一種溶桿菌屬菌株及其液體發(fā)酵培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物防治技術(shù)領(lǐng)域，提供一種溶桿菌屬菌株及其液體發(fā)酵培養(yǎng)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]高效、低毒、低殘留的微生物農(nóng)藥已取得顯著的生態(tài)和社會效益，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有巨大的經(jīng)濟(jì)價值。已有研宄報道，眾多生防細(xì)菌在其生長發(fā)育過程中會產(chǎn)生許多拮抗性或者競爭性的代謝產(chǎn)物(包括多種抗生素類、酶類、揮發(fā)類成分)，具有阻礙或者殺死病原菌的效果，生防效果極佳。因此，從生防細(xì)菌中尋找農(nóng)用活性的抗菌物質(zhì)有著極為廣闊的應(yīng)用前景。
[0003]溶桿菌屬細(xì)菌首次于1973年報道，1978年命名，廣泛存在于土壤、水體和深海海綿，有較好的定殖活性，對許多植物病原真菌、病原細(xì)菌、水藻以及線蟲等都有很強(qiáng)的拮抗作用，是一類具有極大生防潛力的生防菌。
[0004]從1978確立Lysobacter屬以來，已報道的大多數(shù)Lysobacter屬菌株具有很強(qiáng)的措抗病原真菌、病原細(xì)菌、線蟲和綠藻的能力。部分Lysobacter屬菌株如Lysobacterenzymogens C3已經(jīng)用于生物防治。因此，挖掘具有重大生防前景的Lysobacter屬菌株資源具有重要的理論與實踐意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種溶桿菌屬菌株及其液體發(fā)酵培養(yǎng)方法，本發(fā)明針對生產(chǎn)實踐中的問題和需求，篩選出一株活性高、抗菌譜廣，對環(huán)境安全的新型生防細(xì)菌菌株。同時，本發(fā)明提供了該菌株的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法，該菌株的液體發(fā)酵方法操作簡單、環(huán)境友好，能夠?qū)崿F(xiàn)該菌株的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)，減少化學(xué)農(nóng)藥對環(huán)境的污染，更好的防治農(nóng)業(yè)植物病害。
[0006]為實現(xiàn)本發(fā)明的目的采用的技術(shù)方案是:
[0007]一種溶桿菌屬菌株，該溶桿菌屬菌株命名為Lysobacteryananisis sp.SNNU 513，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，保藏日期為2013年10月21日，菌種保藏號為CGMCC N0.8375。
[0008]該溶桿菌菌株為革蘭氏染色陰性的溶桿菌屬Lysobacter菌株。
[0009]一種溶桿菌菌株的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法，包括以下步驟:
[0010]I)將保藏號為CGMCC N0.8375的菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，在30°C，180r/min條件下振蕩培養(yǎng)48h至對數(shù)期，得到種子液；
[0011]2)按10mL接種ImL的比例，將種子液接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在溫度30°C，轉(zhuǎn)速180r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)72h，得到溶桿菌SNNU 513的發(fā)酵液。
[0012]步驟I)所述的種子液中的含有的溶桿菌SNNU 513的菌落數(shù)為I X 108CFU/mL。
[0013]步驟2)所述的發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到2.1 X 109CFU/mL。
[0014]每升LB液體培養(yǎng)基中含有:蔗糖32.46g、酵母提取物4g、胰蛋白胨4.30g、(NH4)2SO4 8.65g、CO (NH2)2 3g、K2HPO4 9g、MgSO4.7H20 2.4g、ZnSO4.7H20 0.2g、FeSO4.H2O0.02g、CuSO4.5H20 0.005g、CaCl2.H2O 0.12g、NaCl 2.4g、泛酸鈣 6mg、肌醇 15mg、核黃素3mg、維生素B6 0.05mg，其余為蒸餾水；LB液體培養(yǎng)基的初始pH值為7.0
[0015]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果:
[0016]本發(fā)明公開了一種溶桿菌屬菌株，命名為Lysobacter sp.SNNU 513，試驗證明，菌株SNNU313產(chǎn)生的包括可溶性溶胞壁質(zhì)轉(zhuǎn)糖基酶(soluble lytic mure intransglycosylase)、裂解轉(zhuǎn)糖基酶(lytic transglycosylase)、α -水解蛋白酶(a -Lyticprotease)和水解蛋白酶(β-lytic protease)等多種胞外蛋白水解酶，能有效抑制很多病原真菌和病原細(xì)菌的生長，具有很好的生防應(yīng)用前景。
[0017]本發(fā)明還提供了該生防菌株SNNU513的液體發(fā)酵培養(yǎng)方法，以LB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，經(jīng)優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法培養(yǎng)該細(xì)菌，優(yōu)化后的細(xì)菌生物量顯著增高，搖瓶培養(yǎng)至生長對數(shù)期減少24h，同時，發(fā)酵優(yōu)化后的胞外蛋白含量明顯高于用LB培養(yǎng)基所產(chǎn)的蛋白含量，非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果顯示，發(fā)酵優(yōu)化后胞外蛋白電泳條帶比LB培養(yǎng)基得到的胞外蛋白電泳條帶相對較多。同體積的菌液及其上清液中的蛋白質(zhì)抑菌效果均有增強(qiáng)。能夠證明該液體發(fā)酵培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法成本低、效果佳，菌株本身及發(fā)酵培養(yǎng)基成分無污染、環(huán)境安全，易于大規(guī)模生產(chǎn)與推廣。
【附圖說明】
[0018]圖1溶桿菌Lysobacter sp.SNNU 513的掃描電鏡照片；
[0019]圖2溶桿菌Lysobacter sp.SNNU 513措抗蘋果干腐病原真菌的光學(xué)顯微鏡與掃描電鏡照片；
[0020]圖3溶桿菌與已鑒定Lysobacter屬細(xì)菌16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹；
[0021]圖4不同培養(yǎng)溫度對SNNU 513菌株生長影響曲線圖；
[0022]圖5不同培養(yǎng)轉(zhuǎn)速對SNNU 513菌株生長影響柱狀圖；
[0023]圖6響應(yīng)面立體分析圖和相應(yīng)等高圖；其中，(a)蔗糖和(MM)2SO4對菌體數(shù)產(chǎn)量交互影響的三維曲面圖；(b)蔗糖和(MM)2SOJt菌體數(shù)產(chǎn)量交互影響的等高線圖；(c)蔗糖和胰蛋白胨對菌體數(shù)產(chǎn)量交互影響的三維曲面圖；(d)蔗糖和胰蛋白胨對菌體數(shù)產(chǎn)量交互影響的等高線圖；(e) (NH4)2SOJP胰蛋白胨對菌體數(shù)產(chǎn)量交互影響的三維曲面圖；(f)(NH4)2SO4和胰蛋白胨對菌體數(shù)產(chǎn)量交互影響的等高線圖；
[0024]圖7培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法優(yōu)化前后SNNU 513生長曲線圖(F-發(fā)酵優(yōu)化后的細(xì)菌生長曲線，L-LB培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)菌生長曲線)；
[0025]圖8培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法優(yōu)化前后菌株SNNU513抑菌活性圖譜(A、B為優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基得到的菌液抑菌圖，a、b為LB培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的菌液抑菌);
[0026]圖9培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法優(yōu)化前后SNNU 513胞外蛋白質(zhì)含量對比圖
[0027]圖10培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法優(yōu)化前后SNNU 513胞外蛋白SDS-凝膠電泳結(jié)果圖(F為發(fā)酵優(yōu)化后培養(yǎng)基得到的胞外分泌蛋白電泳圖譜，L為LB培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的的胞外蛋白電泳圖譜)；
[0028]圖11培養(yǎng)基及其發(fā)酵方法優(yōu)化前后SNNU513胞外分泌蛋白抑菌活性圖，A為發(fā)酵優(yōu)化后培養(yǎng)基得到的蛋白抑菌圖，B為LB培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的蛋白抑菌圖?！揪唧w實施方式】:
[0029]為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，下面結(jié)合具體的附圖和實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例是對本發(fā)明的解釋而不是限定。
[0030]1、菌株 Lysobacter sp.SNNU513
[0031]本發(fā)明是從藥用植物遠(yuǎn)志(Polygala tenuifolia Willd)根部分離、純化、篩選獲得一株具有廣譜抗菌活性的細(xì)菌，經(jīng)鑒定為溶桿菌屬細(xì)菌，命名為Lysobactersp.SNNU513(NCBI JF445288.1)。16SrDNA基因序列同源比對分析和系統(tǒng)的進(jìn)化分析表明，該菌株與 Lysobacter enzymogenes DSM2043T(99% )的同源性最高，屬于 Lysobacter屬。根據(jù) Srinivasan 等人(Int J Syst Evol Microb1l.2010, 60:1543-1547)的方法對該菌株的關(guān)鍵生理生化特征進(jìn)行全面測定，結(jié)果表明該菌株主要生物學(xué)特性為:革蘭氏染色陰性、桿狀、氧化酶陽性、過氧化氫酶陰性。菌體主要脂肪酸為iso-C15:0、iso-C16:0,iso-C17:1 ω 9c和iso-Cl1:03-0H。主要磷脂類為:PE (磷脂酰乙醇胺)、PG(磷脂酰甘油)和PME (磷脂酰甲基乙醇胺)。泛醌類化合物主要成分為Q-8?；蚪MDNA G+C含量為66.5%。這些特性完全符合Lysobacter屬細(xì)菌的特征。鑒定后的菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，菌種保藏號:CGMCC N0.8375)和美國典型培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collect1n，ATCC)(菌種保藏號:ATCC BAA-2621?) ο
[0032]2、一種溶桿菌屬菌株的液體發(fā)酵工藝優(yōu)化方法
[0033]I)將保藏號為CGMCC N0.8375的菌株接種于LB培養(yǎng)基中，在30°C，180r/min下振蕩培養(yǎng)搖床培養(yǎng)48h至對數(shù)期，得到種子液；
[0034]2)按10mL接種ImL的比例，將上述培養(yǎng)好的種子液接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:蔗糖32.46g、酵母提取物4g、胰蛋白胨4.30g、(NH4)2SO4 8.65g、CO(NH2)22g,K2HPO4 9g、MgS04.7Η20 2.4g、ZnSO4.7H20 0.2g、FeS04.Η20 0.02g、CuSO4.5H20 0.005g、CaCl2.H2O 0.12g、NaCl 2.4g、泛酸 1? 6mg、肌醇 15mg、核黃素 3mg、維生素 B6 0.05mg，其余為蒸餾水，初始pH值為7.0。
[0035]3)在發(fā)酵培養(yǎng)過程中，振蕩速度為180r/min，發(fā)酵溫度為30°C，培養(yǎng)時間為72h，發(fā)酵結(jié)束后菌體數(shù)量達(dá)到2.lX109CFU/mL。
[0036]實施例1
[0037]Lysobacter sp.SNNU 513τ菌株的分離、純化與鑒定
[0038](I)菌株分離:
[0039]藥用植物遠(yuǎn)志采集于海拔100m左右的陜西省延安市，本實驗室嚴(yán)格按照內(nèi)生菌的分離方法，在無菌條件下，將消毒后的根部切取0.5X0.5cm的小塊，置于含有鏈霉素的PDA培養(yǎng)基中，在26?30°C下，培養(yǎng)2?3天，分離得到溶桿菌屬SNNU 513的菌落，以無菌水為對照，漂洗液檢驗法驗證。
[0040](2)菌株純化:
[0041]根據(jù)初分菌落的形態(tài)特征，用接種針挑取SNNU 513的菌落，通過平板劃線法及四分法，反復(fù)劃線，得到表面光滑、邊緣整齊，大小為0.1?0.3cm，顏色為乳白色的單一形態(tài)特征的菌株，即SNNU 513To得到單一形態(tài)特征的菌株，用20%的甘油保存于-80°C超低溫冰箱備用，除了實驗室自己保存菌株以外，還將菌株保存于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心和美國典型微生物保藏中心。
[0042](3)菌株鑒定:
[0043]參照Srinivasan 等人(Int J Syst Evol Microb1l.2010, 60:1543-1547)的方法對分離純化后的菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)分析(桿狀，參見圖1掃描電鏡)、關(guān)鍵生理生化試驗(革蘭氏染色陰性、氧化酶陽性、過氧化氫酶陰性、基因組DNA G+C含量66.5%、菌體主要的脂肪酸為 iso-C15:0, iso-C16:0, iso-C17:lo9c 和 iso-Cll:03_0H。菌體主要的磷脂類為磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油和磷脂酰甲基乙醇胺，泛醌類化合物主要成分為Q-8)、16S rDNA序列分析與Lysobacter enzymogenes DSM2043DNA雜交等進(jìn)行系統(tǒng)分析，該菌株被鑒定為溶桿菌屬(Lysobacter)菌株，表現(xiàn)出一些特殊的生物學(xué)特性，命名為Lysobactersp.SNNU513。平板對峙試驗表明，SNNU513菌株對稻瘟病菌、番茄灰霉菌、小麥紋枯菌、番茄早疫霉菌、蘋果干腐菌、灰霉菌、小麥全蝕菌、鏈格胞菌和水稻紋枯病菌等植物病原菌有很強(qiáng)的拮抗作用，是一種新型的生防細(xì)菌。圖2為SNNU 513拮抗蘋果干腐病菌過程中菌絲的變化過程，圖中，A、B、C、D為光學(xué)顯微鏡下觀察菌株SNNU513對蘋果干腐病菌(Botryos