專利名稱：葡激酶基因及其高表達(dá)工程菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及DNA基因工程，具體地講是一種葡激酶(Sak)基因及其高表達(dá)工程菌株，該表達(dá)產(chǎn)物具有纖溶酶原激活劑作用，對人體纖維蛋白具有很高的的水解活性。
有關(guān)資料報道了金葡菌產(chǎn)生一種非酶蛋白，能激活纖溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶。這種非酶蛋白即為葡激酶(Sak)。該酶的基因已被多家實驗室克隆。有公開專利文獻(xiàn)CN1109508A號說明書中，披露從S.aureus噬菌體DNA獲得了葡激酶基因并克隆化。有文獻(xiàn)Collen，Det al.(1992)Fibrinolysis，6226-231文中披露從S.aureus菌染色體DNA克隆了葡激酶基因。這兩種基因片段都是采用酶切大片段DNA進(jìn)行克隆的。其基因片段較大，組裝到載體質(zhì)粒的拷貝數(shù)較低，難以得到較高的表達(dá)效果。這種S.aureus菌染色體DNA的表達(dá)水平一般在10-15％，如《生物工程》1994.2第12卷“治療血栓用藥重組葡激酶的高產(chǎn)率生產(chǎn)和純化”一文中披露“用發(fā)酵罐培養(yǎng)轉(zhuǎn)染大腸桿菌TG1細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生葡激酶，占細(xì)胞總蛋白的10-15％?！边@是目前公開資料報導(dǎo)中，葡激酶表達(dá)的公認(rèn)水平。
本發(fā)明的目的是要提高葡激酶(Sak)基因的表達(dá)水平，得到高表達(dá)葡激酶(Sak)產(chǎn)物作為纖溶酶原激活劑，用于血栓治療中。篩選出新的Sak基因，構(gòu)建出高表達(dá)質(zhì)粒的工程菌株。
本發(fā)明的目的是有以下技術(shù)方案實現(xiàn)的，具體篩選，克隆，鑒定，構(gòu)建過程如下首先篩選出一種葡激酶基因，該基因是由金葡菌SL1.063菌株的染色體DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得的，該基因的全序列的密碼子及其編碼氨基酸如下序列TCA AGTTCA TTC GACAAAGGAAAATATAAASer SerSer Phe AspLysGlyLysTyrLys10AAA GGCGAT GAC GCGAGTTATTTTGAACCALys GlyAsp Asp AlaSerTyrPheGluPro20ACA GGCCCG TAT TTGATGGTAAATGTGACTThr GlyPro Tyr LeuMetValAsnValThr30GGA GTTGAT GGT AAGGGAAATGAATTGCTAGly ValAspGly34LysGlyAsnGluLeuLeu40TCC CCTCGT TAT GTCGAGTTTCCTATTAAASer ProArg43Tyr ValGluPheProIleLys50CCT GGGACT ACA CTTACAAAAGAAAAAATTPro GlyThr Thr LeuThrLysGluLysIle60GAA TACTAT GTC GAATGGGCATTAGATGCGGlu TyrTyr Val GluTrpAlaLeuAspAla70ACA GCATAT AAA GAGTTTAGAGTAGTTGAAThr AlaTyr Lys GluPheArgValValGlu80TTA GATCCA AGC GCAAAGATCGAAGTCACTLeu AspPro Ser AlaLysIleGluValThr90TAT TATGAT AAG AATAAGAAAAAAGAAGAATyr TyrAsp Lys AsnLysLysLysGluGlu100ACG AAGTCT TTC CCTATAACAGAAAAAGGTThr LysSer Phe ProIleThrGluLysGly110TTT GTTGTC CCA GATTTATCAGAGCATATTPhe ValVal Pro AspLeuSerGluHisIe120AAA AACCCT GGA TTCAACTTAATTACAAAGLys AsnPro Gly PheAsnLeuIleThrLys130GTT GTTATT GAA AAGAAAVal ValIle Glu LysLys136
本葡激酶基因的高表達(dá)工程菌株，由產(chǎn)葡激酶活性高的菌株(SL1.063)的染色體模板DNA，采用引物P-Nml和引物P-C經(jīng)PCR擴(kuò)增，得到完整的葡激酶基因DNA小片段；該基因DNA片段與pUC 19載體質(zhì)粒，分別以EcoRI和BamH1酶切；再將酶切的上述質(zhì)粒和葡激酶基因DNA小片段，用T4DNA連接酶連接獲得pUK408質(zhì)粒DNA，再轉(zhuǎn)化入DH5α或JM109大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，構(gòu)建成葡激酶高表達(dá)的工程菌株DH5α(pUK408)或JM109(pUK408)。
本葡激酶基因的高表達(dá)工程菌株，所述的引物P-Nm1，其核苷酸序列5′-CGCGAATTCATGTCAAGTTCATTCGACAAAGG-3′，鍵長32；所述的引物P-C，其核苷酸序列5′-CGCGGATCCTATTTCTTTTCTATAACAACCTTTG-3′，鍵長34。
本葡激酶基因的高表達(dá)工程菌株，所述的pUK408重組質(zhì)粒DNA還可與另一種pUV606載體質(zhì)粒，分別經(jīng)EcoRI和BamH1酶切pUK408重組質(zhì)粒產(chǎn)生的小片段DNA，和酶切pUV606的大片段DNA，通過T4DNA連接酶連接成pUK408質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化入DH5α或TG1或TG2大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，構(gòu)建成含重組質(zhì)粒pHK408的葡激酶高表達(dá)的工程菌株DH5α(pHK408)。
本發(fā)明的Sak基因及其高表達(dá)工程菌株，其優(yōu)點在于本發(fā)明Sak基因由408個核苷酸組成，推導(dǎo)出相應(yīng)的葡激酶136個氨基酸序列。本發(fā)明Sak基因第34和43位的氨基酸不僅與國外報道的噬菌體DNA中Sak基因不同，而且與Collen等發(fā)表的由金葡菌染色體DNA克隆的Sak基因也不完全相同。顯然，本發(fā)明提供的是一個新的Sak基因。將得到的DNA片段，分別克隆到合適的載體質(zhì)粒上，均獲得了較高的表達(dá)，其相應(yīng)的表達(dá)產(chǎn)物均具有纖溶酶原激活劑作用，與同類由金葡菌染色體DNA克隆的Sak基因的表達(dá)水平(10-15％)相比提高了近1.7倍，達(dá)到40％的高效表達(dá)。該表達(dá)產(chǎn)物重組葡激酶，與臨床常用的鏈激酶和t-PA相比，它不僅安全性較好，而且具有溶栓快，效果好，用藥量少等優(yōu)點，其可用于治療心肌梗塞、深度靜脈血栓、肺栓塞、急性或亞急性外周動脈血栓和慢性動脈栓塞以及中央視網(wǎng)膜動脈或靜脈栓塞等疾病。
本發(fā)明的實施例結(jié)合


，進(jìn)一步詳細(xì)描述，本發(fā)明保護(hù)范圍不僅局限于實施例中。
圖1為金葡菌SL1.063菌株在甘露醇高鹽瓊脂平皿上的菌落特征。
圖2為金葡菌SL 1.063菌株在卵黃高鹽瓊脂平皿上菌落特征。
圖3為金葡菌SL 1.063菌株在血瓊脂平皿上溶血現(xiàn)象。
圖4為金葡菌SL 1.063菌株耐熱核酸酶試驗。
圖5-1為金葡菌SL 1.063菌株中的Sak，以人纖維蛋白標(biāo)準(zhǔn)平皿檢測結(jié)果。
圖5-2為金葡菌SL 1.063菌株中的Sak，以人纖維蛋白加熱平皿檢測結(jié)果。
圖6為重組質(zhì)粒pUK408高表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建流程圖。
圖7為重組質(zhì)粒PHK408高表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建流程圖。
圖8為工程菌TG2(pHK408)高效表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE(12％)電泳分析圖。
本發(fā)明使用的大腸桿菌菌株及其基因型如下大腸桿菌菌株基因型JM109endA1，recA1，gyrA96，thi，hsdR17(rk-，mk+)，relA1，supE44，D(lac-proAB)，[F′，traD36，proAB，lacφZDM 15]DH5α f80dlacZDM15，recA1，endA1，gyrA96，thi-1，hsdR17(rk-，mk+)，supE44，relA1，deoR，D(lacZYA-argF)U169TG1 F′traD36laclqD(lacZ)M 15proA+B+/supED(hsdM-mcrB)5(rk-mk-McrB-)thiD(lac-proAB)TG2 supEhsdD5thiD(lac-proAB)D(srl-recA)306Tn 10(tetr)F′[traD36 proAB+lacIqlacZDM15]
本發(fā)明實施例如下1、金葡菌(Staphylococcus aureus)的分離、鑒定和產(chǎn)葡激酶(Staphylokinase，Sak)菌株篩選為分離金葡菌，從醫(yī)院外科、眼科和耳鼻喉等科采集了90多個樣品，以稀釋法或劃線法，接種在蛋黃氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基上，36℃培養(yǎng)24-48小時，挑取金黃色或檸檬色、周圍培養(yǎng)基呈珍珠光澤白色沉淀的菌落，接入普通營養(yǎng)培養(yǎng)基中，36℃培養(yǎng)過夜，革蘭氏染色、鏡檢，選擇G+菌體呈球形并堆積成葡萄狀、無芽孢菌株，在蛋黃培養(yǎng)基上作進(jìn)一步純化。純化菌株分別接在高鹽甘露醇瓊脂培養(yǎng)基上，36℃培養(yǎng)24-48小時，菌落周圍出現(xiàn)光亮的黃色圓環(huán)。經(jīng)分離、純化、鑒定，共得到167株金葡菌，其形態(tài)和培養(yǎng)特征如下革蘭氏染色為陽性，菌體為球形、堆積成葡萄狀、無芽孢，菌體大小通常為0.8-0.9μm。
培養(yǎng)特征在甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基上，36℃培養(yǎng)24-48小時，菌落為金黃色，圓形凸起，外圍為微黃色環(huán)，如圖1。
在卵黃高鹽瓊脂培養(yǎng)基上，36℃培養(yǎng)24-48小時，菌落為金黃色或檸檬色，其周圍呈白色月暈狀油膜，如圖2，表明該菌株具有產(chǎn)卵磷脂酶的能力，此即金葡菌特征之一。
在血瓊脂平皿上劃線，36℃培養(yǎng)18-24小時，菌落周圍呈現(xiàn)透明的溶血環(huán)，即β型溶血環(huán)，見圖3。
為了測定是否產(chǎn)耐熱核酸酶，將供試菌株在普通營養(yǎng)培養(yǎng)液中37℃培養(yǎng)18-24小時，菌液煮沸10分鐘，點入甲苯胺蘭DNA瓊脂平皿的小孔中，37℃保溫3-5小時，陽性者均產(chǎn)生粉紅圓環(huán)，見圖4。圖4中1，4為生理鹽水；2，6為SL1.02菌株發(fā)酵上清液；3，5，7，為SL1.063菌株發(fā)酵上清液。
血漿凝固酶試驗取兔血漿生理鹽水(1∶1)與等體積各菌株普通營養(yǎng)培養(yǎng)液混合。對照為等體積的生理鹽水。37℃保溫過夜，陽性對照與試驗菌株血漿均凝固，對照管血漿流動自如。
本發(fā)明使用的培養(yǎng)基卵黃高鹽瓊脂培養(yǎng)基蛋白胨10g牛心浸液 10g甘露醇10g卵黃懸液 100gNaCl 70g瓊脂 15gLiCl 5g 蒸餾水 890g甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基蛋白胨 10g甘露醇 10g牛肉膏 1gNaCl75g酚紅0.025g瓊脂15g蒸餾水 1000ml普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基蛋白胨10g牛肉膏3gNaCl 5g瓊脂 15g蒸餾水1000ml以上培養(yǎng)基調(diào)pH7.2，121℃滅菌20分鐘。甲苯胺蘭(Toluidine blue)DNA瓊脂平皿魚精DNA 0.03gNaCl 1.00g瓊脂 1.00g2％甲苯胺蘭 0.3ml0.01M CaCl 0.1ml0.05M Tris-HCl(pH9.0)100ml121℃滅菌15分鐘。
為了篩選產(chǎn)葡激酶的金葡菌，將167株，取其單菌落接在3mlLB液體培養(yǎng)基試管中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，離心4000rpm 5分鐘，上清液作為粗酶液，取10μl點在人血纖維蛋白平皿中，37℃保溫16小時，現(xiàn)察是否有透明圓形成。經(jīng)多次重復(fù)，證明金葡菌SL1.063菌株產(chǎn)Sak水平最高。為了確認(rèn)這是葡激酶活性還是蛋白酶活性，按同樣方法制做了兩個相同的人血纖維蛋白平皿，一個加熱85℃、40分鐘。另一個按常規(guī)作為標(biāo)準(zhǔn)平皿，見圖5-1，打孔后，分別點10μl發(fā)酵上清液，37℃保溫16小時。結(jié)果是在標(biāo)準(zhǔn)平皿上，3，5號為SL1.063粗酶液；1，2號分別為尿激酶和t-PA；4號為蚓激酶，均產(chǎn)生透明圈。在加熱平皿上，見圖5-2所示，除4號蚓激酶產(chǎn)生透明圈外，3，5號SL 1.063粗酶液與尿激酶和t-PA一樣，均無透明圈，結(jié)果表明SL 1.063的酶是通過激活纖溶酶原產(chǎn)生纖溶酶水解纖維蛋白，經(jīng)85℃加熱40分鐘處理，使纖溶酶原全部失活，因而， SL 1.063產(chǎn)生的酶像尿激酶和t-PA一樣在加熱纖維平皿上不再產(chǎn)生透明圈。2、SL 1.063 Sak基因的克隆(1)金葡菌染色體DNA制備將菌株單菌落接種在25ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培過夜，離心4000rpm、8分鐘收集菌體，菌體懸浮在2.5mlGTE溶液(50mM Glucose-50mM Tris-HCl-10mM EDTA，pH8.0)中。加溶菌酶終濃度為10mg/ml，37℃保溫60分鐘，加300μl的10％SDS，RNase A(10mg/ml)和RNase T1(2000U/ml)各40μl，37℃保溫60分鐘，加等體積苯酚-氯仿-異戊醇(12∶12∶1)抽提三次，對界面上的白色膜以等體積的TE溶液(20mM Tris-HCl(pH8.0)-1mMEDTA)反抽提兩次，水相合并后，加入1/10體積3M NaCl和2倍體積的95％乙醇，以玻棒攪出纖維狀的DNA，以70％乙醇和無水乙醇沖洗各兩次，趕掉乙醇。DNA溶在適量的TE溶液中，濃度約0.2μg/μl。經(jīng)SDS-PAGE檢查，沒有RNA存在。(2)引物設(shè)計參考已知的Sak基因的結(jié)構(gòu)，設(shè)計了若干個引物，并引入適當(dāng)?shù)南拗泼盖形稽c。
引物酶切位點核苷酸序列(5′→3′)鍵長P-Nm1EcoRICGCGAATTCATGTCAAGTTC 32ATTCGACAAAGGP-C BamH1CGCGGATCCTATTTCTTTTCT34ATAACAACCTTTG(3)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)系統(tǒng)組成 反應(yīng)液(μl)1.SL 1.063模版DNA(0.2μg/μl)3.02.引物P-Nml(33pmol/μl)3.03.引物P-C(33pmol/μl)3.04.10×PCR緩沖液 5.05.4×dNTP(2mM) 4.06.ddH2O 31.07.Taq DNA聚合酶(2.5U/μl)1.0
1-6混勻，變性處理95℃、7分鐘，然后加Taq DNA聚合酶混勻，在Progene PCR循環(huán)儀中，進(jìn)行擴(kuò)增。
延伸反應(yīng)10分鐘。(4)DNA片段的分離、純化、酶切、連接與轉(zhuǎn)化①純化經(jīng)1.5％Agarose電泳檢查，在360mn波長下，切下擴(kuò)增DNA片段。采用Genelute Agarose Spin Columns方法純化PCR擴(kuò)增的DNA片段。DNA溶于20μlTE(PH8.0)溶液中。
②酶切酶切反應(yīng)液(μl)DNA片段 2010×緩沖液 5EcoRI (20U/μl)2BamH1(12U/μl)3ddH2O 2037℃、2小時。
再以Genelute Agarose Spin Columns方法純化，將DNA片段溶于20μl TE中。
③連接pUC 19質(zhì)粒提取參照Sambrook等人的方法。按上述方法，以EcoRI和BamH1酶切pUC19質(zhì)粒，經(jīng)Genelute AgaroseSpin Columns方法純化。與經(jīng)EcoRI和BamH1酶切的Sak基因連接，16℃保溫12小時。
④轉(zhuǎn)化根據(jù)Sambrook等人的方法，感受態(tài)菌株為鈣離子處理的DH5α或JM109，涂在平皿上培養(yǎng)過夜。以x_gal試驗檢測，挑出白色菌落，接入LB-AP液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒DNA，以EcoRI和BamH1酶切，經(jīng)1.5％Agarose電泳檢查，有431bp DNA片段區(qū)帶，證明已經(jīng)得獲得pUK408重組質(zhì)粒，見圖6所示流程。(5)DNA序列測定
重組質(zhì)粒DNA的提取，采取堿性SDS裂解細(xì)胞PEG NaCl方法，經(jīng)7％Agarose凝膠電泳檢查，基本上不含RNA，可供DNA序列測定用。DNA序列測定采用的是T7聚合酶測序系統(tǒng)(Promega公司產(chǎn)品)，結(jié)果如前所述序列。
已有報道的不同來源的Sak基因序列及其酶蛋白氨基酸同源性均很高。然而，在第34和43位的密碼子及其編碼的氨基酸往往有所不同。由表一可以看出，本發(fā)明的Sak63在這些位點上的密碼子及其編碼的氨基酸，不僅不同于噬菌體DNA來源的Sak s-c和Sak42D基因，而且也不同于金葡菌染色體DNA的Sak star基因。本發(fā)明Sak63第34位編碼的是甘氨酸，Sak star是絲氨酸；本發(fā)明Sak63第43位編碼的是精氨酸，而Sak star是組氨酸。顯然，本發(fā)明提供的Sak63是一個新的葡激酶基因。(6)高效表達(dá)質(zhì)粒pHK408的構(gòu)建按圖7的流程構(gòu)建高效表達(dá)質(zhì)粒pHK408。質(zhì)粒DNA的制備參考Sambrook等人的方法。取DH5α(pUK408)質(zhì)粒單菌落，接于LB-AP液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。以堿性SDS處理裂解大腸桿菌細(xì)胞，以PEG-NaCl沉淀掉RNA，得到質(zhì)粒DNA。經(jīng)SDS-PAGE檢查，基本上不含RNA。以EcoRI和BamH1酶切pUK408 DNA，經(jīng)1.5％Agarose電泳分離，切下小片段DNA，按Genelute Agarose Spin Columns方法，得到純化DNA。
pUV606載體質(zhì)粒，按上述方法分離純化。以EcoRI和BamH1雙酶切。
ddH2O36μl10×buffer 5μl質(zhì)粒DNA(0.5μg/μl)5μlEcoRI(20U/μl) 2 μlBamH1(12U/μl) 2μl37℃保溫2小時。
酶切反應(yīng)液走0.7％Agarose電泳，在長波長紫外燈下切下DNA大片段。按Genelute Agarose Spin Columns方法純化。將上述基因片段與pUV606質(zhì)粒DNA進(jìn)行連接，16℃反應(yīng)12小時，轉(zhuǎn)入DH5α受體菌。提取重組質(zhì)粒DNA，經(jīng)EcoRI和BamH1雙酶切，走1.2％Agarose凝膠電泳，確認(rèn)DNA基因片段的插入。將含重組質(zhì)粒的DH5α(pHK408)菌株，接入LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，離心取上清液，點在人血纖維蛋白平皿上37℃保溫16小時，產(chǎn)生透明圈，確認(rèn)該菌株能夠表達(dá)產(chǎn)生葡激酶。(7)工程菌TG2(pHK408)的高效表達(dá)pHK408質(zhì)粒轉(zhuǎn)入不同的大腸桿菌菌株，如JM109、DH5α、TG1或TG2均有較高的表達(dá)水平。
工程菌TG2(pHK408)接種于50ml PY培養(yǎng)基中(1000ml、16g胰蛋白胨，5g酵母粉，5g NaCl，PH7.2)30℃振蕩培養(yǎng)6小時，立即升溫至42℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)5-6小時，離心收集菌體。菌體懸浮在5mlTSE溶液中(20mM Tris-HCl-50mM NaCl-10mM EDTApH8.0)，用JY92-II型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行超聲處理，離心收集上清液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。電泳完畢，將電泳凝膠板取下，貼在預(yù)先制成的含有人纖溶酶原的纖維平板上，拷貝約10-20分鐘后，取出電泳凝膠進(jìn)行考馬斯亮蘭染色。纖維平板室溫放置或37℃保溫約20分鐘，即在葡激酶處出現(xiàn)透明區(qū)帶。
為了考察工程菌TG2(pHK408)表達(dá)產(chǎn)物Sak在大腸桿菌可溶蛋白的比例，超聲波細(xì)胞破碎上清液，走SDS-PAGE電泳?？捡R斯亮蘭染色，褪色至背景清晰后，用Pharmacia Image MasterSoftware and Sharp J×330 Scanner掃描儀進(jìn)行凝膠掃描，如圖8所示。圖8中1，9為細(xì)胞色素C(W.M 13370)2，10為RNaseA(W.M.15000)；3為未誘導(dǎo)DH5α(pHK408)全細(xì)胞裂解液；4為未誘導(dǎo)DH5α(pHK408)細(xì)胞超聲破碎上清液；5為未誘導(dǎo)DH5α(pHK408)細(xì)胞超聲破碎沉淀；6為誘導(dǎo)的DH5α(pHK408)全細(xì)胞裂解液；7為誘導(dǎo)DH5α(pHK408)細(xì)胞超聲破碎上清液；8為誘導(dǎo)DH5α(pHK408)細(xì)胞超聲破碎沉淀。葡激酶區(qū)帶在細(xì)胞破碎上清液總蛋白各區(qū)帶中約占40％?？梢?，這個表達(dá)系統(tǒng)十分有效。
權(quán)利要求
1.一種葡激酶基因，其特征在于該基因是由金葡菌SL1.063菌株的染色體DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得的，該基因的核苷酸全序列及其編碼的氨基酸如下序列TCA AGT TCA TTC GACAAAGGA AAA TATAAASer Ser Ser Phe AspLysGly Lys TyrLys10AAA GGC GAT GAC GCGAGTTAT TTT GAACCALys Gly Asp Asp AlaSerTyr Phe GluPro20ACA GGC CCG TAT TTGATGGTA AAT GTGACTThr Gly Pro Tyr LeuMetVal Asn ValThr30GGA GTT GAT GGT AAGGGAAAT GAA TTGCTAGly Val AspGly34LysGlyAsn Glu LeuLeu40TCC CCT CGT TAT GTCGAGTTT CCT ATTAAASer ProArg43Tyr ValGluPhe Pro IleLys50CCT GGG ACT ACA CTTACAAAA GAA AAAATTPro Gly Thr Thr LeuThrLys Glu LysIle60GAA TAC TAT GTC GAATGGGCA TTA GATGCGGlu Tyr Tyr Val GluTrpAla Leu AspAla70ACA GCA TAT AAA GAGTTTAGA GTA GTTGAAThr Ala Tyr Lys GluPheArg Val ValGlu80TTA GAT CCA AGC GCAAAGATC GAA GTCACTLeu Asp Pro Ser AlaLysIle Glu ValThr90TAT TAT GAT AAG AATAAGAAA AAA GAAGAATyr Tyr Asp Lys AsnLysLys Lys GluGlu100ACG AAG TCT TTC CCTATAACA GAA AAAGGTThr Lys Ser Phe ProIleThr Glu LysGly110TTT GTT GTC CCA GATTTATCA GAG CATATTPhe Val Val Pro AspLeuSer Glu HisIle120AAA AAC CCT GGA TTCAACTTA ATT ACAAAGLys Asn Pro Gly PheAsnLeu Ile ThrLys130GTT GTT ATT GAA AAGAAAVal Val Ile Glu LysLys136
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述葡激酶基因的高表達(dá)工程菌株，其特征在于由產(chǎn)葡激酶活性高的菌株(SL1.063)的染色體模板DNA，采用引物P-Nm1和引物P-C經(jīng)PCR擴(kuò)增，得到完整的葡激酶基因DNA小片段；該基因DNA片段與pUC19載體質(zhì)粒，分別以EcoR I和BamH1酶切；再將酶切的上述質(zhì)粒和葡激酶基因DNA小片段，用T4DNA連接酶連接獲得pUK408質(zhì)粒DNA，再轉(zhuǎn)化入DH5α或JM109大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，構(gòu)建成葡激酶高表達(dá)的工程菌株DH5α(pUK408)或JM109(pUK408)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述葡激酶基因的高表達(dá)工程菌株，其特征在于所述的引物P-Nm1，其核苷酸序列5′-CGCGAATTCATGTCAAGTTCATTCGACAAAGG-3′，鍵長32；所述的引物P-C，其核苷酸序列5′-CGCGGATCGTATTTCTTTTCTATAACAACCTTTG-3′，鍵長34。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述葡激酶基因的高表達(dá)工程菌株，其特征在于所述的pUK408重組質(zhì)粒DNA，還可與另一種pUV606載體質(zhì)粒，分別經(jīng)EcoRI和BamH1酶切pUK408重組質(zhì)粒產(chǎn)生的小片段DNA，和酶切pUV606的大片段DNA，通過T4DNA連接酶連接成pHK408質(zhì)粒DNA，轉(zhuǎn)化入DH5α或TG1或TG2大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，構(gòu)建成含重組質(zhì)粒pHK408的葡激酶高表達(dá)的工程菌株DH5α(pHK408)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種葡激酶(Sak)基因及其高表達(dá)工程菌株。以產(chǎn)Sak的金葡菌染色體DNA為模板,經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得編碼Sak基因。該基因序列第34和43位編碼的氨基酸,不同于已報道的Sak基因。并采用特定核苷酸序列的引物進(jìn)行擴(kuò)增,獲得重組DNA片段,經(jīng)純化、鑒定、酯切、連接。轉(zhuǎn)化入宿主細(xì)胞,構(gòu)建成Sak高表達(dá)工程菌株,表達(dá)產(chǎn)物具有纖溶酶原激活劑作用,對人纖維蛋白有很高的水解活性?？芍委熜募」Ｈ?腦、肺血栓等栓塞性疾病。
文檔編號C12N15/58GK1180106SQ97105988
公開日1998年4月29日 申請日期1997年7月19日 優(yōu)先權(quán)日1997年7月19日
發(fā)明者張其玖, 張貴才, 徐廣峰, 曲桂武, 別立亮, 徐婉學(xué), 吳允山 申請人:白寒三