專利名稱：一種脂肪酶及其重組表達(dá)工程菌株的制作方法
一種脂肪酶及其重組表達(dá)工程菌株技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于微生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種脂肪酶基因及其重組表達(dá)工程菌株。
背景技術(shù)：
脂肪酶即三酰基甘油?；饷?，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯。脂肪酶基本組成單位僅為氨基酸，通常只有一條多肽鏈。它的催化活性僅僅決定于它的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)(Schmid等，1998)。
脂肪酶廣泛的存在于動(dòng)植物和微生物中。植物中含脂肪酶較多的是油料作物的種子，如蓖麻籽、油菜籽，當(dāng)油料種子發(fā)芽時(shí)，脂肪酶能與其他的酶協(xié)同發(fā)揮作用催化分解油脂類物質(zhì)生成糖類，提供種子生根發(fā)芽所必需的養(yǎng)料和能量；動(dòng)物體內(nèi)含脂肪酶較多的是高等動(dòng)物的胰臟和脂肪組織，在腸液中含有少量的脂肪酶，用于補(bǔ)充胰脂肪酶對(duì)脂肪消化的不足，在肉食動(dòng)物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在動(dòng)物體內(nèi)，各類脂肪酶控制著消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代謝等過(guò)程；細(xì)菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更為豐富 (Pandey等)。由于微生物種類多、繁殖快、易發(fā)生遺傳變異，具有比動(dòng)植物更廣的作用P H、 作用溫度范圍以及底物專一性，且微生物來(lái)源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，適合于工業(yè)化大生產(chǎn)和獲得高純度樣品，因此微生物脂肪酶是工業(yè)用脂肪酶的重要來(lái)源，并且在理論研究方面也具有重要的意義。
脂肪酶具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值，已成為市場(chǎng)上的第三大工業(yè)用酶。脂肪酶可以催化解脂、酯交換、酯合成等反應(yīng)，廣泛應(yīng)用于飼料添加劑、油脂加工、食品、醫(yī)藥、日化等工業(yè)。 脂肪酶的制備方法有提取法和微生物發(fā)酵法(王海燕等，2007，飼料工業(yè))。但是提取法工藝復(fù)雜，成本高、效率低。因此，絕大多數(shù)脂肪酶均是通過(guò)微生物發(fā)酵而制備的?，F(xiàn)有工業(yè)化生產(chǎn)脂肪酶的方法主要有二種一是誘變選育高產(chǎn)的脂肪酶的自然菌株，如解脂亞羅酵母(李珍等，2011，菌物學(xué)報(bào)；徐宇麗等，2011，微生物學(xué)報(bào))；二是構(gòu)建高產(chǎn)的工程菌(王小峰等，2011，生物工程雜志)。
構(gòu)建基因工程菌是獲得高產(chǎn)、高酶活菌株的有效方法之一。目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上脂肪酶產(chǎn)品多由畢赤酵母異源表達(dá)而生產(chǎn)，其優(yōu)點(diǎn)是發(fā)酵工藝成熟；缺點(diǎn)是甲醇誘導(dǎo)存在的安全隱患，還有畢赤酵母表達(dá)水平不高，表達(dá)水平一般低于7g/l。
木霉最常用的工業(yè)酶生產(chǎn)菌株之一，其中市場(chǎng)上的纖維素酶絕大多數(shù)是由木霉生產(chǎn)的。木霉屬于真核生物，具有翻譯后修飾系統(tǒng)，如內(nèi)含子的剪切和糖基化等，因此可以直接表達(dá)真核來(lái)源的DNA序列、無(wú)需刪除內(nèi)含子序列，簡(jiǎn)化了分子操作。木霉規(guī)?；l(fā)酵系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)是(1)分泌表達(dá)，便于發(fā)酵后處理；(2)深層液體發(fā)酵，便于規(guī)?；I(yè)發(fā)酵；(3)高密度發(fā)酵，生產(chǎn)成本低,其最高表達(dá)水平可達(dá)40g/l。
因此，通過(guò)構(gòu)建木霉工程菌，高效重組表達(dá)脂肪酶，有望大大降低發(fā)酵成本，從而降低脂肪酶對(duì)使用成本，促進(jìn)脂肪酶在飼料添加劑領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種脂肪酶及其重組表達(dá)工程菌株，即一種從黑曲霉中篩選的新的脂肪酶，以及用于重組表達(dá)該脂肪酶的里氏木霉工程菌，經(jīng)里氏木霉表達(dá)后，該酶對(duì)胃液、胃蛋白酶和人工腸液的耐受性增強(qiáng)，可將其廣泛用作飼料添加劑，提高飼料利用率。
本發(fā)明首先提供一種新型的脂肪酶，其特征在于
(a)其氨基酸序列為SEQ ID NO: I的脂肪酶；
(b)在(a)中的氨基酸上發(fā)生取代、缺失或添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸得到的，具有脂肪酶活性的酶。
用于編碼上述脂肪酶的基因，其中一種核苷酸序列是SEQ ID N0:2。
本發(fā)明另一方面提供了一種里氏木霉工程菌，用于表達(dá)上述的脂肪酶。
所述里氏木霉工程菌ZQ-KTrichoderma reesei ZQ-I),已于2012年11月27日保藏于“中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心”，保藏編號(hào)是=CCTCC Ν0:Μ 2012483。
本發(fā)明的脂肪酶作為飼料添加劑的應(yīng)用。
本發(fā)明的里氏木霉工程菌能高效表達(dá)黑曲霉來(lái)源的脂肪酶，20L罐發(fā)酵酶活高達(dá) 20000U/ml，表達(dá)水平超過(guò)10g/L。經(jīng)里氏木霉宿主細(xì)胞的修飾，本發(fā)明的里氏木霉工程菌重組表達(dá)的脂肪酶對(duì)胃液、胃蛋白酶和人工腸液的耐受性很強(qiáng)，適合作為飼料添加劑使用。


圖I :本發(fā)明的里氏木霉工程菌發(fā)酵上清液SDS-PAGE電泳檢測(cè)分析圖。
圖2 :本發(fā)明重組表達(dá)脂肪酶的耐受性實(shí)驗(yàn)。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。
實(shí)施例I黑曲霉脂肪酶基因表達(dá)載體的構(gòu)建
I. I提取黑曲霉總基因組DNA
將黑曲霉(Aspergillus niger)接種搖瓶培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng),取適量菌體置于離心管中，13000 rpm離心5 min，棄上清；加入400 μ I抽提緩沖液(100 mM TrisHCl, 100 mM EDTA, 250 mM NaCl, 1%SDS);然后加IOOmg石英砂或玻璃珠、在珠打儀劇烈振蕩2 min左右；水浴鍋 65°C 水浴 20 min 后加入 200μ1 IOM NH4AC 冰浴 10 min ;13000rpm 離心 10 min 取上清，然后加入2倍體積的無(wú)水乙醇，-20°C放置30 min ； 13000 rpm離心10 min棄上清， 用70%乙醇洗滌2次；晾干，加入適量水溶解于_20°C保存。
I. 2基因克隆
以I. I中提取的基因組總DNA為模板，利用引物anl_F和anl_R (AAAGGTACCATGTTCTCTGGACGGTTTG 和 AGCTCTAGACTATAGCAGA CACTCTGAAATTGC)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為 95°C 4min ；94°C 30S，59°C 40S，72°C Imin 30 個(gè)循環(huán)；72°C 7min。利用凝膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
I. 3測(cè)序分析
將I. 2中回收的擴(kuò)增產(chǎn)物連接到PMD18-T載體，獲得克隆載體pMD-ANL質(zhì)粒并送至北京華大基因研究中心進(jìn)行測(cè)序分析。測(cè)序結(jié)果，擴(kuò)增產(chǎn)物的基因序列為SEQ ID NO: 2，其編碼氨基酸序列為SEQ ID NO: I。多個(gè)克隆的結(jié)果證明沒有發(fā)生擴(kuò)增錯(cuò)誤。
I. 4構(gòu)建載體
提取質(zhì)粒pMD-ANL，用NcoI和KpnI進(jìn)行雙酶切，回收ANL片段；取2 μ I回收產(chǎn)物與NcoI和KpnI雙酶切pKDN-5載體連接過(guò)夜導(dǎo)入大腸桿菌DH5 α，獲得重組表達(dá)質(zhì)粒 pKDN-ANL，測(cè)序結(jié)果證實(shí)插入的片段能夠編碼序列為SEQ ID NO: I的脂肪酶
實(shí)施例2轉(zhuǎn)化與篩選
I. I原生質(zhì)體制備
接種里氏木霉(Trichoderma reesei )菌絲于PDA平板上生長(zhǎng)4天；切取直徑約3 cm的菌落置于約60 mlYEG (O. 5%酵母粉、1%葡萄糖)的液體培養(yǎng)基中，30°C、200 rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜；多層紗布過(guò)濾收集菌絲；將菌絲置于盛有10-20 ml裂解酶液(Sigma L1412)酶解2-3小時(shí)；取出酶解液，加入O. 7 M NaCl溶液，輕輕搖晃，倒于三層滅菌擦鏡紙過(guò)濾，收集濾液，3000 rpm，離心 10 min ;棄上清，加 10-20 ml STC液(20%蔗糖，50mM Tris-Cl, 50mM CaCl2)懸浮,3000 rpm,離心 10 min ;加適量 STC 懸浮分裝(150 μ /管，IO8 個(gè)/ml )。
I. 2轉(zhuǎn)化與驗(yàn)證
取2Pg pKDN-ANL DNA加入到150μ1原生質(zhì)體中，接著加入500μ1 25%PEG輕輕混勻，室溫靜置25 min ;然后分2_3次再加Iml 25%PEG，輕輕混勻，室溫靜置25min，把原生質(zhì)體加到50 ml左右熔化后冷卻至45-55°C的上層半固體培養(yǎng)基(O. l%MgS04, 1%KH2P04,O.6%(NH4)2SO4, 1%葡萄糖，18. 3%山梨醇，O. 35%瓊脂糖)，輕輕混勻后倒入含IOOPg/ ml潮霉素下層基礎(chǔ)培養(yǎng)基平板(2%葡萄糖，O. 5% (NH4) 2S04, 1. 5%KH2P04, O. 06%MgS04,O.06%CaCl2，I. 5%瓊脂)，28°C黑暗培養(yǎng)數(shù)天至轉(zhuǎn)化子長(zhǎng)出。
按照實(shí)施例I所述方法提取轉(zhuǎn)化子基因組DNA為模板，利用引物Hcds531-s 和 Hcds531-a (Hcds531-s ACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACT ；和 Hcds531_a: AGAAGAAGATGTTGGCGACCTCGTATT )擴(kuò)增潮霉素基因驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子。利用實(shí)施例I所述引物 anl-F和anl-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因。PCR擴(kuò)增條件為95°C 4min ；94°C 30S ；59°C 40S, 72°C Imin 30個(gè)循環(huán)；72°C 7min。利用凝膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行測(cè)序分析，即經(jīng)過(guò)上述兩個(gè)PCR反應(yīng)選育和驗(yàn)證陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。將其中一株陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子命名為 Trichoderma reesei ZQ-1，并于2012年11月27日保藏于“中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心”，保藏編號(hào) CCTCC Ν0:Μ 2012483。
實(shí)施例3發(fā)酵驗(yàn)證和酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定
將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子Trichoderma reesei ZQ-I和出發(fā)菌株(陰性對(duì)照)分別接種于麗發(fā)酵培養(yǎng)基(I. 5% 葡萄糖，I. 7% 乳糖，2. 5% 玉米漿，O. 44% (NH4)2SO4,0. 09%MgS04, 2%KH2P04,O.04%CaCl2，0. 018% 吐溫-80，O. 018% 微量元素，O. 018% 聚丙二醇-2000)培養(yǎng)，28°C培養(yǎng) 48 小時(shí)，然后25°C培養(yǎng)48小時(shí)，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖I所示，其中箭頭所指處為重組表達(dá)的脂肪酶，說(shuō)明本發(fā)明構(gòu)建的里氏木霉工程菌能重組表達(dá)黑曲霉的脂肪酶。
最適作用pH分析用pH值分別為3. 0,4. 0,5. 0,6. 0,7. 0,8. O的緩沖液進(jìn)行稀釋測(cè)結(jié)果表明構(gòu)建的工程菌重組表達(dá)的脂肪酶的最適作用pH為5. O。
最適作用溫度分析分別在30°C、35°C、40°C、45°C、50°C，pH7. 5條件下測(cè)定酶活， 以最高酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，做溫度-相對(duì)酶活曲線。結(jié)果表明，本發(fā)明構(gòu)建的工程菌重組表達(dá)的脂肪酶的最適作用溫度為30°C。
實(shí)施例4重組表達(dá)脂肪酶的耐受性實(shí)驗(yàn)
(I)胃液、胃蛋白酶耐受性實(shí)驗(yàn)
用pH5. 5的緩沖液稀釋T. reesei ZQ-I的發(fā)酵上清液，調(diào)節(jié)pH至2. O ;取上述上清液各8 ml，分別加入到2ml胃液和2ml胃蛋白酶(5%)中；37°C處理2 h，測(cè)定溶液中殘余的脂肪酶酶活，以未處理的溶液中脂肪酶酶活為100%。結(jié)果顯示經(jīng)上述胃液處理后，脂肪酶的殘余酶活為60. 4% ;經(jīng)上述胃蛋白酶處理后，脂肪酶的殘余酶活為66. 8%。
(2) pH6. 8、胰蛋白酶耐受性實(shí)驗(yàn)
用ρΗ5· 5的緩沖液稀釋?duì)? reesei ZQ-1的發(fā)酵上清液，調(diào)節(jié)ρΗ6· 8 ;分別用ρΗ6· 8 的緩沖液和胰蛋白酶各稀釋5倍，37°C處理6 h，測(cè)定溶液中殘余的脂肪酶酶活，以未處理的溶液中脂肪酶酶活為100%。結(jié)果顯示經(jīng)pH6. 8的緩沖液處理后，殘余酶活約為62. 6% ； 胰蛋白酶處理后的殘余酶活為9. 8%。
上述結(jié)果表明，本發(fā)明構(gòu)建的里氏木霉工程菌重組表達(dá)的脂肪酶對(duì)胃液、胃蛋白酶和人工腸液具有很強(qiáng)的耐受性，有望開發(fā)成飼料添加劑。
實(shí)施例5脂肪酶產(chǎn)品的制備
將上述工程菌T. reesei ZQ-I接種于搖瓶種子培養(yǎng)基(葡萄糖10_30g/L, 土豆 100-200g/L)，30°C，200rpm搖床培養(yǎng)48h之后，將發(fā)酵液轉(zhuǎn)入I噸種子罐(培養(yǎng)基為葡萄糖20-50g/L，硫酸銨10-30g/L，硫酸鎂5-10g/L，磷酸二氫鉀15_30g/L)，溫度控制在 25土1°C，pH值5. 0±0. 2，在種子罐培養(yǎng)48h之后，將種子液轉(zhuǎn)入30噸發(fā)酵罐(培養(yǎng)基為 葡萄糖 30-50g/L,乳糖 2. 0-10 g/L，玉米漿 20_50g/L，硫酸銨 10_30g/L，硫酸鎂 5-10g/L， 磷酸二氫鉀15-30g/L)，溫度控制在25±1°C，pH值控制在5. 0±0. 2，在發(fā)酵罐培養(yǎng)IOh到 15h之后，開始補(bǔ)加乳糖誘導(dǎo)菌體產(chǎn)酶，發(fā)酵時(shí)間約為200h到230h。發(fā)酵結(jié)束之后，將發(fā)酵液放入40噸儲(chǔ)罐，按照發(fā)酵液體積加入O. 5-1. 0%的硅藻土和O. 1-0. 5%的珍珠巖。攪拌混勻之后，靜置8h后，采用板框過(guò)濾。采用以下步驟分別制備液體酶制劑或固體酶制劑(I) 通過(guò)過(guò)濾獲得澄清的濾液進(jìn)行超濾，溫度控制在15°C ;最后在超濾濃縮液加入添加保護(hù)劑 (16%山梨醇，3%氯化鈉)，防腐劑(山梨酸鉀O. 12%，苯甲酸鈉O. 17%)獲得液體酶制劑成品；(2)將超濾濃縮后的濾液和載體(淀粉)混合均勻，采用噴霧干燥方法將其噴干即得到固體酶制劑產(chǎn)品。
實(shí)施例6重組表達(dá)的脂肪酶對(duì)肉雞生產(chǎn)性能的影響實(shí)驗(yàn)
I.材料與方法
I. I試驗(yàn)動(dòng)物與分組
六和種雞場(chǎng)提供的羅斯肉雛雞300只，隨機(jī)分為3個(gè)處理，每個(gè)處理10個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只肉雞。具體分組設(shè)計(jì)見表I。
表I試驗(yàn)分組設(shè)計(jì)
權(quán)利要求
1.一種脂肪酶，其特征在于所述的脂肪酶 Ca)其氨基酸序列為SEQ ID NO: I ；(b)在(a)中的氨基酸上發(fā)生取代、缺失或添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸得到的，具有脂肪酶活性的酶。
2.用于編碼權(quán)利要求I所述的脂肪酶的基因，其核苷酸序列為SEQID N0:2。
3.—種里氏木霉工程菌，所述的工程菌用于表達(dá)權(quán)利要求I所述的脂肪酶。
4.權(quán)利要求3所述的里氏木霉工程菌，其保藏編號(hào)為CCTCCΝ0:Μ 2012483。
5.權(quán)利要求I所述的脂肪酶作為飼料添加劑的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種重組表達(dá)脂肪酶的工程菌株。本發(fā)明將從黑曲霉中克隆得到的脂肪酶基因轉(zhuǎn)入里氏木霉中，構(gòu)建了里氏木霉工程菌，保藏號(hào)為CCTCC NO:M2012483。經(jīng)重組表達(dá)的脂肪酶最適作用pH為5.0，最適作用溫度30℃，且對(duì)胃液、胃蛋白酶和人工腸液的耐受性增強(qiáng)。本發(fā)明的脂肪酶能顯著提高飼料中油脂類物質(zhì)的利用率，從而能夠顯著減少飼料中油脂的添加，從而降低飼料成本。
文檔編號(hào)C12N15/55GK102978181SQ201210497039
公開日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月29日
發(fā)明者黃亦鈞, 張青, 徐娟, 許麗紅, 王華明, 吳秀秀 申請(qǐng)人:青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司