專利名稱：一種體外擴(kuò)增γδT細(xì)胞的方法
一種體外擴(kuò)增Y δ T細(xì)胞的方法本發(fā)明涉及Y δ T細(xì)胞培養(yǎng)方法，具體涉及一種體外擴(kuò)增Y δ T細(xì)胞的方法。根據(jù)T細(xì)胞表面受體(TCR)的不同可將T淋巴細(xì)胞分為兩種α β T淋巴細(xì)胞和Y s T淋巴細(xì)胞。在人體中，α β T淋巴細(xì)胞是參與免疫應(yīng)答的主要細(xì)胞群，占成熟T細(xì)胞的90 95%，而Y δ T細(xì)胞僅占外周血T淋巴細(xì)胞的O. 5%_5%，但Y δ T細(xì)胞是先于α β T細(xì)胞出現(xiàn)的，主要分布于皮膚，小腸、食道、肺和生殖器官等上皮組織內(nèi)。Y S T細(xì)胞屬于機(jī) 體的第一線防御細(xì)胞，在抗微生物感染免疫，尤其是在皮膚黏膜表面的免疫防御功能中，以及抗分枝桿菌感染中發(fā)揮重要作用。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，Y S T細(xì)胞具有無MHC限制性的殺瘤作用，對多種自體、同種異體或異種腫瘤細(xì)胞均表現(xiàn)出顯著的殺傷活性，因此，Y ST細(xì)胞作為一類重要的腫瘤過繼免疫治療的候選細(xì)胞正在引起越來越多國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。但是另一方面，由于Y S T細(xì)胞在人體中所含比例較低，分離純化到大量的Y δ T細(xì)胞較為困難，因而限制了其臨床使用。因此Y ST細(xì)胞體外高效擴(kuò)增是解決這一問題的主要方法。在這一領(lǐng)域，人們做了很多有益的嘗試，國內(nèi)在體外培養(yǎng)擴(kuò)增Y δ T細(xì)胞通常采用IPP和IL-2共刺激法，但因費(fèi)用相對昂貴且擴(kuò)增倍數(shù)不足而未被廣泛使用。因此，為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供了一種新的Y δΤ細(xì)胞的方法，該方法操作簡便，價格便宜，擴(kuò)增Y δ T細(xì)胞效率高。本發(fā)明的目的是提供一種體外高效擴(kuò)增Y δ T細(xì)胞的方法，提高Y δ T細(xì)胞的純度和殺傷活性，使Y S T細(xì)胞更適用于臨床。為實(shí)現(xiàn)上述目的，設(shè)計(jì)一種體外擴(kuò)增Y δ T細(xì)胞的方法，該方法由以下步驟組成a.用抗TCR Y δ抗體和CD28McAb預(yù)先包被T75培養(yǎng)瓶以備用，b.將外周血單個核細(xì)胞轉(zhuǎn)入包被的T75培養(yǎng)瓶中，加入含有唑來膦酸(Zoledronat)、HSP70、IL-7、IL-15和IL-2的無血清培養(yǎng)基，放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)12^16天后獲得大量較高純度的Y δ T細(xì)胞。上述方法還具有如下優(yōu)化方案抗TCR Y δ抗體濃度為I yg/ml。 所述CD28McAb的在無血清培養(yǎng)基中的濃度為500ng/ml。所述的唑來膦酸在無血清培養(yǎng)基中的濃度為1.00 μ δ/πιΓ3. 87 Ug/mL·所述唑來膦酸在無血清培養(yǎng)基中的濃度為1.29 yg/mL·所述HSP70在無血清培養(yǎng)基中的濃度為10 μ g/ml 50 μ g/mL·所述HSP70在無血清培養(yǎng)基中的濃度為20 μ g/mL·所述IL-7在無血清培養(yǎng)基中的濃度為10ng/ml。所述IL-15在無血清培養(yǎng)基中的濃度為50ng/ml。
所述IL-2在無血清培養(yǎng)基中的為1000IU/ml。本發(fā)明提供了一種新的Y δ T細(xì)胞的體外培養(yǎng)方法，與常規(guī)培養(yǎng)方法相比，本方法的優(yōu)越之處有以下幾點(diǎn)(I)采用抗TCR Y δ抗體和⑶28McAb兩種抗體包被，抗TCRγ δ抗體提供了 γ δΤ細(xì)胞活化的第一信號，CD28McAb則為Y δ T細(xì)胞的活化提供了共刺激信號，使靜息的、δΤ細(xì)胞得到充分的激活；(2) TCRy δ具有龐大的序列多態(tài)性，目前已有兩類分子被證實(shí)是TCRy δ配體含磷酸基的非肽類小分子和熱休克蛋白；用IPP刺激Y δ T細(xì)胞時所需濃度較高，加之IPP的價格昂貴，如果培養(yǎng)至臨床所需要的細(xì)胞數(shù)量則培養(yǎng)成本較高，而唑來膦酸(Zoledronat)可以在較低的濃度下激活Y δ T細(xì)胞,所以選擇使用合適濃度的Zoledrona來刺激Y δ T細(xì)胞，使其大規(guī)模培養(yǎng)成為可能；HSP70不僅能攜帶特異性腫瘤抗原，還可作為抗原呈遞分子直接將抗原肽呈遞給Y δ T細(xì)胞，使其活化增殖，發(fā)揮細(xì)胞毒和分泌細(xì)胞 因子的雙重功能；(3)IL-2、IL_7和IL-15三種細(xì)胞因子組合的應(yīng)用。IL_7是促進(jìn)人類Y δ T前體細(xì)胞增殖和促進(jìn)Y δ T分化成熟的重要因子；IL-15是一種多功能的細(xì)胞因子，促進(jìn)T細(xì)胞的增值，此外IL-15可抑制活化的T細(xì)胞和B細(xì)胞由于抗Fas抗體、細(xì)胞因子耗竭、地塞米松等因素所致的凋亡；IL-2是T細(xì)胞的生長因子；三種細(xì)胞因子的組合使用既降低了單種因子的用量，使培養(yǎng)成本無明顯提高，又保證了發(fā)揮作用的全面性，大幅提高了 Y ST細(xì)胞的增值倍數(shù)和毒性。

圖1是兩組培養(yǎng)方法下Y δ T細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)的比較圖；圖2是兩組培養(yǎng)方法下Y δ T細(xì)胞純度的比較圖；圖3是兩組培養(yǎng)方法下Y δ T細(xì)胞對SGC-7901細(xì)胞殺傷活性的比較圖；為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。本申請中的生產(chǎn)設(shè)備都是本領(lǐng)域的常用設(shè)備，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實(shí)施例1:一、外周血單個核細(xì)胞(PBMC)的分離與培養(yǎng)機(jī)器采集PBMC，將采集的血樣轉(zhuǎn)至離心管；700g，IOmin離心分離，吸取上層血漿培養(yǎng)時備用；血樣標(biāo)本還原至原體積，混勻；稀釋血緩慢加在Ficoll上，900g,離心20min ；吸取分離液界面乳白色單個核細(xì)胞層；離心洗滌2次并計(jì)數(shù)；用Y δ T初始培養(yǎng)基將細(xì)胞重懸至I X IO6 /ml ;根據(jù)細(xì)胞的生長情況，每2 3天更換培養(yǎng)基，所用培養(yǎng)基為含5%自體血漿的無血清培養(yǎng)基。在37°C、5%C02的飽和濕潤環(huán)境中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞的生長情況，每2 3天更換培養(yǎng)基，將細(xì)胞濃度控制在2. 5X IO6 /ml左右，同時全量補(bǔ)充各種因子其中試驗(yàn)組補(bǔ)充唑來膦酸(Zoledronat)，HSP70, IL-2，IL-7和IL-15，常規(guī)組補(bǔ)充IPP和IL-2，持續(xù)培養(yǎng)12 16天后，即可獲得大量較高純度的Y δΤ細(xì)胞。
二、實(shí)驗(yàn)方法與常規(guī)方法的細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)的比較分別在第0、4、8、12、14及16天從兩組取培養(yǎng)細(xì)胞，用臺盼藍(lán)染色后計(jì)數(shù)，將計(jì)數(shù)當(dāng)天的細(xì)胞總數(shù)除以培養(yǎng)前的細(xì)胞數(shù)(即第O天)，數(shù)值即為細(xì)胞的擴(kuò)增倍數(shù)。以此方法可以動態(tài)比較兩組細(xì)胞的擴(kuò)增情況，結(jié)果如表I和圖1所示，在培養(yǎng)的第
4、8、12、14和16天，兩組的Y δ T細(xì)胞均在擴(kuò)增，但是每個時間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組的Y δ T細(xì)胞擴(kuò)增情況均好于常規(guī)組，第14天時兩組均達(dá)到擴(kuò)增最高點(diǎn)，其后細(xì)胞擴(kuò)增速度變緩，第16天顯微鏡下可觀察到凋亡細(xì)胞碎片。表I
權(quán)利要求
1.一種體外擴(kuò)增Y S T細(xì)胞的方法，其特征在于該方法由以下步驟組成a.用抗TCRY δ抗體和⑶28McAb預(yù)先包被T75培養(yǎng)瓶以備用，b.將外周血單個核細(xì)胞轉(zhuǎn)入包被的T75培養(yǎng)瓶中，加入含有唑來膦酸、HSP70、IL-7、 IL-15和IL-2的無血清培養(yǎng)基，放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 16天后獲得大量較高純度的 Y δΤ細(xì)胞。
2.如權(quán)利要求1所述的體外擴(kuò)增Yδ T細(xì)胞的方法，其特征在于抗TCR Y δ抗體濃度為 I μ g/ml0
3.如權(quán)利要求1所述的體外擴(kuò)增YδΤ細(xì)胞的方法，其特征在于所述CD28McAb的在無血清培養(yǎng)基中的濃度為500ng/ml。
4.如權(quán)利要求1所述的體外擴(kuò)增YS T細(xì)胞的方法，其特征在于所述的唑來膦酸在無血清培養(yǎng)基中的濃度為1.00 μ δ/πιΓ3. 87 yg/mL·
5.如權(quán)利要求1所述的體外擴(kuò)增YS T細(xì)胞的方法，其特征在于所述唑來膦酸在無血清培養(yǎng)基中的濃度為1. 29 μ g/ml。
6.如權(quán)利要求1所述的體外擴(kuò)增YS T細(xì)胞的方法，其特征在于所述HSP70在無血清培養(yǎng)基中的濃度為10 μ g/ml 50 μ g/ml。
7.如權(quán)利要求1所述的體外擴(kuò)增YS T細(xì)胞的方法，其特征在于所述HSP70在無血清培養(yǎng)基中的濃度為20 μ g/ml 0
8.如權(quán)利要求1所述的體外擴(kuò)增YS T細(xì)胞的方法，其特征在于所述IL-7在無血清培養(yǎng)基中的濃度為10ng/ml。
9.如權(quán)利要求1所述的體外擴(kuò)增YS T細(xì)胞的方法，其特征在于所述IL-15在無血清培養(yǎng)基中的濃度為50ng/ml。
10.如權(quán)利要求1所述的體外擴(kuò)增YS T細(xì)胞的方法，其特征在于所述IL-2在無血清培養(yǎng)基中的為1000IU/ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及γδT細(xì)胞培養(yǎng)方法，具體涉及一種體外擴(kuò)增γδT細(xì)胞的方法，該方法的操作步驟如下抗TCRγδ抗體和CD28McAb預(yù)先包被T75培養(yǎng)瓶，備用。分離患者外周血單個核細(xì)胞(PBMC)，用含5%自體血漿的無血清培養(yǎng)基將PBMC濃度調(diào)整為1×106 /ml，再將PBMC細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入T75培養(yǎng)瓶中，加入含有適當(dāng)濃度Zoledronat，HSP70，IL-2，IL-7，IL-15的初始培養(yǎng)基，37℃、5%CO2的飽和濕潤環(huán)境中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞的生長情況，每2~3天更換培養(yǎng)基，將細(xì)胞濃度控制在2.5×106 /ml左右，同時全量補(bǔ)充Zoledronat，HSP70，IL-2和IL-7，IL-15，持續(xù)培養(yǎng)12~16天后，即可獲得大量較高純度的γδT細(xì)胞。
文檔編號C12N5/0783GK102994448SQ20121054165
公開日2013年3月27日 申請日期2012年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月13日
發(fā)明者解尚云, 葉永清, 譚令兵 申請人:上?？氯R遜生物技術(shù)有限公司