專(zhuān)利名稱(chēng)：蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體nd1基因全序列擴(kuò)增引物及其設(shè)計(jì)和擴(kuò)增方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于魚(yú)類(lèi)線粒體基因組研究領(lǐng)域，具體涉及一種高效擴(kuò)增多種蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體NADH還原酶復(fù)合體亞基I (NADH dehydrogenase subunits I ;ND1)基因全序列擴(kuò)增引物及其設(shè)計(jì)和擴(kuò)增方法。
背景技術(shù)：
魚(yú)類(lèi)線粒體基因組由13個(gè)編碼蛋白質(zhì)基因、22個(gè)tRNA基因、2個(gè)rRNA基因(12SrRNA及16S rRNA)共37個(gè)編碼基因及一段主要的非編碼區(qū)(控制區(qū))組成，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、拷貝數(shù)多、嚴(yán)格的母系遺傳、幾乎不發(fā)生重組、編碼效率高、進(jìn)化速度快且不同區(qū)域進(jìn)化速度存在差異等特點(diǎn)。由于魚(yú)類(lèi)線粒體基因組所具有的這些特點(diǎn)，使其成為魚(yú)類(lèi)分子群體遺傳學(xué)、系統(tǒng)發(fā)生學(xué)及保護(hù)生物學(xué)等研究領(lǐng)域的重要分子標(biāo)記。蝦虎魚(yú)類(lèi)隸屬于鱸形目、蝦虎魚(yú)亞目，是世界上種類(lèi)最多，分布最廣的魚(yú)類(lèi)類(lèi)群之一。全世界的蝦虎魚(yú)種類(lèi)估計(jì)有2000多種，它們形成一個(gè)龐大的生物類(lèi)群，在水環(huán)境尤其是海洋生態(tài)環(huán)境中占有重要的地位。蝦虎魚(yú)多為肉食性的小型魚(yú)類(lèi)，遍布全世界，尤以熱帶為多，主要為海水魚(yú)，大部分營(yíng)底棲生活，主要特征是其腹鰭愈合成一吸盤(pán)狀。近年來(lái)，由于過(guò)度捕撈、氣候環(huán)境變化等原因，許多傳統(tǒng)的經(jīng)濟(jì)魚(yú)種資源已經(jīng)形不成漁訊，有些甚至枯竭，但蝦虎魚(yú)類(lèi)因其適應(yīng)能力強(qiáng)、生命周期短、繁殖力強(qiáng)等原因，資源量卻逐年增加。由于蝦虎魚(yú)類(lèi)經(jīng)濟(jì)價(jià)值不高，國(guó)內(nèi)外有關(guān)于蝦虎魚(yú)類(lèi)的研究相對(duì)較少，因其種類(lèi)繁多，外部形態(tài)特征極為相似，導(dǎo)致不易鑒別和認(rèn)定。目前，蝦虎魚(yú)類(lèi)的分類(lèi)還不甚清晰，很多種類(lèi)的分類(lèi)地位還比較混亂。

線粒體全基因組及線粒體基因組上的相關(guān)基因作為分子標(biāo)記已被廣泛地用于魚(yú)類(lèi)的群體遺傳學(xué)、系統(tǒng)發(fā)生學(xué)及保護(hù)生物學(xué)等研究領(lǐng)域。NDl作為脊椎動(dòng)物線粒體蛋白質(zhì)編碼基因中7個(gè)編碼NADH還原酶復(fù)合體亞基的基因之一，其進(jìn)化上較為保守，可應(yīng)用于動(dòng)物的系統(tǒng)進(jìn)化和分類(lèi)研究。然而未曾有報(bào)道過(guò)擴(kuò)增線粒體NDl基因全序列的通用引物，尤其是針對(duì)物種分布廣泛、種類(lèi)眾多的蝦虎魚(yú)類(lèi)。因此設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體NDl基因全序列的通用引物，從而為高效獲得蝦虎魚(yú)線粒體NDl基因全序列及線粒體基因組全序列奠定基礎(chǔ)。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)存在的空缺，本發(fā)明旨在提供一對(duì)可高效特異擴(kuò)增多種蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體NDl基因全序列的核苷酸引物，從而為快速有效獲取蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體NDl基因全序列以進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化和分類(lèi)研究提供一個(gè)有力工具。本發(fā)明的目的還在于提供所述蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體NDl基因全序列擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)方法，以及利用所述的蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體NDl基因全序列擴(kuò)增引物對(duì)蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體NDl基因全序列進(jìn)行擴(kuò)增的方法。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，發(fā)明人提供如下技術(shù)方案:蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體NDl基因全序列擴(kuò)增引物，由兩條單鏈寡核苷酸鏈組成，其中輕鏈引物為SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；重鏈引物為SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。本發(fā)明的輕鏈引物Gobies-NDl-F (SEQ ID N0.1所示)有19個(gè)堿基:CGGAGAAATCCAGGTCAGT，位于 16S rRNA 基因上；重鏈引物 Gobies-NDl-R (SEQ ID N0.2 所示)有 19 個(gè)堿基:CCAACATGTTTGGGGTATG，位于 tRNA_Met 基因上。本發(fā)明所述的蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體NDl基因全序列擴(kuò)增引物對(duì)在東海海域采集的15種蝦虎魚(yú)類(lèi)，均能獲得片段長(zhǎng)度為1300 bp左右的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序及與GenBank中同源序列的比較，確認(rèn)為包含線粒體NDl基因全序列、tRNA-Val基因全序列、tRNA-1le基因全序列、tRNA-Gln基因全序列及長(zhǎng)度為115 bp左右的16S rRNA基因3’端部分序列的擴(kuò)增產(chǎn)物，體現(xiàn)出本發(fā)明較廣的擴(kuò)增范圍與較強(qiáng)的擴(kuò)增能力，從而為快速有效獲取蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒NDl基因全序列以進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化及分類(lèi)研究提供一個(gè)有力工具。作為優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明所述的蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體NDl基因全序列擴(kuò)增引物，其中所述的蝦虎魚(yú)類(lèi)包括但不限于下述:中華烏塘鱧、青彈涂魚(yú)、斑紋舌蝦虎魚(yú)、髭縞蝦虎魚(yú)、孔蝦虎魚(yú)、綠斑細(xì)棘蝦虎魚(yú)、紅狼牙蝦虎魚(yú)、普氏細(xì)棘蝦虎魚(yú)、斑尾刺蝦虎魚(yú)、大彈涂魚(yú)、舟山韁蝦虎魚(yú)、平頭竿蝦虎魚(yú)、矛尾刺蝦虎魚(yú)、雙帶縞蝦虎魚(yú)、犬齒背眼蝦虎魚(yú)。本發(fā)明還提供了上述蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體NDl基因全序列擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)方法，即登錄NCBI網(wǎng)站中的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)搜索已公布的其他物種的蝦虎魚(yú)類(lèi)及近緣?mèng)~類(lèi)物種的線粒體基因組的16S rRNA基因和tRNA_Met基因序列，經(jīng)同源性比較，找到保守序列，并利用Premier Primer5.0軟件設(shè)計(jì)出奸虎魚(yú)類(lèi)線粒體NDl基因全序列擴(kuò)增引物。所用的Premier Primer5.0軟件在生物軟件網(wǎng)http://www.bio-soft,net/下載。本發(fā)明還提供了一種對(duì)蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體NDl基因全序列進(jìn)行擴(kuò)增的方法，包括采用上述的蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體NDl基因全序列擴(kuò)增引物對(duì)待測(cè)樣品的DNA模板溶液進(jìn)行PCR擴(kuò)
士 M`
>曰ο作為優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明所述的一種對(duì)蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體NDl基因全序列進(jìn)行擴(kuò)增的方法，其中PCR擴(kuò)增的條件為:95°C預(yù)變性5min，然后95°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin30s，共35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5min。作為優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明所述的一種對(duì)蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體NDl基因進(jìn)行擴(kuò)增的方法，其中PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系組成為:PCR反應(yīng)體系為25μ ，內(nèi)含dNTP (2.5mM) 2PL、10XTaqDNA聚合酶Buffer 2.5μ 、ΙΟμΜ的輕鏈引物和重鏈引物各 μ 、Taq DNA聚合酶(5U/ul)
0.2μ 、含 IOOng 的 DNA 模板溶液 WL 及 ddH20 17.3μ 。作為優(yōu)選，根據(jù)本發(fā)明所述的一種對(duì)蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體NDl基因進(jìn)行擴(kuò)增的方法，其中所述的蝦虎魚(yú)類(lèi)包括但不限于下述:中華烏塘鱧、青彈涂魚(yú)、斑紋舌蝦虎魚(yú)、髭縞蝦虎魚(yú)、孔蝦虎魚(yú)、綠斑細(xì)棘蝦虎魚(yú)、紅狼牙蝦虎魚(yú)、普氏細(xì)棘蝦虎魚(yú)、斑尾刺蝦虎魚(yú)、大彈涂魚(yú)、舟山韁蝦虎魚(yú)、平頭竿蝦虎魚(yú)、矛尾刺蝦虎魚(yú)、雙帶縞蝦虎魚(yú)、犬齒背眼蝦虎魚(yú)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
本發(fā)明提供的蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體NDl基因全序列擴(kuò)增引物，可以高效特異性地?cái)U(kuò)增多種蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體NDl基因全序列，而不是僅僅擴(kuò)增NDl的部分片段序列，能應(yīng)用于蝦虎類(lèi)不同分類(lèi)階元系統(tǒng)進(jìn)化和分類(lèi)研究。同時(shí)本發(fā)明所述通用引物及其設(shè)計(jì)方法也可作為通用引物PCR擴(kuò)增原理及關(guān)鍵參數(shù)研究的具體實(shí)例，促進(jìn)本發(fā)明所涉及領(lǐng)域的前進(jìn)發(fā)展，因而具備重要發(fā)明價(jià)值和理論意義。


圖1為本發(fā)明蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體NDl基因全序列擴(kuò)增引物用以擴(kuò)增不同蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體ND I基因全序列的電泳圖譜。其中M =DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000)，1-15依次為:中華烏塘鱧、青彈涂魚(yú)、斑紋舌蝦虎魚(yú)、髭縞蝦虎魚(yú)、孔蝦虎魚(yú)、綠斑細(xì)棘蝦虎魚(yú)、紅狼牙蝦虎魚(yú)、普氏細(xì)棘蝦虎魚(yú)、斑尾刺蝦虎魚(yú)、大彈涂魚(yú)、舟山韁蝦虎魚(yú)、平頭竿蝦虎魚(yú)、矛尾刺蝦虎魚(yú)、雙帶縞蝦虎魚(yú)、犬齒背眼蝦虎魚(yú)。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)附圖，更具體地說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容。應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的實(shí)施并不局限于下面的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護(hù)范圍。在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量單位，所有的設(shè)備和原料等均可從市場(chǎng)購(gòu)得或是本行業(yè) 常用的。若無(wú)特別指明，實(shí)施例采用的方法為本領(lǐng)域通用技術(shù)。主要材料、試劑和儀器設(shè)備:
軟件及序列資源:Premier Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件(下載自生物軟件網(wǎng)http://www.bio-soft, net/),奸虎魚(yú)類(lèi)線粒體基因組序列資源(下載自NCBI中Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)http: //www.ncb1.nlm.nih.gov/),序列分析軟件MEGA5.0(下載自生物軟件網(wǎng) http: //www.bio-soft, net/)。PCR擴(kuò)增檢測(cè)相關(guān)試劑儀器:海洋動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒(TIANGEN，北京)，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TIANGEN，北京)，常規(guī)臺(tái)式離心機(jī)(Thermo)，Bio-Rad C1000TMThermal CycIer擴(kuò)增儀器(Bio-Rad，美國(guó))，微量移液器(Eenppdorf，德國(guó))，96孔PCR板(Axygen)，dNTP (TIANGEN，北京)，IOXTaq DNA 聚合酶 Buffer (TIANGEN，北京)，Taq DNA 聚合酶(TIANGEN，北京)，滅菌雙蒸水，DL2000 DNA marker (TIANGEN,北京)，瓊脂糖(Biowest，香港)，電泳儀(DYY-6C型，北京六一)，凝膠成像儀(Bio-Rad⑶2000，美國(guó))?？寺y(cè)序相關(guān)試劑儀器:高壓蒸氣滅菌鍋(SANYO，日本)，加氨芐(Amp)抗生素的滅菌LB培養(yǎng)基，LB固體培養(yǎng)平皿(上海生工)，超凈工作臺(tái)(SW — CJ一IG型，名牌之星，中國(guó))，恒溫水浴鍋(上海精宏)，DH5a感受態(tài)細(xì)胞(TIANGEN)，Amp抗生素(上海生工)，5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷(上海生工)，異丙基硫代-β -D-半乳糖苷(上海生工)，pGEM-T載體(Promega，美國(guó))，恒溫培養(yǎng)箱(PH070A型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，恒溫振蕩搖床(培英，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠)自動(dòng)DNA測(cè)序儀(ABI 3730型，美國(guó))。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，是按照常規(guī)條件，例如Sambrook等作者的分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商說(shuō)明書(shū)建議的條件。實(shí)施例11、蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體NDl基因全序列擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)和合成:登錄NCBI網(wǎng)站中的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)搜索已測(cè)定的其他物種的蝦虎魚(yú)類(lèi)及近緣?mèng)~類(lèi)物種的線粒體基因組的16S rRNA基因和tRNA-Met基因序列，將序列載入到分析軟件MEGA5.0中，利用ClustalW算法進(jìn)行多序列對(duì)位比對(duì)分析，找到保守序列，將所找到的保守序列載入到Premier Primer5.0軟件在手動(dòng)設(shè)計(jì)模式下(即在manual選項(xiàng)下選擇Low,具體參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置)設(shè)計(jì)出蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體NDl基因全序列擴(kuò)增引物:其中輕鏈引物Gobies-NDl-F(SEQ ID N0.1所示)有19個(gè)堿基:CGGAGAAATCCAGGTCAGT，位于16S rRNA基因上；重鏈引物Gobies-NDl-R (SEQ ID N0.2 所示)有 19 個(gè)堿基:CCAACATGTTTGGGGTATG，位于 tRNA-Met 基因上。由南京金斯瑞生物科技有限公司根據(jù)發(fā)明人的要求合成符合SEQ ID N0.1和SEQID N0.1所示核苷酸序列的引物。2、對(duì)蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體NDl基因進(jìn)行擴(kuò)增
本發(fā)明中的15個(gè)待測(cè)樣本均采集于我國(guó)的東海海域。其中擴(kuò)增的蝦虎魚(yú)類(lèi)為以下種類(lèi):中華烏塘鱧、青彈涂魚(yú)、斑紋舌蝦虎魚(yú)、髭縞蝦虎魚(yú)、孔蝦虎魚(yú)、綠斑細(xì)棘蝦虎魚(yú)、紅狼牙蝦虎魚(yú)、普氏細(xì)棘蝦虎魚(yú)、斑尾刺蝦虎魚(yú)、大彈涂魚(yú)、舟山韁蝦虎魚(yú)、平頭竿蝦虎魚(yú)、矛尾刺蝦虎魚(yú)、雙帶縞蝦虎魚(yú)、犬齒背眼蝦虎魚(yú)。利用海洋動(dòng)物基因組DNA提取試劑盒提取待測(cè)樣本的基因組DNA，方法按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，瓊脂糖電泳檢測(cè)提取的基因組DNA。用于擴(kuò)增多種蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體NDl基因全序列的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如下:PCR 反應(yīng)體系為 25μ ，內(nèi)含 dNTP (TIANGEN), IOXTaqDNA 聚合酶 Buffer (TIANGEN), ΙΟμΜ的輕鏈引物Gobies-NDl-F和 ΙΟμΜ的重鏈引物Gobies- NDl_R，Taq DNA 聚合酶(TIANGEN)，含IOOng的上述提取的基因組DNA模板溶液，ddH20，其中:
10 X TaqDNA 聚合酶 Buffer 2.5μdNTP2μ
Gobies- NDl-F μ
Gobies- NDl-R μ
Template DNAIM-L
ddH2017.3μ
Taq DNA 聚合酶0.2μ 。 擴(kuò)增反應(yīng)在Bio-Rad C1000 Thermal Cycler儀器上進(jìn)行，擴(kuò)增條件為:95°C預(yù)變性5min，然后95°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin30s，共35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其大小和純度。不同蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體NDl基因全序列擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳圖譜見(jiàn)圖1。運(yùn)用設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增多數(shù)蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒NDl基因全序列，均獲得了單一的目的片段，產(chǎn)物大小約為1300 bp，并對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物直接進(jìn)行測(cè)序，其步驟為:PCR擴(kuò)增產(chǎn)物初步定量后，濃度達(dá)到約lOOng/μΙ的樣品，寄送南京金斯瑞生物科技有限公司，委托其進(jìn)行雙向測(cè)序，測(cè)序引物為Gobies- NDl-F (ΙΟμΜ)和Gobies- NDl-R (ΙΟμΜ)。經(jīng)測(cè)序及與GenBank中的同源序列進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)為包含線粒體NDl基因全序列、tRNA-Val基因全序列、tRNA-1le基因全序列、tRNA-Gln基因全序列及長(zhǎng)度為115 bp左右的16S rRNA基因3’端部分序列的擴(kuò)增產(chǎn)物。
另外，運(yùn)用設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增普氏細(xì)棘蝦虎魚(yú)和青彈涂魚(yú)線粒體NDl基因，均獲得了單一的目的片段，產(chǎn)物大小約為1300 bp，并使用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TIANGEN，上海)對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化，純化產(chǎn)物與pGEM-T載體(Promega公司，美國(guó))連接，轉(zhuǎn)化，鑒定陽(yáng)性克隆并測(cè)序。其步驟為:經(jīng)膠回收純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在T4 DNA連接酶的作用下與PGEM-T載體進(jìn)行連接反應(yīng)。連接反應(yīng)體系為載體 μ ，T4 DNA連接酶 μ ，連接Buffer 5ul，PCR純化產(chǎn)物3μ1。連接反應(yīng)于冰上操作，反應(yīng)液置于4°C冰箱連接過(guò)夜(至少12小時(shí))。取DH5a感受態(tài)細(xì)胞(TIANGEN，北京)，熱激法進(jìn)行轉(zhuǎn)化，用含有氨芐抗生素(Amp)LB平板(使用前預(yù)先均勻涂布40ul 20mg/ml的5-溴-4-氯-3- Π引哚-β -D-半乳糖苷(X-Gal)和30ul 0.2mol/L的異丙基硫代-β -D-半乳糖苷(IPTG))進(jìn)行藍(lán)白篩選，并通過(guò)菌液PCR擴(kuò)增確認(rèn)挑取的陽(yáng)性克隆子。陽(yáng)性克隆子經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后的菌液寄送南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行雙向直接測(cè)序。測(cè)序引物為SP6/T7。序列分析儀為ABI 3730全自動(dòng)DNA測(cè)序儀。經(jīng)測(cè)序及與GenBank中的同源序列進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)為包含線粒體NDl基因全序列、tRNA-Val基因全序列、tRNA-1le基因全序列、tRNA-Gln基因全序列及長(zhǎng)度為115bp左右的16S rRNA基因3’端部分序列的擴(kuò)增產(chǎn)物。實(shí)用性
本發(fā)明所述的蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體NDl基因全序列擴(kuò)增引物對(duì)在東海海域采集的15種海洋蝦虎魚(yú)類(lèi)的DNA模板溶液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，均能獲得片段在1300 bp左右的特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)測(cè)序及與GenBank中同源序列的比較，確認(rèn)為包含線粒體NDl基因全序列、tRNA-Val基因全序列、tRNA-1le基因全序列 、tRNA-Gln基因全序列及長(zhǎng)度為115 bp左右的16S rRNA基因3’端部分序列的擴(kuò)增產(chǎn)物，體現(xiàn)出本發(fā)明較廣的擴(kuò)增范圍與較強(qiáng)的擴(kuò)增能力，由于本發(fā)明所選用的15種蝦虎魚(yú)類(lèi)分別屬于蝦虎魚(yú)亞目下面不同科屬的物種，因此，本發(fā)明所述的蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體NDl基因全序列擴(kuò)增引物在蝦虎魚(yú)類(lèi)不同分類(lèi)階元系統(tǒng)進(jìn)化及分類(lèi)研究領(lǐng)域均可予以應(yīng)用。盡管發(fā)明人已經(jīng)對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做了較為詳細(xì)的闡述和列舉，應(yīng)當(dāng)理解，對(duì)于本領(lǐng)域一個(gè)熟練的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，對(duì)上述實(shí)施例作出修改和/或變通或者采用等同的替代方案是顯然的，都不能脫離本發(fā)明精神的實(shí)質(zhì)，本發(fā)明中出現(xiàn)的術(shù)語(yǔ)用于對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的闡述和理解，并不能構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。
權(quán)利要求
1.蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體NDl基因全序列擴(kuò)增引物，其特征是由兩條單鏈寡核苷酸鏈組成，其中輕鏈引物為SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；重鏈引物為SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體NDl基因全序列擴(kuò)增引物，其特征是所述的蝦虎魚(yú)類(lèi)包括中華烏塘鱧、青彈涂魚(yú)、斑紋舌蝦虎魚(yú)、髭縞蝦虎魚(yú)、孔蝦虎魚(yú)、綠斑細(xì)棘蝦虎魚(yú)、紅狼牙蝦虎魚(yú)、普氏細(xì)棘蝦虎魚(yú)、斑尾刺蝦虎魚(yú)、大彈涂魚(yú)、舟山韁蝦虎魚(yú)、平頭竿蝦虎魚(yú)、矛尾刺蝦虎魚(yú)、雙帶縞蝦虎魚(yú)、犬齒背眼蝦虎魚(yú)。
3.—種如權(quán)利要求1所述的蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體NDl基因全序列擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)方法，其特征是登錄NCBI網(wǎng)站中的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)搜索已測(cè)定的其他物種的蝦虎魚(yú)類(lèi)及近緣?mèng)~類(lèi)物種的線粒體基因組的16S rRNA基因和tRNA_Met基因序列，經(jīng)同源性比較，找到保守序列，并利用Premier Primer5.0軟件設(shè)計(jì)出奸虎魚(yú)類(lèi)線粒體NDl基因全序列擴(kuò)增引物。
4.一種對(duì)蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體NDl基因全序列擴(kuò)增的方法，其特征是采用如權(quán)利要求1所述的蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體NDl基因全序列擴(kuò)增引物對(duì)待測(cè)樣品的DNA模板溶液進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
5.如權(quán)利要求4所述的一種對(duì)蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體NDl基因全序列進(jìn)行擴(kuò)增的方法，其特征是PCR擴(kuò)增的條件為:95°C預(yù)變性5min，然后95°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸lmin30s，共35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5min。
6.如權(quán)利要求4所述的一種對(duì)蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體NDl基因全序列進(jìn)行擴(kuò)增的方法，其特征是PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系組成為:PCR反應(yīng)體系為25μ ，內(nèi)含2.5mM的dNTP 2PL、10XTaqDNA聚合酶Buffer 2.5μ 、ΙΟμΜ的輕鏈引物和重鏈引物各lPL、5U/ul的Taq DNA聚合酶0.2μ 、含 IOOng 的 DNA 模板溶液 WL 及 ddH20 17.3μ 。
7.如權(quán)利要求4所述 的一種對(duì)蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體NDl基因全序進(jìn)行擴(kuò)增的方法,其特征是所述的待測(cè)樣品來(lái)自中華烏塘鱧、青彈涂魚(yú)、斑紋舌蝦虎魚(yú)、髭縞蝦虎魚(yú)、孔蝦虎魚(yú)、綠斑細(xì)棘蝦虎魚(yú)、紅狼牙蝦虎魚(yú)、普氏細(xì)棘蝦虎魚(yú)、斑尾刺蝦虎魚(yú)、大彈涂魚(yú)、舟山韁蝦虎魚(yú)、平頭竿蝦虎魚(yú)、矛尾刺蝦虎魚(yú)、雙帶縞蝦虎魚(yú)、犬齒背眼蝦虎魚(yú)。
全文摘要
本發(fā)明屬于魚(yú)類(lèi)線粒體基因組研究領(lǐng)域，具體涉及一種蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體ND1基因全序列擴(kuò)增引物，由兩條單鏈寡核苷酸鏈組成，其中輕鏈引物為SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；重鏈引物為SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。本發(fā)明還提了該擴(kuò)增引物的設(shè)計(jì)方法和擴(kuò)增方法。本發(fā)明可高效特異性地?cái)U(kuò)增多種蝦虎魚(yú)類(lèi)線粒體ND1基因全序列，能應(yīng)用于蝦虎類(lèi)不同分類(lèi)階元系統(tǒng)進(jìn)化和分類(lèi)研究。
文檔編號(hào)C12N15/11GK103074336SQ20121048283
公開(kāi)日2013年5月1日 申請(qǐng)日期2012年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月22日
發(fā)明者徐田軍, 孫悅娜, 王日昕, 金逍逍 申請(qǐng)人:浙江海洋學(xué)院