一種用于檢測小鼠腺病毒的引物對、熒光定量pcr試劑盒及其應用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測小鼠腺病毒的引物對、熒光定量PCR試劑盒及其應用。所述引物對包括上游引物和下游引物，核苷酸序列為：上游引物：5’?TGAAGAAYCCYKSMGCTTTTCG?3’；下游引物：5’?RGGCAACACAGCCTCCAR?3’。本發(fā)明針對小鼠腺病毒的NC_012584.1Murine adenovirus 3pIIIa序列，設計了小鼠腺病毒特異性的引物對，利用該引物對結(jié)合熒光探針的熒光定量PCR檢測方法對小鼠腺病毒的檢測下限為4.5copies/μL DNA，大大提高了檢測靈敏性。
【專利說明】
-種用于檢測小鼠腺病毒的引物對、黃光定量PCR試劑盒及其 應用
技術(shù)領域
[0001] 本發(fā)明設及動物病毒檢驗檢疫技術(shù)領域，特別是設及一種用于檢測小鼠腺病毒的 引物對、巧光定量PCR試劑盒及其應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 自然感染實驗動物的病毒很多，根據(jù)對人類的危害性，可將其分為=類;一類為人 獸共患病病毒，能夠感染人與靈長類動物;二類目前尚無跡象表明感染人，但能在體外培養(yǎng) 的人、猿和猴源性細胞中進行復制，對人類有潛在危險性;=類病毒在自然條件下僅感染動 物本身，目前尚無跡象表明能夠感染人，因此對人類威脅不大。
[0003] 現(xiàn)今，小鼠作為單克隆抗體、蛋白類藥物等生物制品的一個主要來源，具有潛在的 病毒污染。在《中華人民共和國藥典(2010年版)》=部中，規(guī)定了鼠源性生物制品需質(zhì)檢的8 種鼠源病毒，其中小鼠腺病毒(Mouse Adenovirus,MAdV)屬于II類，目前尚無跡象表明感染 人，但能在體外培養(yǎng)的人、猿和猴源性細胞中進行復制，對人類有潛在危險性。鼠源性病毒 檢測標準的制定對客觀評價生物制品質(zhì)量，確保人民健康必將起到積極的作用。
[0004] 小鼠腺病毒是20世紀60年代從小鼠體內(nèi)分離出的一種雙鏈DNA病毒，為腺病毒科 哺乳動物腺病毒屬的成員。MAdV已被確定分類地位的株型有2個血清型：I型化株和n型K87 株。小鼠腺病毒感染常呈隱性，病毒侵入棟色脂肪、腎上腺、屯、肌和腎等處，對裸鼠致病性較 強，可W引起死亡。小鼠腺病毒也可損害人類屯、血管組織，被懷疑為人類屯、臟損害的一種病 原。
[0005] 藥典規(guī)定的鼠源病毒檢測方法有:細胞試驗、動物抗體產(chǎn)生實驗和雞胚感染實驗。 運些方法從生物效應角度來檢測鼠源病毒的潛在污染，檢測手段復雜費時，周期長，且對操 作的實驗室有一定要求，不宜作為一種常規(guī)的指導生產(chǎn)的質(zhì)控手段。
[0006] 目前小鼠腺病毒的檢測方法主要有病毒分離鑒定、血清學方法:免疫巧光（IFA)、 酶聯(lián)免疫吸附試驗化LISA)、酶免疫分析法化IA)等。傳統(tǒng)的檢測方法存在成本高、耗時長、 假陽性等問題。隨著分子生物學的快速發(fā)展，越來越多的分子檢測技術(shù)應用到腺病毒檢測 中。王吉等(王吉、付瑞、衛(wèi)禮等，小鼠腺病毒PCR檢測方法的建立及初步應用，實驗動物與比 較醫(yī)學，2014，：34( 1): 35-41)針對小鼠腺病毒建立PCR檢測法，檢測敏感性為1.67pg/iiL MAdV DM。姚新華等(姚新華、郭英飛，實時巧光定量PCR快速檢測腺病毒方法的建立與評 價，解放軍預防醫(yī)學雜志，2015,33(2):127-129)針對人腺病毒化xon基因建立巧光定量 I^qMan PCR檢測法，最低可檢測到lOcopies/化。
[0007] 而目前發(fā)展十分成熟的實時巧光定量PCR技術(shù)(Real Time PCR)檢測靈敏度高，簡 單方便，且對實驗室要求也很低。Real Time PCR于1996年由美國Applied biosystems公司 推出，是在PCR反應體系中加入巧光基團，利用巧光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通 過Ct值和標準曲線對樣品中的DNA(或cDNA)的起始濃度進行定量分析的方法。該方法自產(chǎn) 生W來，不斷發(fā)展完善，特別是隨著Taqman巧光探針的廣泛應用，到目前為止該技術(shù)已經(jīng)非 常成熟。Taqman巧光探針的PCR檢測是指進行PCR擴增時，在反應體系中加入一對引物的同 時還加入一個特異性的巧光探針，該探針為一寡核巧酸，兩端分別標記一個報告巧光基因 和一個澤滅巧光基團。當探針完整時，報告基因所發(fā)射的巧光信號被澤滅基因吸收，擴增時 隨著化q酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其5 '-3 '外切核酸酶活性將探針酶切降 解，報告巧光基團與澤滅巧光基團分離，從而巧光檢測系統(tǒng)可W監(jiān)測到巧光信號，模板每復 制一次，就有一個探針被切斷伴隨一個巧光信號的釋放。由于被釋放的巧光基團數(shù)目和PCR 產(chǎn)物數(shù)量是一對一關系，所W信號累積與PCR產(chǎn)物完全同步。整個反應結(jié)束后，便可得到一 條擴增曲線，由已知濃度標準樣品的擴增曲線可W得到一條標準曲線，根據(jù)該標準曲線W 及樣品中的擴增曲線可對樣品進行定量分析。
[0008] 實時巧光定量PCR技術(shù)不僅實現(xiàn)了對DNA/RNA模板的定量，而且具有靈敏度和特異 性高、能實現(xiàn)多重反應、自動化程度高、無污染、實時和準確等特點，該已被廣泛用于免疫分 析、細菌、病毒檢測等多個領域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供了一種小鼠腺病毒特異性的引物對，利用該引物對結(jié)合巧光探針可W 對小鼠腺病毒進行巧光定量PCR檢測，該檢測方法能特異、靈敏地檢測出小鼠腺病毒。
[0010] 引物對，包括上游引物和下游引物，核巧酸序列為：
[0011] 上游引物：5 ' -TGAAGAAYCCYKSMGCTTTTCG-3 ' ；
[0012] 下游引物:5' -RGGCAACACAGCCTCCAR-3'。
[0013] 該引物對是根據(jù)小鼠腺病毒的NC_012584. IMurine adenovirus化111日序列設計 的，擴增目的片段大小為74bp。該引物對的上下游引物序列具有一定的簡并性，序列中的Y 為C或T; K為G或T; S為C或G; M為A或C; R為A或G。
[0014] 本發(fā)明又提供了所述的引物對在制備檢測小鼠腺病毒試劑盒中的應用。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種用于檢測小鼠腺病毒的巧光定量PC時式劑盒，包含所述的引 物對。
[0016] 所述一種用于檢測小鼠腺病毒的巧光定量PCR試劑盒，其探針為：5'-R-ACCRTGGTTTACTAGACGMGAYGCMA-Q-3'，其中，5'端的R為巧光報告基團；3'端的Q為巧光澤滅 基團。探針的核巧酸序列具有一定的簡并性，其中核巧酸序列中的R為A或G;M為A或C;Y為C 或T。所述探針中巧光報告基團可選自FAM、J0E、皿X中的任意一種，優(yōu)選為FAM;所述巧光澤 滅基團選自TAMRA或Eclipse,優(yōu)選為TAMRA。
[0017]所述一種用于檢測小鼠腺病毒的巧光定量PC時式劑盒，包含陽性對照DNA。
[0018] 優(yōu)選的，所述陽性對照DNA為包含如SEQ ID No.4所示核巧酸序列的重組質(zhì)粒。該 核巧酸序列為使用本發(fā)明引物對擴增單一的小鼠腺病毒株所獲得的擴增產(chǎn)物，大小為 74bp〇
[0019] 優(yōu)選的，所述陽性對照DNA為包含如SEQ ID No.4所示核巧酸序列的重組PMD18-T 載體。PMD18-T載體為常用的商業(yè)化的克隆載體。
[0020] 本發(fā)明還提供了所述的巧光定量PC時式劑盒在檢測動物制品或動物實驗廢棄物中 小鼠腺病毒殘留中的應用。
[0021] 本發(fā)明還提供了一種檢測小鼠腺病毒的巧光定量PCR方法，W待檢測樣品的DNA為 模板，利用所述的引物對進行巧光定量PCR反應。
[0022] 所冰巧化吿量PCR的巧府化系為：
[0023]
[0024] 所述巧光定量PCR的反應條件為:50°C培育2min;95°C預變性10min;95°C變性15s， 60 °C退火Imin，共40個循環(huán)。
[00巧]本發(fā)明針對小鼠腺病毒的NC_012584. IMurine adenovirus化111日序列，設計了 小鼠腺病毒特異性的引物對，利用該引物對結(jié)合巧光探針的巧光定量PCR檢測方法對小鼠 腺病毒的檢測下限為4.5copies/]iL DNA，大大提局了檢測靈敏性。
【附圖說明】
[0026] 圖1為MAD-3引物對和探針特異性檢測擴增曲線圖；
[0027] 圖2為MAD-3引物對和探針擴增目的基因標準曲線圖；
[0028] 圖3為MAD-3引物對和探針標準曲線的擴增曲線圖；
[0029] 圖4為MD-3引物對和探針靈敏性檢測擴增曲線圖，擴增曲線從左到右依次為:4.5 X l〇7copies/]iL、4.5 X l〇6copies/]iL、4.5 X l〇5copies/]iL、4.5 X l〇4copies/]iL、4.5 X l〇3copies/]iL、4.5 X l〇2copies/]iL、4.5 X l〇icopies/]iL、4.5 X 10°copies/]iL;
[0030] 圖5為MAD-3引物對和探針實際檢測應用擴增曲線圖。
【具體實施方式】
[0031] 實施例1引物對及探針的設計與篩選
[0032] 從NCBI下載小鼠腺病毒（Murine adenovirus A和Murine adenovirus 3)基因組 序列，進行比對后，發(fā)現(xiàn)有S個基因有較好的相似性，其中，IVa2的一致性（identities)為 75% ;Hexon-致性為75% ;PlIIa-致性為71 %，因此選擇此S個基因作為候選的檢測基 因。
[0033] 分別針對上述S個基因設計引物和探針，引物和探針如表1所示。其中，引物和探 針序列均具有一定的簡并性，序列中的Y為C或T; K為G或T; S為C或G; M為A或C; R為A或G; W為A 或T。
[0034] 表 1
[0035]
[0036] 用表1所設計的S組引物對，不使用探針，進行普通PCR擴增。PCR反應體系為：
[0037]
[003引反應條件為:95°C預變性5min;95°C變性153,60。(：退火203,72。(：延伸303，共40個 循環(huán);72°C延伸7min JCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，S組引物對均能擴出相應目的片段。
[0039] 使用S組引物對和探針(MD-1~3 )，對小鼠腺病毒標準株DNA進行巧光定量PCR擴 增。其巧光定量PCR反應體系為：
[0040]
[0041]
[0042] 反應條件為:50°C培育2min;95°C預變性10min;95°C變性15s，60°C退火延伸Imin, 共40個循環(huán)。巧光定量PCR結(jié)果顯示MAD-I引物對和探針效率不佳，檢測不到目的基因。MD-2和MD-3引物對和探針擴增效果較好。
[0043] 將使用MAD-2和MAD-3引物對進行普通PCR擴增的產(chǎn)物割膠回收并純化后，連接 pMD:駁18-T質(zhì)粒載體制備標準品，并進行標準曲線的擴增。兩組引物對所建立的標準曲線 相關系數(shù)均為0.999;擴增效率分別為:95%和94%。
[0044] 將 MAD-2 巧.5Xl〇9copiesAiL)和 MAD-3(4.5Xl〇9copiesAiL)對應的標準品克隆質(zhì) 粒依次稀釋直到5.5 XicA^opiesAiL和4.5XicA^opiesAiL，在40個PCR循環(huán)內(nèi)，MAD-2可W檢 ^i至化.5X10*^copiesA^L，MAD-3可W檢測到4.5Xl(A3opiesA^L，靈敏性均較好。
[0045] 綜上所述，本發(fā)明采用擴增效率及靈敏性均較好的MAD-3引物對及探針來檢測小 鼠腺病毒。
[0046] 實施例2MAD-3引物對及探針的特異性檢測
[0047] 使用MAD-3引物對及探針，W不含任何病毒株的水為陰性對照，W稀釋至4.5 X IO4CopiesAiL的質(zhì)粒標準品為陽性對照，分別對猴腺病毒-1、猴腺病毒-20、小鼠腺病毒、禽 腺病毒I型、禽腺病毒m型、樹駒呼腸孤病毒、犬瘤疹病毒、貓瘤疹病毒、偽狂犬病毒、猴巨細 胞病毒、水痘帶狀瘤疹病毒、樹駒腺病毒、小鼠巨細胞病毒、人單純瘤疹病毒I型、人單純瘤 疹病毒n型、小鼠肝炎病毒A59、小鼠肝炎病毒JHM、腦屯、肌炎病毒、淋己脈絡叢腦膜炎病毒、 仙臺病毒、漢坦病毒等21個病毒種類的樣品DNA或者CDNA進行巧光定量PCR檢測(樣本編號1 ~21)。
[0048] 反應體系和條件同實施例1。結(jié)果如圖1和表2所示。通過檢測，小鼠腺病毒陽性樣 本中可W檢測到目的基因，3號鼠腺病毒中檢測到腺病毒目的基因，空白對照和其他樣品中 未檢測到腺病毒目的基因。證明MAD-3引物對及探針特異性較好。
[0049] 表 2
[(K)加 ]
[0化1 ]
[0052] 注:N/A表示未檢測到，即低于檢測下限。
[0053] 實施例3MAD-3引物對及探針的靈敏性檢測
[0054] (1)標準曲線的建立
[0055] 將MAD-3引物對擴增基因重組質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋，即從4.5 X IO9CopiesAiL稀 釋至4.5 X 10*^。〇口163/化，從中選取4.5 X 1〇7。〇口163/化至4.5 X 1〇1。〇口163/化的質(zhì)粒標準 品，進行化qman探針巧光定量檢測，用于制作標準曲線。橫坐標是WlO為底的質(zhì)?？截悢?shù)的 對數(shù)值，縱坐標是循環(huán)闊值Ct，從標準曲線得出重組質(zhì)?？截悢?shù)(Copy number)與循環(huán)闊值 (Ct)之間的線性關系表達式為:y = -3.471ogx+42.18;相關系數(shù)R2為0.999;擴增效率為 94%。標準曲線見圖2,標準曲線擴增曲線見圖3。
[0056] (2)探針靈敏性檢測
[0化7] 將MAD-3引物對擴增基因重組質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋，從4.5 X IO9CopiesAiL稀釋 至4.5 X 10*^。〇口163/化，從中選取4.5 X 1〇7(3〇口163/化至4.5 X 10*^。〇口163/化的質(zhì)粒標準品進 行靈敏性檢測。結(jié)果見表3和圖4，在40個循環(huán)內(nèi)，140-3最小可^檢測到10*\探針靈敏性較 好。
[0化引 表3 [0化9]
[0060] 注:N/A表示未檢測到，即低于檢測下限。
[0061 ]實施例4穩(wěn)定性和重復性實驗
[0062] 取DNA及同一批PCR檢測試劑保存于-20°C冰箱，每隔一段時間取檢測樣品和檢測 試劑，利用MAD-3引物對和探針進行qPCR檢測，連續(xù)測3次。每次試驗各做3個重復，PCR擴增 體系和反應程序?qū)嵤├?，擴增結(jié)果見表4,說明本發(fā)明檢測試劑和檢測方法穩(wěn)定性和重復 性均較好。
[0063] 表 4
[0064]
[0065] 實施例5實際檢測應用
[0066] 應用MAD-3引物對及探針，W不含任何病毒的水作為陰性對照，W小鼠腺病毒DNA 為陽性對照，分別對6個沙鼠肝臟(G1~G6)、6個沙鼠肺臟(FI~F6)、27個沙鼠糞便(FB-61~ 87)、5個野鼠肝臟化Z-C-I，監(jiān)-C-2,監(jiān)-d-1，監(jiān)-6-1，S冊-d-1)、3個野鼠糞便化N-a-1，細2-a-1，S冊-a-1 )DNA樣本進行化qMan探針巧光定量檢測，結(jié)果見表5和圖5，運些動物樣本中均 未檢測到小鼠腺病毒。
[0067]表 5
[006引
[0069
[0070] 注:N/A表示未檢測到，即低于檢測下限。
【主權(quán)項】
1. 引物對，包括上游引物和下游引物，其特征在于，核苷酸序列為： 上游引物：5 ' -TGAAGAAYCCYKSMGCTTTTCG-3 ' ； 下游引物:5 ' -RGGCAACACAGCCTCCAR-3 '。2. 如權(quán)利要求1所述的引物對在制備檢測小鼠腺病毒試劑盒中的應用。3. -種用于檢測小鼠腺病毒的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，包含如權(quán)利要求1所 述的引物對。4. 如權(quán)利要求3所述的用于檢測小鼠腺病毒的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，探針 為:5'-R-ACCRTGGTTTACTAGACGMGAYGCMA-Q-3'，其中，5'端的R為熒光報告基團；3'端的Q為 熒光淬滅基團。5. 如權(quán)利要求3所述的用于檢測小鼠腺病毒的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，包含 陽性對照DNA。6. 如權(quán)利要求5所述的用于檢測小鼠腺病毒的熒光定量PCR試劑盒，其特征在于，所述 陽性對照DNA為包含如SEQ ID No.4所示核苷酸序列的重組質(zhì)粒。7. 如權(quán)利要求3~6任一所述的熒光定量PCR試劑盒在檢測動物制品或動物實驗廢棄物 中小鼠腺病毒殘留中的應用。8. -種檢測小鼠腺病毒的熒光定量PCR方法，其特征在于，以待檢測樣品的DNA為模板， 利用如權(quán)利要求1所述的引物對進行熒光定量PCR反應。9. 如權(quán)利要求8所述的熒光定量PCR方法，其特征在于，熒光定量PCR的反應體系為： 2><TaqMan Gox Master Mix 1:2.5 :μ[ 10 μΜ的上游引物 0.5 μL 10 μΜ的下游引物 0.5 ,UL 5 μΜ的探針 1.0 μL 10 tig/pL 的模板 DMA 1.0 .uL 補水3、: 25 ,uL。10. 如權(quán)利要求8所述的熒光定量PCR方法，其特征在于，熒光定量PCR的反應條件為:50 。(:培育2min;95°C預變性10min;95°C變性15s，60°C退火lmin，共40個循環(huán)。
【文檔編號】C12Q1/68GK105861751SQ201610324075
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月16日
【發(fā)明人】戴方偉, 杜江濤, 周莎桑, 宋曉明, 呂宇, 薩曉嬰, 褚曉峰
【申請人】浙江省醫(yī)學科學院