專利名稱：一種分離、檢測(cè)黃曲霉的培養(yǎng)基及方法
—種分罔、檢測(cè)黃曲霉的培養(yǎng)基及方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于微生物分離技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種分離、檢測(cè)黃曲霉的培養(yǎng)基及方法。
背景技術(shù)：
黃曲霉毒素(Aflatoxin)主要由黃曲霉(Aspergillus flavus)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物， 是迄今發(fā)現(xiàn)的污染農(nóng)產(chǎn)品毒性最強(qiáng)的一類生物毒素。其中，毒性最強(qiáng)、危害最大的是BI毒素，其毒性為氰化鉀的10倍、砒霜的68倍，被列入嚴(yán)管的特劇毒物質(zhì)。黃曲霉毒素既有很強(qiáng)的急性毒性，導(dǎo)致肝臟壞死出血，使免疫系統(tǒng)受損，引起蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)不良癥并導(dǎo)致兒童發(fā)育受阻；也有明顯的慢性毒性，具有致癌、致畸、致突變作用，對(duì)人、家畜的健康威脅極大，因此受到世界范圍的廣泛關(guān)注。
據(jù)世界糧農(nóng)組織估計(jì)，世界范圍內(nèi)有25%的農(nóng)作物產(chǎn)品受真菌毒素的污染，其中主要就是黃曲霉毒素。在我國(guó)，農(nóng)產(chǎn)品黃曲霉毒素污染已成為影響食品安全重要隱患之一。 2006年，國(guó)家疾病預(yù)防控制中心營(yíng)養(yǎng)與食品安全所對(duì)我國(guó)部分農(nóng)產(chǎn)品(包括玉米、花生)中黃曲霉毒素污染情況調(diào)查發(fā)現(xiàn)，從江蘇、上海、浙江等九省市采集市售玉米中黃曲霉毒素的檢出率為70. 27%，平均含量為36. 51μ g/kg，最高為1098. 36 μ g/kg，并有14. 86%的玉米樣品中BI毒素含量超出國(guó)家食品法典限量標(biāo)準(zhǔn)?；ㄉ悬S曲霉毒素的檢出率為24. 24%, 平均含量為80. 27μ g/kg，最高為437. 09μ g/kg，有3. 03%的樣品中黃曲霉毒素含量超出國(guó)家限量標(biāo)準(zhǔn)。
2009年，農(nóng)業(yè)部飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(成都)對(duì)全國(guó)采集的1013份飼料樣品檢測(cè)發(fā)現(xiàn),99. 51%的樣品中檢測(cè)出黃曲霉毒素，除山東省91份飼料的黃曲霉毒素BI檢出率為94. 51%，其余各省的檢出率均達(dá)100%，被檢測(cè)樣品中有2. 27%的樣品黃曲霉毒素超標(biāo)。2010年中山大學(xué)對(duì)310名男生尿液進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)90名同學(xué)的尿液中黃曲霉毒素Ml 呈陽(yáng)性。
2011年，蒙牛牛奶中黃曲霉毒素Ml超標(biāo)，其原因是奶牛在食用霉變的飼料后，原奶中黃曲霉毒素Ml超標(biāo)所致?？梢?jiàn)，控制農(nóng)產(chǎn)品黃曲霉毒素污染已經(jīng)成為糧食安全和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中迫切需要解決的重大問(wèn)題。
由于黃曲霉毒素污染所帶來(lái)的巨大經(jīng)濟(jì)損失和健康危害，人們一直在努力探求黃曲霉毒素產(chǎn)生機(jī)理及防控方法。而研究材料黃曲霉菌株的獲取成為各項(xiàng)研究工作開(kāi)展的首要前提條件。由于從各類環(huán)境中收集的樣品尤其是土壤中微生物數(shù)量多、種類雜，給黃曲霉的分離帶來(lái)較大困難。因此建立一種省時(shí)省力、高效專一的從各類樣品中篩選黃曲霉的方法，將會(huì)對(duì)黃曲霉毒素產(chǎn)生機(jī)理及防控的研究有很大幫助。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種分離、檢測(cè)黃曲霉的培養(yǎng)基，能高效快速地從土壤或農(nóng)產(chǎn)品中特異分離黃曲霉。
一種分離、檢測(cè)黃曲霉的培養(yǎng)基，配方為酵母提取物8 12g/L、蔗糖8 12g/L、 NaCl 75 85g/L、瓊脂 25 35g/L、硫酸鹽 O. 01 O. 03g/L、氯硝胺 O. 01 O. 03g/L、抗生素 O.05 O. 15g/L。
更優(yōu)選的配方為酵母提取物9 llg/L、鹿糖9 llg/L、NaCl 78 82g/L、瓊脂 28 32g/L、硫酸鹽 O. 015 O. 025g/L、氯硝胺 O. 015 O. 025g/L、抗生素 O. 08 O. 12g/ L0
所述配方中，酵母提取物和蔗糖為微生物的生長(zhǎng)提供必不可少的氮源和碳源。黃曲霉生命力強(qiáng)，生長(zhǎng)速度快，酵母提取物和蔗糖已能滿足其生長(zhǎng)必需條件。但為了能從各種微生物環(huán)境復(fù)雜的樣品中特異篩選黃曲霉，本發(fā)明在酵母提取物和蔗糖的基礎(chǔ)上添加了一系列添加劑，使培養(yǎng)基具有選擇性，有利于黃曲霉的篩選。所述添加劑為氯化鈉、抗生素、 氯硝胺和硫酸鹽。
篩選過(guò)程中，樣品中細(xì)菌會(huì)影響黃曲霉的生長(zhǎng)，而培養(yǎng)基中氯化鈉和抗生素的存在可以有效抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。
培養(yǎng)基的滲透壓對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)影響較大，當(dāng)環(huán)境中滲透壓大于胞內(nèi)滲透壓時(shí)，細(xì)菌就會(huì)因失水而停止生長(zhǎng)或死亡。由于細(xì)菌與真菌細(xì)胞壁成分的差異，高濃度的氯化鈉能抑制多種細(xì)菌的生長(zhǎng)，而對(duì)真菌無(wú)影響或影響較小。
市售的抗生素種類多樣，本發(fā)明選用鏈霉素。
同樣地，為避免其他生長(zhǎng)較快的真菌對(duì)黃曲霉分離產(chǎn)生干擾，本發(fā)明的培養(yǎng)基中添加了適量的氯硝胺，氯硝胺能抑制除黃曲霉外大多數(shù)真菌的生長(zhǎng)。
除使用上述添加劑抑制雜菌的生長(zhǎng)外，還可以添加適量無(wú)機(jī)鹽促進(jìn)黃曲霉的生長(zhǎng)。研究表明，so42_在一定程度上能促進(jìn)黃曲霉生長(zhǎng)，因此，本發(fā)明的培養(yǎng)基中含有適量的硫酸鹽。硫酸鹽種類多樣，較佳地為CuSO4 · 5H20、ZnSO4 · 7H20或二者的混合物，更佳地為重量比為I : I的CuSO4 · 5H20和ZuSO4 · 7H20混合物。
由于所述的硫酸鹽、殺真菌劑和抗生素均不耐高溫，無(wú)法利用高溫滅菌，需通過(guò)細(xì)菌濾器過(guò)濾除菌后再加入經(jīng)高溫滅菌的其他組分中。在一個(gè)具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明所述培養(yǎng)基的配制方法為
(I)取酵母提取物，蔗糖，瓊脂，氯化鈉，完全溶解后定容，調(diào)節(jié)pH至7. 0，121°C滅菌 20min ；
(2)滅菌后待培養(yǎng)基溫度降至65°C以下、未凝固前，加入經(jīng)細(xì)菌濾器過(guò)濾除菌的 CuSO4 · 5H20(10g/L)溶液和 / 或 ZnSO4 · 7H20(10g/L)溶液，鏈霉素溶液(O. lg/mL)，氯硝胺溶液(4g/L);混勻后倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中備用。
本發(fā)明還提供了一種從土壤或農(nóng)作物中分離黃曲霉的方法，包括
(I)將土壤或農(nóng)作物樣品粉碎至細(xì)粉狀；
(2)將細(xì)粉狀樣品分散于所述培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)。
為提高分離效率，優(yōu)選地，在粉碎前將樣品進(jìn)行干燥處理。干燥處理能殺滅樣品中大多數(shù)細(xì)菌。所述靜置培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為25 30°C，培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)選為4 7天。
待有菌落長(zhǎng)出后，即可挑取單菌落到PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并對(duì)生長(zhǎng)的菌落作進(jìn)一步形態(tài)觀察和顯微鑒定。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為
(I)本發(fā)明的培養(yǎng)基簡(jiǎn)單易制，可從土壤或農(nóng)作物樣品中特異篩選黃曲霉，與現(xiàn)有分離曲霉的察氏培養(yǎng)基相比，專一性較高，大大提高了分離效率。
(2)現(xiàn)有技術(shù)中需先用無(wú)菌水洗滌樣品獲得原液，再進(jìn)行黃曲霉的分離；而本發(fā)明方法將樣品粉碎或研磨后直接用于黃曲霉的篩選，可同時(shí)對(duì)樣品表面和內(nèi)部的黃曲霉進(jìn)行有效篩選，大大提聞了分尚效率。
(3)采用本發(fā)明培養(yǎng)基和方法獲得的真菌菌落經(jīng)形態(tài)鑒定、顯微觀察、分子水平檢測(cè)證實(shí)均為黃曲霉，為后續(xù)相關(guān)研究工作的開(kāi)展提供了必不可少的研究材料。


圖I為土壤樣品在PDA(IA)和本發(fā)明培養(yǎng)基(IB)上的菌落生長(zhǎng)情況；
圖2為玉米樣品在PDA(2A)和本發(fā)明培養(yǎng)基(2B)上的菌落生長(zhǎng)情況；
圖3為挑取的單菌落在PDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)表型；
圖4為光學(xué)顯微鏡(20倍)下黃曲霉分生孢子梗形態(tài)；
圖5為光學(xué)顯微鏡(40倍)下黃曲霉分生孢子形態(tài)；
圖6為黃曲霉菌株的PCR鑒定結(jié)果圖。
具體實(shí)施方式
下面僅以土壤和玉米樣品為例，詳細(xì)說(shuō)明黃曲霉的篩選方法，其他樣品的黃曲霉篩選方法與土壤或玉米一致。
實(shí)施例I 土壤樣品中黃曲霉的篩選
I、篩選培養(yǎng)基的配制
取IOg酵母提取物，IOg蔗糖，30g瓊脂，80g氯化鈉，溶于800mL去離子水中，調(diào)整 pH至7. 0，定容至992mL，121°C高壓滅菌20min后，再加入用細(xì)菌濾器過(guò)濾除菌的10g/L硫酸銅(CuSO4 · 5H20) ImL, 10g/L 硫酸鋅(ZnSO4 · 7H20) ImL, 4g/L 氯硝胺 5mL, O. lg/mL 鏈霉素 lmL。倒入滅菌的9cm培養(yǎng)皿中冷卻備用。若暫時(shí)不用，可置4°C下保存。
2、黃曲霉篩選
(I)將采集土樣室溫晾干、在滅菌研缽中研磨至細(xì)粉狀；
(2)稱取O. Ig研磨好的烘干土樣均勻分散在含有PDA和上述篩選培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中；
(3)28°C靜置4-7天，觀察菌落生長(zhǎng)情況。
如圖I所示,PDA培養(yǎng)基上布滿雜菌，而在篩選培養(yǎng)基上出現(xiàn)黃曲霉的黃色放射狀菌落，無(wú)細(xì)菌污染，僅有少數(shù)其它真菌生長(zhǎng)。
實(shí)施例2玉米樣品中黃曲霉的篩選
I、篩選培養(yǎng)基的配制
同實(shí)施例I。
2、黃曲霉篩選
(I)將玉米樣品室溫晾干、在粉碎儀中粉碎至細(xì)粉狀；
(2)稱取Ig粉碎好的樣品均勻分散在含有PDA和上述篩選培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中；
(3) 28°C靜置4-7天，觀察菌落生長(zhǎng)情況。
如圖2所示，PDA培養(yǎng)基上雖長(zhǎng)出黃曲霉的黃色放射狀菌落，但也出現(xiàn)多種雜菌， 很難進(jìn)行黃曲霉的分離；在篩選培養(yǎng)基上出現(xiàn)黃曲霉的黃色放射狀菌落，無(wú)細(xì)菌污染，僅有少數(shù)其它真菌生長(zhǎng)。
實(shí)施例3菌落分析
靜置培養(yǎng)4 5天后，觀察實(shí)施例1-2中篩選培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的菌落情況，如圖I、圖 2所示，培養(yǎng)基均無(wú)細(xì)菌污染，且有黃色放射狀菌落長(zhǎng)出。挑取單菌落，將其轉(zhuǎn)移至PDA培養(yǎng)基上，28°C生長(zhǎng)5天后，菌落呈黃色，表面呈粉末狀(圖3)。
挑取少量菌絲制片，置光學(xué)顯微鏡(20倍)下觀察，觀察結(jié)果如圖4所示。視野下， 可看到分生孢子梗頂端膨大成球狀，頂端著生成串的球形分生孢子，符合曲霉的形態(tài)特征。 挑取菌落表面粉末狀的孢子制片，置光學(xué)顯微鏡(40倍)下觀察，觀察結(jié)果如圖5所示。視野下，可觀察到孢子呈球狀，部分孢子仍成串。實(shí)施例4分子水平鑒定黃曲霉
黃曲霉與曲霉屬中其他成員最主要的區(qū)別在于其次級(jí)代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素，而黃曲霉毒素的合成則受產(chǎn)毒基因簇中一系列基因所調(diào)控。當(dāng)該基因簇中某些基因缺失則不能正常編碼黃曲霉毒素合成途徑中所需要的酶，從而使黃曲霉毒素合成受阻，即成為不產(chǎn)毒菌株。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，黃曲霉無(wú)論是產(chǎn)毒菌株還是不產(chǎn)毒菌株，位于產(chǎn)毒基因簇下游的基因glcA都不缺失。鑒于此，利用本發(fā)明的篩選培養(yǎng)基從土壤或玉米樣品中分離得到的黃曲霉菌株中隨機(jī)挑選產(chǎn)毒菌株與不產(chǎn)毒菌株各5株，提取基因組DNA，根據(jù)已報(bào)道的引物對(duì) glcA-F 和 glcA-R 對(duì) glcA 基因進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增(Jiang et al. , 2009, Applied Microbiology and Biotechnology, 501-505),結(jié)果如圖6所不，5株產(chǎn)毒素的菌株和5株不產(chǎn)毒素的菌株 PCR擴(kuò)增后都能生成一條特異的754bp的條帶，說(shuō)明本發(fā)明培養(yǎng)基分離獲得的菌株均為黃曲霉。
從以上分析得出本發(fā)明的篩選培養(yǎng)基和方法適用于從土壤、玉米等樣品中特異有效地篩選得到黃曲霉，且不受細(xì)菌污染，其他真菌污染較少。為后續(xù)相關(guān)研究工作的開(kāi)展提供了必不可少的研究材料。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施舉例，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種分離、檢測(cè)黃曲霉的培養(yǎng)基，其特征在于，配方為酵母提取物8 12g/L、蔗糖8 12g/L、NaCl 75 85g/L、瓊脂 25 35g/L、硫酸鹽 0. 01 0. 03g/L、氯硝胺 0. 01 0.03g/L、抗生素 0. 05 0. 15g/L。
2.如權(quán)利要求I所述的培養(yǎng)基，其特征在于，配方為酵母提取物9 llg/L、蔗糖9 llg/L、NaCl 78 82g/L、瓊脂 28 32g/L、硫酸鹽 0. 015 0. 025g/L、氯硝胺 0. 015 0.025g/L、抗生素 0. 08 0. 12g/L。
3.如權(quán)利要求I 2任一所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述抗生素為鏈霉素。
4.如權(quán)利要求I 2任一所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述硫酸鹽為CuSO4 5H20、ZuSO4 7H20或它們兩者的混合物。
5.如權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述硫酸鹽為重量比I: I的CuSO4 CH2O和 ZuSO4 7H20。
6.一種從土壤或農(nóng)作物中分離黃曲霉的方法，其特征在于，包括 (1)將土壤或農(nóng)作物樣品粉碎至細(xì)粉狀； (2)將細(xì)粉狀樣品分散于權(quán)利要求I 5任一所述培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，樣品粉碎前進(jìn)行干燥。
8.如權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于,所述靜置培養(yǎng)的溫度為25 30°C,培養(yǎng)時(shí)間為4 7天。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種分離、檢測(cè)黃曲霉的培養(yǎng)基，配方為酵母提取物8~12g/L、蔗糖8~12g/L、NaCl75~85g/L、瓊脂25~35g/L、硫酸鹽0.01~0.03g/L、氯硝胺0.01~0.03g/L、抗生素0.05~0.15g/L。本發(fā)明還公開(kāi)了一種從土壤或農(nóng)作物中分離黃曲霉的方法，包括將土壤或農(nóng)作物粉碎至細(xì)粉狀；將細(xì)粉狀樣品分散于所述培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的培養(yǎng)基和方法簡(jiǎn)單易行，高效專一，大大提高了黃曲霉的分離效率。
文檔編號(hào)C12N1/14GK102978124SQ201210525389
公開(kāi)日2013年3月20日 申請(qǐng)日期2012年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月5日
發(fā)明者尹燕妮, 張承啟, 楊倩倩, 馬忠華 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)