使用食品級乳酸菌生產(chǎn)和遞送的口服干擾素及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種可以口服的，表達人或者動物來源的干擾素的食品級重組乳酸菌及其制備方法。其特征在于：干擾素的編碼基因在誘導型或者組成型啟動子的控制下，與信號肽、錨定子結合，組成完整的表達框(expression?cassette)。該表達框被插入到thyA缺失的條件致死型乳酸菌突變株的染色體，或者質粒上，用于干擾素在乳酸菌細胞內、細胞外、或者細胞壁錨定表達。本發(fā)明所述的重組乳酸菌是食品級的，不含外源抗生素抗性基因，可以用于直接口服抗病毒治療。
【專利說明】使用食品級乳酸菌生產(chǎn)和遞送的口服干擾素及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種表達和遞送干擾素的食品級重組乳酸菌及其制備方法。更具體地說，本發(fā)明涉及一種可以大規(guī)模生產(chǎn)的，適用于人和動物干擾素表達的食品級重組乳酸菌，用于人和動物的抗病毒治療。
【背景技術】
[0002]干擾素(interferon，IFN)是多功能細胞因子家族中的一員，是一種具有廣泛的抗病毒抗腫瘤和免疫調節(jié)活性的糖蛋白，是人或者動物體防御系統(tǒng)的重要組成部分。干擾素通過與特定細胞表面受體結合發(fā)生的，隨后激活細胞信號傳導的通路，并且誘導一系列受干擾素調控基因的表達，刺激細胞內多種效應蛋白質的分子合成，從而干擾感染病毒的復制。
[0003]干擾素按國際標準分為三大類，每一類干擾素有不同型，每一型又可被分成不同的亞型。其中 I 類干擾素(IFN-1)包括 IFN-α、IFN-β、IFN-ω、IFN- τ、IFN- δ、IFN-κ、人IFN- ε、IFN- ζ。II類干擾素(IFN-1I)中只包括IFN- Y，它的主要作用是激活巨噬細胞的殺滅微生物的作用；ΠΙ類干擾素(IFN-1II)指IFN-λ，分IFN-X-1，2和3三個亞型，也稱為IL-28A，IL-28B和IL-29，與IFN-1相似，IFN-1II主要在對病毒的自然免疫中在為數(shù)不多的幾種細胞中起作用。
[0004]隨著分子生物學的迅速發(fā)展，人們利用基因工程的方法已經(jīng)成功的在體外大規(guī)模合成了干擾素，并生產(chǎn)了許多生物制品。目前用于干擾素生產(chǎn)的表達系統(tǒng)和生物發(fā)酵器主要是大腸桿菌和酵母菌。
[0005]在臨床上，干擾素已經(jīng)應用于人類流行感冒、帶狀皰疹、乙型肝炎和癌癥治療。動物干擾素的臨床使用率要遠遠落后于人干擾素的應用，這主要是因為干擾素制劑的生產(chǎn)成本較高、干擾素藥效持久性和穩(wěn)定性差、動物種間差異大，需要的干擾素品種繁多，市場還不能滿足其多樣性的需求等。因此，開發(fā)生產(chǎn)成本低，使用方便，針對多物種的干擾素產(chǎn)品已經(jīng)成為業(yè)內追求的發(fā)展方向。
[0006]專利CN1324951A公布了使用昆蟲桿狀病毒表達載體在昆蟲細胞表達生產(chǎn)人乙型干擾素的方法；專利CN100999729A公布了使用昆蟲桿狀病毒表達載體在昆蟲細胞表達生產(chǎn)牛Y -干擾素的方法；專利CN101054584A公布了在大腸桿菌表達鯽魚干擾素的方法?’專利CN101603033A公布了使用CHO細胞系表達牛β -干擾素的方法；專利CN102154307公布了使用大腸桿菌制備雞β-干擾素的方法；
[0007]通過基因工程手段表達和生產(chǎn)干擾素是一種經(jīng)濟、高效的方法，但由于上述專利所使用的表達宿主都不是食品級微生物，所生產(chǎn)的干擾素都必須經(jīng)過純化后注射使用，不能直接用于口服。
[0008]近年來，隨著乳酸菌基因組學的不斷發(fā)展和遺傳操作工具的不斷豐富，以活體乳酸菌為遞送載體的藥物遞送逐漸成為乳酸菌應用研究的一個熱點。乳酸菌是一個十分良好的蛋白質和多肽類藥物的遞送載體，因為它是人體的益生菌，適應腸道環(huán)境，并可以定殖到小腸內壁的上皮細胞。
[0009]專利CN101538572A公布了含有重組人a _2b干擾素的重組乳酸菌及其應用方法。但在該發(fā)明專利中，人a -2b干擾素的編碼基因位于Nisin誘導型表達質粒載體，而非染色體上，在人a _2b干擾素實際生產(chǎn)中仍受到很大限制，且不適宜直接口服。
[0010]本發(fā)明提供了一種使用乳酸菌作為生產(chǎn)和遞送載體的，可以口服，適于大規(guī)模生產(chǎn)的干擾素及其制備方法。該方法可以將干擾素編碼基因在非誘導型啟動子的控制下，整合到表達宿主乳酸菌的染色體上，從而獲得穩(wěn)定遺傳。由于干擾素編碼基因都很小，本發(fā)明所提供的方法中，省略了依賴傳統(tǒng)基因工程方法繁瑣的表達載體構建程序，直接將設計好的完整表達框通過人工合成獲得。在基因合成的同時，可以優(yōu)化密碼子使用偏好。另外，不同物種來源的干擾素具有良好的相似性，該方法廣泛適用于人及動物干擾素的生產(chǎn)和遞送，如人、豬、牛、雞、犬、狐、鴨、羊、魚等。
[0011]使用食品級乳酸菌生產(chǎn)和遞送干擾素具有如下優(yōu)勢:[0012]I)乳酸菌自身耐酸，可以順利穿過胃液，到達腸道；
[0013]2)所生產(chǎn)的干擾素不需要純化，可以直接隨乳酸菌用于口服給藥；
[0014]3)成本低廉、易于大量生產(chǎn)；
[0015]4)比其它制劑具有更長的儲存期及更強的穩(wěn)定性；
[0016]5)乳酸菌在腸道定殖期間還可以持續(xù)分泌干擾素，其分泌和釋放是持續(xù)和緩和的，符合最天然的藥物代謝動力學。

【發(fā)明內容】

[0017]本發(fā)明的目的是公布一種使用食品級乳酸菌作為生產(chǎn)和遞送載體的，可以直接用于口服的干擾素及其制備方法。
[0018]本發(fā)明所述的用于口服的干擾素，其特征在于:干擾素的編碼基因在誘導型或者組成型啟動子的控制下，與信號肽、錨定子結合，組成完整的表達框(expressioncassette)。該表達框被插入到乳酸菌的染色體,或者質粒上來表達和分泌。
[0019]本發(fā)明所述的用于口服的干擾素，其特征還在于，作為表達載體的乳酸菌菌株是thyA缺失的條件致死型突變株。該突變株在人體內可以存活，但在環(huán)境中會迅速死亡，從而避免了所插入的外源基因在環(huán)境中的擴散。本發(fā)明所涉及的攜載了干擾素表達框的重組乳酸菌是食品級的，不含外源抗生素抗性基因，可以用于口服使用。
[0020]本發(fā)明所述的用于口服的干擾素，其特征還在于，通過不同的表達元件，如啟動子、信號肽和錨定子的組合使用，干擾素是被表達在乳酸菌細胞內、或者分泌到乳酸菌細胞外，或者展示在細胞壁表面的。
[0021]本發(fā)明是通過下述技術方案予以實現(xiàn)的:
[0022]本發(fā)明的主要技術環(huán)節(jié)包括:
[0023]將編碼成熟干擾素(人、豬、牛、雞、犬、狐、鴨、羊、魚的成熟干擾素蛋白)的核苷酸序列按照乳酸菌的密碼子使用偏好進行優(yōu)化，與不同的啟動子(組成型或誘導型)序列、信號肽序列、錨定子序列，以及上述各序列之間的連接序列組成完整的表達框，并通過人工合成獲得；使用Cre/lox位點特異性重組系統(tǒng)將表達框整合到表達宿主乳酸菌菌株染色體的thyA基因位置，與thyA基因發(fā)生置換，并去除抗生素抗性基因?；蛘咧苯硬迦氲奖磉_質粒上，轉化乳酸菌感受態(tài)細胞，獲得重組乳酸菌。
[0024]本發(fā)明所述的乳酸菌是指衛(wèi)生部頒發(fā)的《可用于食品的菌種名單》(衛(wèi)辦監(jiān)督發(fā)〔2010〕65號)所包含的所有乳酸菌屬所有菌株，包括嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、卷曲乳桿菌(Lactobacillus crispatus)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus)、德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckii)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentium)、格氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)、副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)、唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius),以及乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)等。
[0025]本發(fā)明所述的干擾素編碼序列，都根據(jù)乳酸菌的密碼子使用偏好性對核苷酸序列進行了優(yōu)化，以利于在乳酸菌細胞表達。
[0026]本發(fā)明所述的經(jīng)過優(yōu)化后的干擾素編碼序列，是通過市場上的核酸合成服務商進行基因合成而獲得的。
[0027]本發(fā)明所述的組成型啟動子，是一種乳桿菌rRNA啟動子的類似序列。
[0028]本發(fā)明所述的誘導型啟動子，是被食品級的誘導物或者物理條件誘導的，如Nisin，溫度、酸堿度，等。
[0029]本發(fā)明所述的將表達框整合到表達宿主乳酸菌菌株的染色體上，并去除抗生素抗性基因，是通過Cre / IOx位點特異性重組實現(xiàn)的。表達框整合到染色體后，可以隨著細胞分裂而穩(wěn)定遺傳，不會因外部選擇壓力的失去而丟失。
【具體實施方式】
[0030]下面結合具體實例，對本發(fā)明做進一步說明。本發(fā)明的保護范圍并不限定于下列實例。
[0031]實施例1:干擾素編碼基因密碼子優(yōu)化
[0032]由于人和動物來源的干擾素編碼基因是真核基因，其密碼子使用偏好與乳酸菌有另IJ。為了使其能夠順利在乳酸菌細胞表達，需要對其核苷酸序列進行優(yōu)化，去除稀有密碼子。 [0033]本發(fā)明所述的干擾素，其成熟蛋白的編碼基因按照乳酸菌的密碼子使用偏好性優(yōu)化后的基因序列，是如下I)或2)的核苷酸序列:
[0034]I)序列表中序列1-33所示的核苷酸序列
[0035]序列1-33所示的核苷酸序列依次為:人干擾素d、人干擾素β、人干擾素Y、豬干擾素α、豬干擾素β、牛干擾素α-1、牛干擾素α _3、牛干擾素α _7、牛干擾素α_8、牛干擾素β-1、牛干擾素β _3、牛干擾素Y、牛干擾素Ω-1、雞干擾素α、雞干擾素β、犬干擾素α -6、犬干擾素β、犬干擾素Y、狐貍干擾素α、狐貍干擾素β、狐貍干擾素Y、鴨干擾素α、鴨干擾素Y、羊干擾素α、羊干擾素β、羊干擾素Y、鯽魚干擾素、鱸魚干擾素、草魚干擾素、大西洋鮭(三文魚)干擾素α-1、大西洋鮭(三文魚)干擾素α _2、斑馬魚干擾素、金魚干擾素；[0036]2)與序列表中序列1-33所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性核苷酸序列
[0037]實施例2:干擾素表達框的構建
[0038]干擾素在乳酸菌的表達與定位是通過多個表達調控元件的組合使用來實現(xiàn)的。這些表達調控元件包括啟動子、信號肽序列、干擾素編碼基因、錨定子序列、以及各個表達調控元件之間的連接序列。
[0039]本發(fā)明所述的組成型啟動子，是乳桿菌rRNA啟動子的類似序列。
[0040]本發(fā)明所述的誘導型啟動子，是被食品級的誘導物或者物理條件誘導的，如Nisin，溫度、酸堿度，等。
[0041]本發(fā)明中，啟動子序列與信號肽序列之間以CATATG，即核酸內切酶NdeI的特異性酶切位點序列連接，由此引入啟始密碼子ATG，方便基因操作。
[0042]本發(fā)明中的信號肽序列，其特征在于，是如下I)或2)的核苷酸序列
[0043]I)序列表中序列34-41所示的核苷酸序列
[0044]2)與序列表中序列34-41所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性核苷酸序列
[0045]本發(fā)明中，信號肽序列與干擾素編碼基因序列之間沒有多余的連接序列。
[0046]本發(fā)明所述的用于細胞壁表面展示的錨定子序列，來自于以下蛋白質的LPXT-模序細胞壁錨定結構域(LPXTG-motif cell wall anchor domain)之一，這些蛋白質在GenBank的編碼如下:
[0047]YP_005872271、YP_005873461、CCC77736、CCC77890、CCC78260、CCC78361、CCC78381、CCC78520、CCC78612、CCC78778、CCC79729、ΥΡ_005873877、ΥΡ_005873931、ΥΡ_005873973、ΥΡ_005874035、ΥΡ_005861438 等。
[0048]以蛋白質ΥΡ_005861438為例，其錨定子的氨基酸序列為序列表中的序列42:
[0049]本發(fā)明中，干擾素編碼基因序列與錨定子之間以GGT GGA,即兩個甘氨酸的編碼序列連接。
[0050]在本實施例中，根據(jù)不同的表達目的，表達框由不同的表達調控元件和干擾素編碼序列組成。如果在細胞內表達，則表達框由啟動子(組成型或誘導型)序列、干擾素編碼序列組成；如果在細胞外分泌表達，則表達框由啟動子(組成型或誘導型)序列、信號肽序列、干擾素編碼序列組成；如果在細胞壁錨定表達，則表達框由啟動子(組成型或誘導型)序列、信號肽序列、干擾素編碼序列和錨定子序列組成。
[0051]在本實施例中，基因(整個表達框)合成由市場上的核酸合成服務商完成，為干粉狀DNA。合成的基因存在于核酸合成服務商提供的克隆質粒上。將DNA溶于100微升超純水備用。合成基因的N端連接一個BglII酶切位點，C端連接一個HindIII連接位點?？山?jīng)BglII / HindIII雙酶切后，連接到相應的表達載體。
[0052]實施例3:干擾素表達框插入發(fā)酵乳桿菌染色體，制備條件致死型突變株，并去除抗生素抗性基因
[0053]本實施例中所述乳桿菌特指發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus ferment ium)。
[0054]分兩步完成，首先將一個含有干擾素表達框、上游1x位點、氯霉素抗性基因、下游1x位點的DNA片斷通過位點特異性重組插入到發(fā)酵乳桿菌染色體的thyA基因位置，替換thyA基因；然后再使用Cre酶去除抗生素抗性基因。
[0055]其中，插入片斷設計如下:來自發(fā)酵乳桿菌染色體thyA基因上游的1000bp的DNA片斷-干擾素表達框-1ox位點序列-氯霉素抗性基因-1ox位點序列-來自發(fā)酵乳桿菌染色體thyA基因下游的1000bp的DNA片斷。
[0056]其中，來自發(fā)酵乳桿菌染色體thyA基因上下游的DNA片斷，是以發(fā)酵乳桿菌基因組DNA為模板，通過PCR獲得的。以實施例2中所述的人工合成的干擾素表達框為模板，通過PCR在兩端引入1x位點序列。3個PCR片斷首尾相繼重疊25bp，通過重疊延伸PCR連接為一個全長的DNA插入片斷。將該DNA插入片斷與pNZ質粒連接，并轉化大腸桿菌Top10感受態(tài)細胞，在含有5微克/毫升氯霉素的BHI固體培養(yǎng)基平板上篩選陽性重組子，并進一步在含有5微克/毫升氯霉素的BHI液體培養(yǎng)基中擴繁，大量提取質粒DNA并測序驗證。將所提取的質粒通過電擊轉化至發(fā)酵乳桿菌，通過平行涂板篩選只在氯霉素平板而不在紅霉素平板上生長的菌落，進一步通過菌落PCR驗證，以獲得雙交換重組子。
[0057]將含有Cre重組酶編碼基因的質粒轉化上述通過驗證了的雙交換重組子(需提前制備為感受態(tài)細胞)，37°C培養(yǎng)子含10微克/毫升紅霉素的MRS平板，菌落出現(xiàn)后平行涂平板于分別含有30微克/毫升紅霉素和10微克/毫升氯霉素的培養(yǎng)基，篩選對氯霉素敏感但有紅霉素抗性的重組子，使用菌落PCR方法驗證氯霉素抗性基因的切除。
[0058]將該重組子37°C過夜培養(yǎng)于IOml不含如何抗生素的MRS培養(yǎng)基，以使含有Cre重組酶編碼基因的質粒丟失。將培養(yǎng)液涂MRS平板，37°C過夜培養(yǎng)，取菌落平行涂板于含有30微克/毫升紅霉素的MRS平板和不含任何抗生素的MRS平板，以篩選對紅霉素敏感的重組子，通過菌落PCR驗證含有Cre重組酶編碼基因的質粒的丟失。
【權利要求】
1.一種使用食品級乳酸菌表達和遞送的，用于直接口服的干擾素，其特征在于，干擾素編碼基因序列在誘導型或者組成型啟動子的控制下，與來源于乳酸菌的信號肽序列、錨定子序列連接，組成完整的表達框，分別被整合到乳酸菌的染色體，或者插入到表達質粒上。干擾素表達在乳酸菌細胞內、分泌到細胞外、或者錨定展示在乳酸菌細胞壁上。作為表達載體的乳酸菌菌株是缺失thyA基因的條件致死型突變株。攜載了干擾素表達框的重組乳酸菌是食品級的，不含外源抗生素抗性基因，可以用于口服使用。
2.按照權利要求1所述的干擾素，包括人干擾素(α、β、gamma)、豬干擾素(α、Β、gamma)、牛干擾素(α、β、gamma、Ω )、雞干擾素(α、β )、犬干擾素(α、β、gamma )、狐干擾素(α、β、gamma )、鴨α -干擾素(α、gamma )、羊干擾素(α、β、gamma )、魚(鯽魚、鱸魚、草魚、大西洋鮭、斑馬魚、金魚)干擾素等。
3.按照權利要求2所述的干擾索，其成熟蛋白的編碼基因按照乳酸菌的密碼子使用偏好性優(yōu)化后的基因序列(人工序列)，是如下I)或2)的核苷酸序列: 1)序列表中序列1-33所示的核苷酸序列: 序列1-33所示的核苷酸序列依次為:人干擾素α、人干擾素β、人干擾素Y、豬干擾素α、豬干擾素β、牛干擾素α-1、牛干擾素α _3、牛干擾素α _7、牛干擾素α _8、牛干擾素β-1、牛干擾素β _3、牛干擾素Y、牛干擾素Ω-1、雞干擾素α、雞干擾素β、犬干擾素α _6、犬干擾素β、犬干擾素Y、狐貍干擾素α、狐貍干擾素β、狐貍干擾素Y、鴨干擾素α、鴨干擾素Y、羊干擾素α、羊干擾素β、羊干擾素Y、鯽魚干擾素、鱸魚干擾素、草魚干擾素、大西洋鮭(三文魚)干擾素α-1、大西洋鮭(三文魚)干擾素α _2、斑馬魚干擾素、金魚干擾素； 2)與序列表中序列1-33所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性核苷酸序列。
4.按照權利要求1所述的乳酸菌菌株，包括嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、卷曲乳桿菌(Lactobacilluscrispatus) > 保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus)、德氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)、發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentium)、格氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)、瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus)、約氏乳桿菌(Lactobacillusjohnsonii)、副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)、植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus)、唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius),以及乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)等。
5.按照權利要求1所述的完整表達框，其特征在于包括組成型或誘導型啟動子序列、來源于乳酸菌的信號肽序列、干擾素編碼基因序列、錨定子序列，以及它們之間的連接片斷組成。表達框位于表達載體乳酸菌的染色體或者質粒上。
6.按照權利要求1所述的乳酸菌thyA基因缺失突變株，其特征在于，是利用Cre/ 1x位點特異性重組系統(tǒng)，使干擾素表達框與thyA基因發(fā)生置換而獲得的；或者是利用Cre /1x位點特異性重組系統(tǒng)將thyA基因敲除而獲得的。
7.按照權利要求5所述的信號肽序列，其特征在于，是如下I)或2)的核苷酸序列: 1)序列表中序列34-41所示的核苷酸序列 2)與序列表中序列34-41所示的核苷酸序列具有90%以上的同源性核苷酸序列。
8.按照權利要求5所述的錨定子序列，其特征在于，是來自于以下蛋白質的LPXT-模序細胞壁錨定結構域(LPXTG-moti fee 11 wall anchor domain)之一，這些蛋白質在GenBank的編碼如下:
YP_005872271、YP_00587346U CCC77736、CCC77890、CCC78260、CCC78361、CCC78381、CCC78520、CCC78612、CCC78778、CCC79729、YP_005873877、YP_00587393U YP_005873973、YP_005874035、YP_005861438 等。
【文檔編號】C12R1/23GK103834678SQ201210491070
【公開日】2014年6月4日 申請日期:2012年11月23日 優(yōu)先權日:2012年11月23日
【發(fā)明者】劉占良 申請人:劉占良