專利名稱：植物抗逆性相關蛋白TaNAC67及其編碼基因與應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種植物抗逆相關蛋白TaNAC67及其編碼基因與應用。
背景技術：
干旱缺水是全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)面臨的嚴重問題，也是制約我國糧食生產(chǎn)發(fā)展的重要因素。主要糧食作物小麥的栽培需要大量的水，我國平均每生產(chǎn)I噸小麥需水量約500-700m3。全世界發(fā)展中國家至少有6000萬公頃小麥栽培在雨養(yǎng)耕地，但其產(chǎn)量水平只有灌溉條件下的10%-50%。所以，發(fā)展抗旱節(jié)水小麥品種，以提高作物的水分利用效率，既可增加產(chǎn)量，又可以緩解水資源短缺的矛盾。改良作物抗旱性對于提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)力具有重大意義，受到世界各國的高度重視，近期我國啟動的轉(zhuǎn)基因作物新品種培育重大專項就是最好的實證。研究植物的抗旱機理、克隆抗旱相關基因、通過基因工程改良作物抗旱性是培育抗旱作物新品種的一條有效途徑。雖然作物的抗旱性遺傳基礎復雜，克隆、轉(zhuǎn)化抗旱基因獲得抗旱性明顯提高的新品種難度較大，但經(jīng)眾多科學家的共同努力，已經(jīng)取得了一定的進步，涌現(xiàn)了不少成功的例子，如 Cheng 等(Wheat LEA genes, PMA80 and PMA1959, enhancedehydration tolerance oftransgenic rice (Oryza sativaL.), Molecular Breeding, 2002,10 71-82)把小麥的 LEA蛋白基因?qū)胨?，轉(zhuǎn)基因植株的抗旱、耐鹽性得到了明顯提高；WU等(Over-expressionof an Arabidopsis δ-OAT gene enhances saltand drought tolerance intransgenicrice, Chinese Science Bulletin :2003，48 :2594_2600)將擬南芥的 δ-OAT 基因轉(zhuǎn)入水稻中過量表達，轉(zhuǎn)基因植株中脯氨酸含量明顯增加，抗旱和耐鹽性明顯增強；Dubouzet等(OsDREB genes in rice,Oryza sativaL.，encode transcription activators thatfunction in drought-, high-salt-andcold-responsive gene expression, Plant J，2003,33 751-763)將水稻轉(zhuǎn)錄激活蛋白基因OsDREB導入擬南芥后，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)了強抗旱、抗鹽和耐寒特性。Hu等將OsNACl基因?qū)氲剿局?，轉(zhuǎn)基因后代的抗旱性得到明顯增強，而且不影響后代產(chǎn)量(Overexpressing a NAM, ATAF, and CUC (NAC) transcriptionfactor enhancesdrought resistance and salt tolerance in rice, Hu 等 2006, ProcNatl Acad SciUSA, 10 :71_82)。目前，已克隆的抗旱相關基因主要包兩大類，第一類為功能基因，這類基因包括低分子可溶性糖、氨基酸和小分子蛋白質(zhì)等合成相關基因，以及保護細胞免受損害的酶類，如脯氨酸合成相關酶基因，包括吡咯啉-5-羧酸合成酶基因P5CS及PVAB2，吡咯琳-5-羧酸還原酶基因P5CR等；晚期胚胎發(fā)生豐富蛋白(LEA)，小麥LEA蛋白基因(The molecular basisof dehydration tolerance in plants, Ingram 等 1996, AnnuRev Plant Physiol PlantMol Biol,47 :377_403)。第二類是調(diào)節(jié)基因，包括各種參與水分脅迫信號傳遞的基因，主要包括(I)參與ΑΒΑ、乙烯等信號分子合成的關鍵酶類(Plant responses to water deficit,Brayl997, Trends in Plant Science, 2 :48_54) ； (2)蛋白憐酸酶，如蛋白質(zhì)憐酸酶 2A 和 2C 等，它們參與 ABA 信號的傳遞(Disruption of a guard cell-expressedproteinphosphatase 2A regulatory subunit，RCNI, confers absci sicacidinsensitivityin Arabidopsis, Kwak 等 2002，Plant Cell，14 :2849_2861 ；TheArabidopsis ABSCISICACID-INSENSITIVE2(ABI2)and ABI lgenes encode homologousprotein phosphatases2C involved in abscisic acid aignal transduction， Leung等 1997，Plant Cell，9 :759_771 ;The ABIl and ABI2 protein phosphatase 2C act ina negative feedbackregulatory loop of the abscisi c acid signalling pathway,Merlot 等 2001， PlantJ，25 :295_303 ;Mutational analysis of protein phosphatase2C involved inabscisic acid signal transduction in higher plants， Sheen 1998，Proc Natl AcadSci USA，95 :975_980)。(4)蛋白磷酸激酶，植物蛋白激酶家族非常，主要包括分裂素激活蛋白激酶(MAPK) (Abscisic a ci d induces mitogen-activatedprotein kinaseactivation in barley aleurone protoplasts， Knetsch 等 1996，Plant Cell，8 :1061_1067)，f丐依賴的蛋白激酶(CDPK) (An abscisic acid-activatedandcalciumindependent protein kinasa from guard cells of fava bean,Li 等1996， Plant Cell，8 :2359_2368;CDPK-mediated signaling pathways:specificityandcross-talk，Sauer 等 2004，J Exp Bot，55 :181-188 ;Ca2+dependent protein kinaseandstress signal transduction in plant，Sheen 1996，Science，274 :1900-1902)和鹿糖非發(fā)酵相關蛋白激酶(SnRK) ο (3)轉(zhuǎn)錄因子(The Arabidopsis homeobox geneAtHB-7is induced by water deficit and by abscisic acid， Soderman 等 1996， Plant J，10:375-381)，如 DREB (Wang 等 2008， Plant Mol Bio，67 :589_602 ;Stress_inducibleDREB2A transcription factor from Pennisetum glaucum is aphosphoprotein and itsphosphorylation negatively regulates its DNA-bindingactivity， Agarwal 等 2007，Mol Genet Genomics，277 :189-198 ;GmDREB2，a soybeanDRE-binding transcriptionfactor, conferred drought and high-salt tolerance intransgenic plants，Chen 等2007， Biochem Biophys Res Commun，353 :299_305 ;Identification of cold-inducibledownstream genes of the ArabidopsisDREBlA/CBF3transcript ional factor us ingtwo micro-array systems，Maruyama 等 2004，Plant J，38 :982_993 ;0sDREB genes inrice, Oryza sativa L.，encodetranscription activators that function in drought~, high-salt-andcold-responsive gene expression, Dubouzet 等 2003，Plant J，33 :751_763)， NF-YB1 (Plant nuclear factor Y(NF-Y)B subunits confer droughttolerance and lead toimproved corn yields on water limited acres， Nelson 等2007,Proc Natl Acad SciUSA, 104 16450-16455),HD-ATART (Activated expression ofan ArabidopsisHD—START protein confers drought tolerance with improved rootsystem andreduced stomatal density, Yu 等 2008， Plant Cell，20 :1134_1151)， OsNACl(Overexpressing a NAMj ATAFj and CUC (NAC) transcription factor enhancesdroughtresistance and salt tolerance in rice，Hu等2006，Proc Natl Acad SciUSA，10 :71_82)
坐寸οNAC (NAM, ATAF和⑶C)轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子超家族之一。該類轉(zhuǎn)錄因子N端為高度保守的DNA結合結構域，而其C端為變異非常大的轉(zhuǎn)錄激活結構域(Comprehensive analysis of NAC family genes in Oryza sativaand Arabidopsisthaliana, Ooka 等 2003，DNA Res，10 :239_247)。目前，在模式植物擬南芥和水稻中發(fā)現(xiàn)了 100多個家族成員(Systematic sequence analysisand identification oftissue—specific or stress-responsive genes of NACtranscription factor familyin rice，F(xiàn)ang等2008，Mol Genet Genomics，280 :547_563 ;Comprehensive analysisof NAC fami Iy genes in Oryza sativaand Arabidopsisthaliana， Ooka 等 2003， DNA Res，10 :239_247 ；Transcription factor families inArabidopsis:majorprogress and outstanding issues for future research， Qu 等2006, Curr Opin PlantBiol，9 :544_549)。許多證據(jù)表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長發(fā)育過程中起著重要作用，如胚胎、花、次生壁形成，葉片衰老，根系生長等(The no apicalmeristem geneof Petunia is required for pattern format ion in embryos andflowers and isexpressed at meristem and primordia boundaries， Souer 等 1996，Cell，85 :159_170 ；NAC transcription factors NSTland NST3 regulate pod shatteringin a partiallyredundant manner by promoting secondary wall formation afterthe establishmentof tissue identity, Mitsuda 等 2008，Plant J, 56 :768_778 ； SNDlj a NAC domaintranscription factor,is a key regulator of secondary wallsynthesis in fibersof Arabidopsis，Zhong等2006，Plant Cell，18 :3158_3170 ;Two NACdomaintranscription factors, SNDland NSTlj function redundantly in regulationofsecondary wall synthesis in fibers of Arabidopsis， Zhong 等 2007， Planta，225，1603-1611 ;AtNAP，a NAC family transcription factor, has an important role inleafsenescence，Guo 等 2006，Plant J,46 :601_612 ；The Arabidopsis NACtranscriptionfactor VNI2 integrates abscisic acid signals into leafsenescence via the COR/RD genes，Yang 等 2011，Plant Cell，23 :2155_2168 ;SoybeanNAC transcription factorspromote abiotic stress tolerance and lateral rootformation in transgenicplants，Hao 等 2011，Plant J, 68 :302_313 ；AtNAC2,atranscription factor downstreamof ethylene and auxin signaling pathways, isinvolved in salt stress response andlateral root development，He 等 2005，Plant J，44 :903_916 ;TaNAC2，a NAC-type wheattranscription factor conferringenhanced multiple abiotic stress tolerances inArabidopsis，Mao等2012，J ExpBot，63 :2933_2946 ;Arabidopsis NACl transduces auxinsignal downstream of TIRlto promote lateral root development, Xie 等 2000，GenesDev,14 3024-3036)o近期，越來越多的證據(jù)表明，NAC轉(zhuǎn)錄因子參與對各種逆境和非生物逆境脅迫的應答，包括病害、干旱、高鹽、冷害、缺氧等。在擬南芥中，人們發(fā)現(xiàn)ANAC019，ANAC055和ANAC072能夠與ERDl基因的上游啟動子結合，從而增強擬南芥的抗旱性(Isolationandfunctional analysis of Arabidopsis stress—inducible NAC transcriptionfactorsthat bind to a drought-responsive cis—element in the early responsivetodehydration stress lpromoter，Tran 等 2004，Plant Cell，16 :2481_2498)。AtAFl，AtAF2以及大麥中的同源基因HvNAC6在抗旱和抗病反應過程中具有負效應(The transcriptionfactor ATAF2 represses the expression ofpathogenesis-related genes inArabidopsis，Delessert 等 2005，Plant J, 43 :745_757 ；The HvNAC6transcriptionfactor:a positive regulator of penetrationresistance in barley andArabidopsis， Jensen 等 2007， Plan tMolBiol，65 :137_150 ;A novel drought-induciblegene,ATAFlj encodes a NAC family protein thatnegatively regulates the expressionof stress-responsive genes in Arabidopsis， Lu 等 2007， Plant Mol Biol,63 289-305) o在水稻中，過量表達SNACl/OsNACl能增強水稻的抗旱性(Overexpressinga NAMj ATAFj and CUC(NAC)transcriptionfactor enhances drought resistance andsalt tolerance in rice，Hu 等 2006，Proc Natl Acad SciU USA，103 :12987-12992)，而過量表達SNAC2/0sNAC6，0sNAC5，0sNAC045，0sNAC063轉(zhuǎn)基因植物對多種非生物逆境的抗性(Characterization oftranscription factor gene SNAC2 conferring coldand salt tolerance in rice，Hu 等 2008，Plant Mol Biol，67 :169_181 ;Functionalanalysis of a NAC-typetranscription factor 0sNAC6 involved in abiotic andbiotic stress-responsivegene expression in rice， Nakashima 等 2007， Plant J，51:617_630 ；The abioticstress-responsive NAC-type transcription factor 0sNAC5regulatesstress-inducible genes and stress tolerance in rice， Takasaki 等 2010，
Mol GenetGenomics, 284 173, 183 ；Tolerance to various environmental stressesconferredby the salt-responsive rice gene 0NAC063 in transgenic Arabidopsis，Yokotani 等 2009，Planta，229 :1065-1075 ;0verexpression of a NAC transcriptionfactorenhances rice drought and salt tolerance， Zheng 等 2009， Biochem BiophysResCommun，379 :985_989)。過量表達大豆的NAC基因GmNAC20能增強擬南芥的耐鹽性和耐冷性(Soybean NAC transcription factors promote abiotic stress toleranceandlateral root formation in transgenic plants， Hao 等，2011， Plant J，68 :302_313)。研究人員在小麥中發(fā)現(xiàn)TaGRABl和TaGRAB2能與顆粒病毒RepA蛋白結合，從而抑制病毒的復制(GRAB proteins, novel members of the NAC domainfamily, isolated bytheir interaction with a geminivirus protein， Xie 等 1999， PlantMol Biol,39 647-656)。Xia等(2010)發(fā)現(xiàn)，TaNAC4和TaNAC8參與對多種生物和非生物逆境的脅迫反應(Characterization of a novel wheat NAC transcriptionfactor gene involved indefense response against stripe rust pathogen infectionand abiotic stresses，Xia等2010，Mol Biol Rep，37，3703-3712 ;TaNAC8，a novelNAC transcription factor genein wheat, responds to stripe rust pathogeninfection and abiotic stresses,Xia等 2010，Physiol Mol Plant Pathol，74，394-402)。過量表達 TaNAC2 和 TaNAC69 能增強植物對多種逆境的抗性(TaNAC2，aNAC-type wheat transcription factor conferringenhanced multiple abioticstress tolerances in Arabidopsis，Mao等2012，J Exp Bot，63 :2933_2946 ；Overexpression of TaNAC69 leads to enhanced transcript levels ofstressup-regulated genes and dehydration tolerance in bread wheat， Xue 等 2011，MolPlant，4 :697_712)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種植物抗逆相關蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的植物抗逆相關蛋白，來源于普通小麥(Triticum aestivum L.),為如下(a)或(b)所示的蛋白(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗逆相關的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。為了使(a)中的蛋白便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的N端或C端連接上如表I所示的標簽。表I.標簽的序列
標簽殘基序列
Poly-Arg5-6 (通常為 5 個) RRRRR
Poly-His2-10(通常為 6 個)~HHHHHH
FLAG8DYKDDDDK
Strep-tag II 8WSHPQFEK
c-myc10EQKLISEEDL上述(a)或(b)中的蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得至IJ。上述(b)中的蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列I的自5'端第93至986位堿基所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表I所示的標簽的編碼序列得到。上述蛋白的氨基酸序列中一個或幾個氨基酸殘基的取代、替換和/或添加，有的是由于自然發(fā)生的多態(tài)變異引起的，例如由獲得蛋白質(zhì)的生物的物種、個體等的差異導致；有的是由定點誘變、隨機誘變等人工誘變處理弓I起。本發(fā)明所提供的編碼基因為如下1)、2)、3)或4)的基因I)其核苷酸序列是序列表中序列I的自5 ^末端第93-986位脫氧核糖核苷酸所示的DNA分子；2)其核苷酸序列是序列表中序列I所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述抗逆相關蛋白的DNA分子;4)與I)或2)限定的DNA序列有90%以上同源性且編碼所述抗逆相關蛋白的DNA分子。上述嚴格條件是，在6XSSC，0. 5%SDS的溶液中，在65° C下雜交，然后用2X SSC，
O.1%SDS 和 I X SSC, O. 1%SDS 各洗膜一次。序列表中序列I由1098個脫氧核糖核苷酸組成，包括92bp的5' UTR、894bp的ORF區(qū)、112bp的3 ' UTR ;該基因的開放閱讀框為894bp (序列表中序列I的自5 '端第93-986位核苷酸)，編碼297個氨基酸(序列表中序列2所示)。
含有上述任一所述編碼基因的重組表達載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞系或表達盒也屬于本發(fā)明的保護范圍?？捎矛F(xiàn)有的植物表達載體構建含有本發(fā)明基因的重組表達載體。本發(fā)明的另一個目的是提供一種培育抗逆植物的方法。本發(fā)明所提供的培育抗逆植物的方法，是將上述任一所述的編碼基因?qū)肽康闹参镏校嘤玫娇鼓嬷参?。可以采用常?guī)方法將所述編碼基因?qū)肽康闹参镏?，例如基因槍法，高壓電穿孔法，脂質(zhì)體法，菌轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染等。本發(fā)明中的具體操作是，先將基因?qū)胼d體中，得到重組表達載體，再將重組表達載體導入農(nóng)桿菌中，得到含有本發(fā)明基因的重組農(nóng)桿菌，再通過農(nóng)桿菌將基因?qū)肽康闹参镏小?
上述抗逆植物是抗干旱和/或抗高鹽/耐低溫的植物。本發(fā)明方法對單子葉植物或雙子葉植物均可以，單子葉植物具體可為小麥，雙子葉植物具體可為擬南芥。實驗證明，將本發(fā)明基因?qū)胫参镏?，可以促進轉(zhuǎn)基因植物根系的生長。提高了植物的抗逆性，如抗旱性和/或抗鹽性和/或耐冷性。在干旱條件下，轉(zhuǎn)入本發(fā)明基因的植物的存活率為30-60%，而未轉(zhuǎn)入本發(fā)明基因的野生型和轉(zhuǎn)入空載體的對照植物的存活率只有5-8% ;在高鹽脅迫條件下，植物的存活率可達35-65%，而未轉(zhuǎn)入本發(fā)明基因的野生型植物的存活率只有25% ;在冷凍脅迫條件下，植物的存活率可達18-38%，而未轉(zhuǎn)入本發(fā)明基因的野生型植物和空載體對照的存活率僅有8-13%。同時本發(fā)明基因?qū)巫尤~、雙子葉植物均適用。因此，本發(fā)明基因及其應用對培育抗旱節(jié)水、抗鹽、耐冷農(nóng)作物新品種具有重要的意義，適合于推廣應用。


圖I為TaNAC67與來自不同植物NAC成員序列間的差異。圖2為TaNAC67受水分脅迫、高鹽、低溫和ABA處理后的表達情況。圖3為不同擬南芥株系中TaNAC67的相對表達量。圖4為轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱、耐鹽和耐凍性鑒定結果。
具體實施例方式下述實施例中的實驗方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。下述實施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實施例I、小麥中抗逆相關蛋白的編碼基因TaNAC67的分離一、抗逆相關蛋白的編碼基因TaNAC67的分離I、構建小麥的全長cDNA文庫,按照文獻(用改進的Cap-trapper法構建擬斯卑爾脫山羊草全長cDNA文庫，毛新國等2005，遺傳學報，32 (8) :811_817)中所述方法進行，具體如下所述
(I)總RNA提取及mRNA純化，用TRIZOL提取小麥(偃展I號，國家作物種質(zhì)庫)不同組織器官總RNA，用oligo (dT)纖維素分離純化mRNA。(2)第一鏈cDNA的合成取IOug mRNA與引物I (表I)混合，變性后加入第一鏈cDNA合成的試劑，當溫度升到40°C時,加入反轉(zhuǎn)錄酶，當反應進行到40分鐘時加入引物II(第一鏈合成引物如表2所示)。為得到更多全長cDNA，在第一鏈合成時向反應體系中加入海藻糖和山犁糖醇；為限制poly(A)尾巴的長度，以便于大規(guī)模測序，用混合引物替代傳統(tǒng)的單一引物oligo (dT) 18。反應結束后用CTAB-UREA法除去糖類，沉淀cDNA/RNA。表2.第一鏈cDNA合成引物
權利要求
1.一種蛋白，選自如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)； (b)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗逆相關的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權利要求I所述蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權利要求2所述的編碼基因，其特征在于所述編碼基因為如下I)或2)或3)或4)的基因 1)其核苷酸序列是序列表中序列I的自5^末端第93-986位脫氧核糖核苷酸所示的DNA分子； 2)其核苷酸序列是序列表中序列I所示的DNA分子； 3)在嚴格條件下與I)或2)限定的DNA序列雜交且編碼所述抗逆相關蛋白的DNA分子; 4)與I)或2)限定的DNA序列有94%以上同源性且編碼所述抗逆相關蛋白的DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述編碼基因的重組表達載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞系或表達盒。
5.權利要求I所述的蛋白在培育抗逆性提高的植物中的應用。
6.根據(jù)權利要求5所述的應用，其特征在于所述抗逆植物是抗干旱和/或耐鹽和/或耐冷的植物。
7.一種培育抗逆植物的方法，是將權利要求2或3所述的編碼基因?qū)肽康闹参镏?，培育得到抗逆植物?br> 8.根據(jù)權利要求5所述的方法，其特征在于所述編碼基因是通過權利要求4所述的重組表達載體導入所述目的植物中的。
9.根據(jù)權利要求5或6所述的方法，其特征在于所述抗逆植物是抗干旱和/或耐鹽和/或耐冷的植物。
10.根據(jù)權利9所述的方法，其特征在于所述目的植物為小麥或擬南芥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種植物抗逆相關蛋白及其編碼基因與應用。本發(fā)明蛋白，選自如下(a)或(b)(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗逆相關的由(a)衍生的蛋白質(zhì)。實驗證明，將本發(fā)明基因?qū)胫参锛毎?，可提高植物的抗逆性，如抗旱?jié)水、抗鹽或耐寒，因此，本發(fā)明基因及其應用對培育抗旱節(jié)水、抗鹽或耐寒新品種具有重要的現(xiàn)實意義。
文檔編號C12N15/82GK102924582SQ20121047788
公開日2013年2月13日 申請日期2012年11月22日 優(yōu)先權日2012年11月22日
發(fā)明者毛新國, 景蕊蓮, 李昂 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所