專利名稱：一種糖化酶及其重組表達菌株的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于微生物工程技術領域，具體涉及一種糖化酶及用于表達該糖化酶的重組表達工程菌。
背景技術：
糖化酶,又稱葡萄糖淀粉酶(Glucoamylase),它能把淀粉從非還原性未端水解α -1. 4葡萄糖苷鍵產生葡萄糖，也能緩慢水解a-1. 6葡萄糖苷鍵，轉化為葡萄糖。同時也能水解糊精，糖原的非還原末端釋放β-D-葡萄糖。糖化酶用于以葡萄糖作發(fā)酵培養(yǎng)基的各種抗生素、有機酸、氨基酸、維生素的發(fā)酵；本品還大量用于生產各種規(guī)格的葡萄糖?？傊?，凡對淀粉、糊精必需進行酶水解的工業(yè)上，都可適用。 我國高轉化率糖化酶市場發(fā)展迅速，產品產出持續(xù)擴張，國家產業(yè)政策鼓勵高轉化率糖化酶產業(yè)向高技術產品方向發(fā)展。2011年國內糖化酶的市場容量為5億元人民幣，而且市場以每年20%速度在增長。預計2012年市場容量不低于6億元。糖化酶價格則自2007年起不斷上漲，由2元/公斤漲到2. 7元/公斤。因此，國內企業(yè)新增糖化酶投資項目也逐漸增多。目前常用的糖化酶均是來自黑曲霉。自70年代中期開始，中科院微生物所篩選獲得了高產糖化酶菌株AS. 3. 4309。該菌株國內許多大型抗生素制藥廠、酒精廠、釀酒廠進行了生產規(guī)模試驗，均獲得成功。該項目的成功為我國發(fā)酵行業(yè)節(jié)約了大量的糧食，產生了巨大的經濟效益和社會效益。市場越來越密切關注高轉化率糖化酶，這使得克隆和表達高轉化率糖化酶成為研究的熱點之一。蛋白表達系統(tǒng)是黑曲霉，其產酶量(蛋白量)較高，但是受到糖化酶本身性質的影響，黑曲霉表達糖化酶的比活比較低，不能適應市場的需求。因此，開發(fā)性能優(yōu)良、比活高的糖化酶越來越受到各方的關注。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種新型糖化酶及其重組表達工程菌，并將篩選的糖化酶基因轉入里氏木霉(Trichoderma reesei)中進行表達,為實現(xiàn)糖化酶的高密度發(fā)酵生產奠定了基礎。本發(fā)明一方面提供一種新型的糖化酶，所述的糖化酶包括I)氨基酸序列為SEQ ID NO:1的糖化酶；2)在I)限定的氨基酸經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有糖化酶功能的，由I)衍生的蛋白質。用于編碼上述糖化酶的基因，其一種核苷酸序列為SEQ ID N0:2。本發(fā)明另一方面提供了一種表達載體，其包含上述編碼糖化酶的核苷酸。本發(fā)明另一方面提供了一種表達宿主細胞，其攜帶有表達上述糖化酶基因的表達載體。上述表達宿主細胞為里氏木霉(Trichoderma reesei)。
本發(fā)明所述糖化酶在里氏木霉工程菌中得到高效表達，酶活水平達到196U/mL。所述糖化酶能從糖鏈的非還原端高效分解α -1, 4-糖苷鍵，因此，能將其應用于全酶法生產葡萄糖的糖化過程。


圖1 :構建的表達載體質粒圖譜。圖2 :里氏木霉工程菌發(fā)酵上清液的SDS-PAGE電泳分析圖，其中箭頭所指為重組表達的糖化酶。
具體實施例方式以下實施例是為了更好地說明闡述本發(fā)明內容，本領域相關的技術人員可以借助實施例更好地理解和掌握本發(fā)明。但是，本發(fā)明的保護和權利要求范圍不限于所提供的案例。 實施例1繩狀青霉(Penicillium funiculosum)糖化酶基因的克隆1.1總DNA的提取將繩狀青霉(購自中國普通微生物囷種保減管理中心，囷株編號3. 3791)過夜培養(yǎng)，取適量菌體置于離心管中，13000 rpm離心5 min，棄上清；加入400 μ I抽提緩沖液(100mM Tris-HCl, IOOmMEDTA, 250 mM NaCl, 1%SDS);然后加 IOOmg石英砂或玻璃珠，在珠打儀劇烈振蕩2min左右；651水浴201^11后，加入20(^1 IOM NH4AC,冰浴IOmin ；13000rpm離心IOmin,取上清；加入2倍體積的無水乙醇，_20°C放置30min ；13000 rpm離心IOmin,棄上清；用70%乙醇洗滌2次；晾干，加入水溶解，于_20°C保存。1. 2基因克隆以繩狀青霉基因組為模板,采用Genome Walking方法克隆基因。Genome WalkingKit購自TaKaRa公司。本實驗根據已知的部分序列設計了六條SP引物，分別擴增5’端和3’端未知序列。SP引物如下其中5R-SP-l、5R-SP-2和5R-SP-3為擴增5’端SP弓丨物；而3F-SP-U3F-SP-2和3F-SP-3為擴增3’端SP引物。SP系列引物的具體序列如下表所示
5R-SP-1 Igatggggtmatggagcggaag
5R-SP-2~GCAAGGCTGGAAAGTAGAGTCATC 5R-SP-3~CAATGGTGMGAACGACGAGCC 3F-SP-1 ~CTCATCTCCAAACCGTGTCTAATCC 3F-SP-2~TACGGCTTTGATTGCCTATGGT 3F-SP-3~CTGATTATGCTCCAGGACAACGG第一輪反應組成基因組 DNA O. 5μ I ；dNTP 4μ I ； 10 X buffer 5 μ I ;AP 引物I μ I ；SP1 引物 I μ I ;Taq 酶 2μ I ；ddH20 36. 5 μ I。
第一輪反應條件為
權利要求
1.一種糖化酶，所述的糖化酶包括 1)氨基酸序列為SEQID NO:1的糖化酶； 2)在I)限定的氨基酸經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有糖化酶功能的，由I)衍生的蛋白質。
2.用于編碼上述糖化酶的基因，其核苷酸序列為SEQID N0:2。
3.一種重組表達載體，所述的重組表達載體用于表達權利要求1所述的糖化酶。
4.如權利要求3所述的重組表達載體，其特征在于所述的表達載體包含有權利要求2所述的基因。
5.一種用于表達權利要求1所述的糖化酶的表達宿主細胞，其特征在于，所述的宿主細胞攜帶有權利要求3所述的重組表達載體。
6.如權利要求5所述的表達宿主細胞，其特征在于所述的宿主細胞為里氏木霉(Trichoderma reesei)。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新型糖化酶及其重組表達工程菌，并將篩選的糖化酶基因轉入里氏木霉(Trichoderma reesei)中進行表達，構建了里氏木霉工程菌株。本發(fā)明所述糖化酶在里氏木霉工程菌中得到高效表達，酶活水平達到196U/mL，能從糖鏈的非還原端高效分解α-1,4-糖苷鍵，因此，有望將其應用于全酶法生產葡萄糖的糖化過程。
文檔編號C12R1/885GK103013956SQ201210500500
公開日2013年4月3日 申請日期2012年11月30日 優(yōu)先權日2012年11月30日
發(fā)明者黃亦鈞, 劉士成, 王華明, 張慧丹 申請人:青島蔚藍生物集團有限公司