，離心I分鐘， EP管中液體即為回收的質(zhì)粒。
質(zhì)粒的酶切鑒定為了證明回收質(zhì)粒確為插入目的片段的重組質(zhì)粒，采用雙酶切法鑒定，本研究具體操作 如下根據(jù)TaKaRa pMD18_T Vector圖，選擇內(nèi)切酶Bam H I和 Hin d III,保證目的片段中無這兩種酶的切點(diǎn)；組成如下酶切反應(yīng)體系Bam H I lul, Hin d III Iul，10XK Buffer 2ul, DNA 彡 lul，加 dH20 至 20ul，30°C反應(yīng) 3 小時(shí)，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。
重組質(zhì)粒的測(cè)序取20ul重組質(zhì)粒于EP管中，封口膜密封，交生物技術(shù)公司測(cè)序。
雙峰駝PPAR Y蛋白基因編碼序列同源性比較和系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建1、雙峰駝PPARy蛋白基因編碼序列同源性比較在GenBank上搜索并獲得牛、人、鼠、豬等14種動(dòng)物的PPAR Y蛋白基因編碼蛋白序列， 將其同克隆測(cè)序獲得的本發(fā)明獲得的SEQ ID NO.1序列一起，在分子生物學(xué)軟件MEGA4上進(jìn)行序列同源性比較見附圖2。比較結(jié)果顯示，其同牛、人、鼠、豬PPARy基因編碼蛋白序列同源性為95. 00%，編碼氨基酸序列同源性為86. 00%。
2, PPAR Y蛋白基因編碼序列系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建在GenBank上搜索并獲得牛、人、鼠等14種物種的14條PPAR Y蛋白基因的編碼蛋白序列，加上本發(fā)明獲得的SEQ ID NO. 2序列，利用分子生物學(xué)軟件MEGA4構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹見附圖3。結(jié)果顯示，雙峰駝PPARy蛋白基因同豬的親緣關(guān)系最近；間接證明了所得到的序列確為雙峰駝PPARy蛋白基因。
本發(fā)明在提供了雙峰馬它PPAR Y蛋白基因的cDNA序列和蛋白編碼序列基礎(chǔ)上；將牛、人、鼠、豬等不同物種PPAR Y蛋白基因的CDS序列和氨基酸序列進(jìn)行同源性比較；對(duì)包括雙峰駝在內(nèi)的14個(gè)物種的14個(gè)PPAR Y蛋白基因的CDS序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹。
本發(fā)明中的雙峰駝PPARy蛋白基因的cDNA序列是通過以雙峰駝肝臟組織中總 RNA為模板，參考牛、人、鼠等物種的PPAR Y蛋白基因的同源序列設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR 而獲得的新基因序列。獲得的雙峰駝PPAR Y蛋白基因cDNA序列見SEQ ID NO.1。將雙峰駝PPAR Y蛋白基因cDNA序列中的編碼序列(CDS)按通用密碼子翻譯成的蛋白質(zhì)編碼序列見 SEQ ID NO. 2。
本發(fā)明在SEQ ID NO.1中，RT-PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為2283bp，電泳結(jié)果見附圖1，其中 33-35位為起始密碼子ATG，2274-2276位為終止密碼子TAA，33-2276位為編碼蛋白質(zhì)區(qū)域 (⑶S)。在SEQ ID NO. 1，雙峰駝PPARy蛋白基因編碼747個(gè)氨基酸。雙峰駝和豬、人、鼠、 牛等動(dòng)物用Clustal X中對(duì)齊的PPAR Y蛋白基因編碼氨基酸序列同源性比較結(jié)果見附圖2。對(duì)包括SEQ ID NO.1在內(nèi)的14個(gè)物種的14條PPAR Y蛋白基因的⑶S序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雙峰駝PPARy蛋白同豬和牛的進(jìn)化距離最近，間接證明了所得到的序列確為雙峰駝PPAR Y蛋白基因。
本發(fā)明參考其它物種PPAR Y基因序列，克隆測(cè)序獲得雙峰駝PPAR Y基因的cDNA 序列，并對(duì)不同物種PPAR Y基因的⑶S序列進(jìn)行同源性比較，旨在了解和驗(yàn)證PPARy基因的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，為今后研究PPAR Y基因與雙峰駝脂類代謝 的關(guān)系提供基礎(chǔ)資料。
以上技術(shù)特征構(gòu)成了本發(fā)明的實(shí)施例，其具有較強(qiáng)的適應(yīng)性和實(shí)施效果，可根據(jù)實(shí)際需要增減非必要的技術(shù)特征，來滿足不同情況的需求。
序列 表<110>新疆旺源駝奶實(shí)業(yè)有限公司〈120〉雙峰駝PPAR Y蛋白的蛋白編碼序列〈160〉 4〈210〉 I〈211〉 2128〈212〉 DNA〈213〉阿拉善盟雙峰駝 〈400〉 Iaaacagcttg attggcgtca ttcaggagct ggatggcgtg ggacatgtgc aaccaggact60ctgtatggag tgacatcgag tgtgctgctc tggttggtga agaccagcct ctttgcccag120atcttcctga acttgacctt tctgaactag acgtgaacga cttggataca gacagctttc180tgggtggact caagtggtgc agtgaccaat cagaaatcat atccaatcag tacaacaatg240agccttcgaa catatttgag agcactggtg ggatctgggt attctttgcc ctgcaattgc300ggtctgctgc caacgagaag atagatgaag agaatgaggc aaacttgcta gcagtcctca360cagagacact ggacagtctc cctgtggatg aagacggatt gccctcattt gatgcactga420cagatggaga tgtgaccacc gagaatgagg ctagtccttc ctccatgcct gacgacaccc480ctccgcctca ggaggcagaa gagccgtccc taaccgagaa ttcatggagc aataaagcga540agagcatttg tcaacagcaaaagccacaaa gacgtccctg ctcggagctt ctcaagtatc600tgaccacaaa tgatgaccctcctcacacca aacccacaga gaccaggaac agcagcagag660acaaatgcac ctccagaaagaaggcccaca cacaagctca gtctcaccac ttacaagcca720aaccaacaac tttatctcttcctctgaccc cagagtcacc aaatgacccc aagggttccc780catttgagaa caagactattgaacgaacct taagtgtgga actctctgga actgcaggtc840taactccacc cacaactcctcctcataaag ccaaccaaga taaccctttt agggcttctc900caaagctgaa gccctcttgcaagactgtgg tacctccgcc atcaaagaag ccccggtaca960gtgagtcttc tggtacccaaggcaataacc ccaccaagaa agggccggag cagtcggagt1020tgtacgcaca gctcagcaagacctcagtgc tcaccagtgg acacgaggaa aggaaggcca1080ggcggcccag tctgcggctgtttggtgacc atgactattg tcagtcaatt aattccaaaa1140cggaaatact tattaacatatcacaggagc tccaagactc tagacaacta gaatacaaag1200atgcttcctc cgactggcaggggcagatgt gcccttccac agattcagac cagtgctacc1260tgagagagac ttcggaggcgagcaggcagg tctctcccgg cagcaccaga aaacagctcc1320aagaccagga aatccgagctgagctgaaca agcatttcgg ccatcccagt cgagctgttt1380ttgacgacga agcagacaagaccagtgaac tgagggacag tgatttcagt aatgaacaat1440tctccaaact acctatgtttataaattcag gactagccat ggatggcctg tttgatgaca1500gcgaagatga aagtgataaactgaactccc catgggatgg cgcgcaaccc tattcgttat1560ctggctacta ctatgaggcaggacactgca gacacccaac gcaccgaaat tctccgctgt1620gcgcaagatc acgttcaagatcaccctgca gccggcggcc caggtatgac agctacgagg1680agtatcagca cgagaggctgaagagggaag aataccgcaa agagtatgag aaacgggagt1740ctgaaagggc caaacaaagggagaggcaga ggcagaaggc aattgaagaa cgccgtgtga1800tttatgttgg taaaatcagacctgacacaa cacggacaga actgagggac cgttttgaag1860tttttggtga aattgaggagtgcacagtaa atctccggga tgatggagac agctatggtt1920tcattaccta ccgttatacctgtgatgctt ttgctgctgt tgaaaatgga tacactttgc1980gcaggtcgaa tgaaactgacttcgagctgt acttttgtgg acgcaagcaa tttttcaagt2040ctaactatgc agacctagattcaaactcag atgactttga ccctgcttcc accaagagca2100agtatgactc tctggatttcgatagtttac tgaaggaagc tcagagaagc ttgcgcaggc2160gactggtggt ccttgtgaccgagaagccag agaatacatt attagcgctc tgtcctcccc2220cgatttcaga tagtagtccccatgcccaac cgcttacact gcaagattca gcataaaaga2280cta2283 〈210〉 2 〈211〉 747 〈212〉 PRT 〈213〉阿拉善盟雙峰駝 〈400〉 2MAWDMCNQDS VWSDIECAALVGEDQPLCPD LPELDLSELD VNDLDTDSFL GGLKWCSDQS60EIISNQYNNE PSNIi^STGGIWVFFALQLR SAANEKffiEE NE/W1A1T EHOSIPVDE120DGLPSFDALT DGDVTTENEASPSSMPDDIP PPQEAEEPSL IENSWSNKAK SIOQQQKPQR180RPCSELLKYL TTODPPfflKPIETRNSSRD KCTSRKKAHT QAQSHffijQAK FTTLSLPLIP240
權(quán)利要求
1.一種雙峰駝PPARy蛋白基因，其特征在于該基因具有SEQ ID NO.1中從核苷酸第 33-2276位的核苷酸序列；其同牛、人、鼠、豬PPARy基因編碼蛋白序列同源性為95. 00%，編碼氨基酸序列同源性為86. 00%。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙峰駝PPAR Y蛋白基因的重組蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組蛋白，其特征在于該重組蛋白的核苷酸序列為SEQID NO.1。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的重組蛋白，其特征在于該重組蛋白具有SEQID NO.1所示的氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的重組蛋白，其特征在于該重組蛋白的氨基酸序列為SEQ ID NO. 2。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組蛋白，其特征在于該重組蛋白的氨基酸序列為SEQID NO. 2。
7.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的重組蛋白，其特征在于通過設(shè)計(jì)一對(duì)引物從雙峰駝 PPARy蛋白中得到雙峰駝PPAR Y蛋白基因，該引物對(duì)的核苷酸序列為SEQ ID NO. 3 (正向) 和SEQ ID NO. 4 (反向),序列信息如下SEQ ID NO. 3 (正向)5，- ATGGCGTGGGACATGTGC-3，，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組蛋白，其特征在于通過設(shè)計(jì)一對(duì)引物從雙峰駝PPARy 蛋白中得到雙峰駝PPARy蛋白基因，該引物對(duì)的核苷酸序列為SEQ ID NO. 3 (正向)和SEQ ID NO. 4 (反向)，序列信息如下SEQ ID NO. 3 (正向)5，- ATGGCGTGGGACATGTGC-3，，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。
9.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的重組蛋白，其特征在于通過設(shè)計(jì)一對(duì)引物從雙峰駝 PPARy蛋白中得到雙峰駝PPAR Y蛋白基因，該引物對(duì)的核苷酸序列為SEQ ID NO. 3 (正向) 和SEQ ID NO. 4 (反向),序列信息如下SEQ ID NO. 3 (正向)5，- ATGGCGTGGGACATGTGC-3，，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。
10.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙峰駝PPAR Y蛋白基因的克隆方法，按下述步驟進(jìn)行 第一步，組織分離(Isolation);第二步，總RNA的分離(Total RNA isolation),總RNA的分離(Total RNA isolation)包括提取RNA的準(zhǔn)備工作、組織總RNA提取、組織總RNA的鑒定；第三步，全長(zhǎng) cDNA 的克隆(Cloning of Full-length cDNA),全長(zhǎng)cDNA 的克隆(Cloning of Full-length cDNA)包括引物設(shè)計(jì)及合成、RT-PCR擴(kuò)增、克隆和測(cè)序，該引物對(duì)的核苷酸序列為SEQ ID NO. 3 (正向)和SEQ ID NO. 4 (反向)，序列信息如下SEQ ID NO. 3 (正向)5，- ATGGCGTGGGACATGTGC-3，，SEQ ID NO. 4 (反向)01igo dT。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，是一種雙峰駝PPARγ蛋白基因、重組蛋白及其克隆方法；該基因具有SEQIDNO.1中從核苷酸第33-2276位的核苷酸序列。本發(fā)明雙峰駝PPARγ蛋白是一種具有多種生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)，它不僅在糖代謝和脂肪酸代謝中有著關(guān)鍵的調(diào)控作用,因此,通過對(duì)PPARγ從基因、蛋白質(zhì)、酶活性和抑制劑等多方面的研究,必然會(huì)為肥胖、胰島素抵抗綜合癥、糖尿病等疾病的預(yù)防和治療帶來新的希望，因此本發(fā)明具有很大的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)C12N15/12GK103014002SQ20121047825
公開日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月22日
發(fā)明者陳鋼糧 申請(qǐng)人:新疆旺源駝奶實(shí)業(yè)有限公司