一種用于擴(kuò)增鵝細(xì)小病毒基因組的引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種用于擴(kuò)增鵝細(xì)小病毒基因組的引物，屬于獸醫(yī)傳染病學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]鶴細(xì)小病毒(Gooseparvovirus，GPV)屬于細(xì)小病毒科(Family: Parvoviridae)、細(xì)小病毒亞科(Subfamily: Parvovirinae)、依賴病毒屬(Genus: Dependovirus)只有一個(gè)血清型。
[0003]鵝細(xì)小病毒是感染禽類的主要自主復(fù)制型細(xì)小病毒，由我國(guó)學(xué)者方定一于1956年首先在江蘇省揚(yáng)州地區(qū)發(fā)現(xiàn)，以后在世界多國(guó)均見有相關(guān)研究報(bào)道。該病主要侵害30d以內(nèi)的雛鵝和雛番鴨，引起以急性腸炎及肝、腎、心等實(shí)質(zhì)臟器敗血性病變，尤其是小腸部位的纖維性、栓塞性病變，是目前危害養(yǎng)鵝業(yè)和番鴨養(yǎng)殖業(yè)的重要疫病。
[0004]目前，關(guān)于GPV全基因序列僅有少量報(bào)道，相關(guān)文獻(xiàn)獲得GPV基因組序列需要多條引物，該病基因組測(cè)定的難點(diǎn)在于其其基因組5’端和3’端均含有相同的末端倒置重復(fù)序列(inverted terminal repeat，ITR)。本發(fā)明根據(jù)GPV基因組結(jié)構(gòu)特征，設(shè)id 組引物，將該引物PCR擴(kuò)增結(jié)果，經(jīng)巧妙的拼接后即可獲得GPV全基因組。本發(fā)明的建立可填補(bǔ)國(guó)內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域空白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種用于擴(kuò)增鵝細(xì)小病毒基因組的引物。
[0006]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案:
用于擴(kuò)增鵝細(xì)小病毒基因組的引物包括:
1、一種用于擴(kuò)增鵝細(xì)小病毒基因組的引物，其特征在于，所述引物序列如下:
上游引物 GPVF:ACGTATTTCCGGCTGTTAGGTTGACCACGCGCAT ;下游引物 GPVR:TTGCGCGCCAGGAAGTGTTTTAT，利用本發(fā)明的引物所擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物，經(jīng)克隆測(cè)序后，根據(jù)克隆測(cè)序的結(jié)果和鵝細(xì)小病毒基因組結(jié)構(gòu)特征，對(duì)獲得序列進(jìn)行分段，即可獲得鵝細(xì)小病毒全基因組序列。
[0007]具體操作方法如下:
1、引物設(shè)計(jì):
參考鵝細(xì)小病毒全基因組結(jié)構(gòu)特征，利用引物設(shè)計(jì)軟件Oligo 7，設(shè)計(jì)特異性引物，采用BLAST工具進(jìn)行檢索，驗(yàn)證其特異性。上游引物GPVF:ACGTATTTCCGGCTGTTAGGTTGACCACGCGCAT ;下游引物 GPVR:TTGCGCGCCAGGAAGTGTTTTAT。以鵝細(xì)小病毒株(GenBank 登錄號(hào)HQ891825)為例，上游引物位于基因組168-201位，下游引物位于4657-4679位。
[0008]2、目的條帶的PCR擴(kuò)增與克隆
參考DNA提取試劑盒說明書，提取鵝細(xì)小病毒的基因組DNA。以提取的DNA模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由于目的片段較長(zhǎng)，建議擴(kuò)增時(shí)使用快速擴(kuò)增酶，本研究選取寶生物工程(大連)有限公司的TaKaRa Z-Taq ?快速擴(kuò)增酶。反應(yīng)體系為:TaKaRa Z-Taq酶0.5 μ L、1XZ-Taq緩沖液5 μ L、dNTP Mixture 4 μ L、DNA模板I μ L、上下游引物各I μ L (終濃度為10 pmol)、補(bǔ)充滅菌去離子水37.5 μ L至終體積50 μ L。反應(yīng)條件為:98 °C 5min預(yù)變性；98 °C 10 s、54 °C 10 s、72 °C 50 s，共 35 個(gè)循環(huán)，72 °C 延伸 10 min。將 PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化后與PMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，用PCR和雙酶切方法鑒定重組質(zhì)粒，隨機(jī)選取5份陽(yáng)性重組質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。
[0009]3、序列拼接
將測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast分析比對(duì)驗(yàn)證符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期后，將獲得片段按照鵝細(xì)小病毒結(jié)構(gòu)模式圖(圖1)進(jìn)行拼接。
[0010]GPV病毒基因組測(cè)拼接按照以下思路進(jìn)行:根據(jù)測(cè)序的結(jié)果，獲得基因序列位于(以GenBank登錄號(hào)HQ891825為例)，所測(cè)定的序列位于基因組168至4679位。通過和GPV參考株(GenBank登錄號(hào)HQ891825)的比對(duì)，獲得所測(cè)病毒基因組左側(cè)的“泡區(qū)”[即Bubble區(qū)，該泡區(qū)存在一個(gè)Sph I限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)(GCATGC)]，和左側(cè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)中含有181 nt的無錯(cuò)配“莖”部(即左側(cè)S2 (181)區(qū))，由于左側(cè)S2 (181)區(qū)和左側(cè)SI (181)區(qū)基因序列完全互補(bǔ)，獲得左側(cè)的hairpin區(qū)(發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū))。再根據(jù)測(cè)序結(jié)果和GPV參考株(GenBank登錄號(hào)HQ891825)的比對(duì)獲得左側(cè)末端倒置重復(fù)序列區(qū)。由于GPV基因組左側(cè)末端倒置重復(fù)序列區(qū)和右側(cè)末端倒置重復(fù)序列區(qū)完全互補(bǔ)，獲得右側(cè)末端倒置重復(fù)序列區(qū)序列。在是引物時(shí)的下游引物含有部分右側(cè)末端倒置重復(fù)序列區(qū)序列，即可獲得完整的GPV基因組序列。
[0011]本發(fā)明的有益效果:
本發(fā)明僅需要一組引物，根據(jù)其基因組特征，巧妙獲得GPV病毒全基因組序列。該方法實(shí)驗(yàn)成本低廉，為獲得GPV基因組提供一種實(shí)驗(yàn)方法。
【附圖說明】
[0012]圖1為鵝細(xì)小病毒基因組結(jié)構(gòu)模式圖。
【具體實(shí)施方式】
[0013]實(shí)施例1 一株鵝細(xì)小病毒全基因測(cè)定一、步驟
1、試劑:
TaKaRa Z-Taq ?快速擴(kuò)增酶、pMD18_T載體、DL15000 Marker購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；病毒DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒小量抽提試劑盒購(gòu)自O(shè)mega B1-Tek0
[0014]2.引物的特異性
引物的特異性是本實(shí)驗(yàn)所建立方法的最重要因素。根據(jù)鵝細(xì)小病毒基因組結(jié)構(gòu)特征設(shè)計(jì)特異性的上下游引物，要求上游引物位于左側(cè)ITR區(qū)和B區(qū)之間，下游引物的5’端要保留部分右側(cè)ITR區(qū)序列，跟結(jié)合引物設(shè)計(jì)的特異性要求，獲得鵝細(xì)小病毒擴(kuò)增的特異性序列。
[0015]2、目的條帶的PCR擴(kuò)增與克隆
參考DNA提取試劑盒說明書，提取鵝細(xì)小病毒的基因組DNA。以提取的DNA模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由于目的片段較長(zhǎng)，建議擴(kuò)增時(shí)使用快速擴(kuò)增酶，本研究選取寶生物工程(大連)有限公司的TaKaRa Z-Taq ?快速擴(kuò)增酶。反應(yīng)體系為:TaKaRa Z-Taq酶0.5 μ L、1XZ-Taq緩沖液5 μ L、dNTP Mixture 4 μ L、DNA模板I μ L、上下游引物各I μ L (終濃度為10 pmol)、補(bǔ)充滅菌去離子水37.5 μ L至終體積50 μ L。反應(yīng)條件為:98 °C 5min預(yù)變性；98 °C 10 s、54 °C 10 s、72 °C 50 s，共 35 個(gè)循環(huán)，72 °C 延伸 10 min。將 PCR 產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化后與PMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，用PCR和雙酶切方法鑒定重組質(zhì)粒，隨機(jī)選取5份陽(yáng)性重組質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。
[0016]3、序列拼接
將測(cè)序結(jié)果經(jīng)Blast分析比對(duì)驗(yàn)證符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期后，將獲得片段按照鵝細(xì)小病毒結(jié)構(gòu)模式圖(圖1)進(jìn)行拼接。
[0017]GPV病毒基因組測(cè)拼接按照以下思路進(jìn)行:根據(jù)測(cè)序的結(jié)果，獲得基因序列位于(以GenBank登錄號(hào)HQ891825為例)，所測(cè)定的序列位于基因組168至4679位。通過和GPV參考株(GenBank登錄號(hào)HQ891825)的比對(duì)，獲得所測(cè)病毒基因組左側(cè)的“泡區(qū)”[即Bubble區(qū)，該泡區(qū)存在一個(gè)Sph I限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)(GCATGC)]，和左側(cè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)中含有181 nt的無錯(cuò)配“莖”部(即左側(cè)S2 (181)區(qū))，由于左側(cè)S2 (181)區(qū)和左側(cè)SI (181)區(qū)基因序列完全互補(bǔ)，獲得左側(cè)的hairpin區(qū)(發(fā)夾結(jié)構(gòu)區(qū))。再根據(jù)測(cè)序結(jié)果和GPV參考株(GenBank登錄號(hào)HQ891825)的比對(duì)獲得左側(cè)末端倒置重復(fù)序列區(qū)。由于GPV基因組左側(cè)末端倒置重復(fù)序列區(qū)和右側(cè)末端倒置重復(fù)序列區(qū)完全互補(bǔ)，獲得右側(cè)末端倒置重復(fù)序列區(qū)序列。在是引物時(shí)的下游引物含有部分右側(cè)末端倒置重復(fù)序列區(qū)序列，即可獲得完整的GPV基因組序列。
[0018]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，凡依本發(fā)明申請(qǐng)專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種用于擴(kuò)增鵝細(xì)小病毒基因組的引物，其特征在于，所述引物序列如下: 上游引物 GPVF:ACGTATTTCCGGCTGTTAGGTTGACCACGCGCAT ;下游引物 GPVR:TTGCGCGCCAGGAAGTGTTTTAT。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于擴(kuò)增鵝細(xì)小病毒基因組的引物擴(kuò)增鵝細(xì)小病毒基因組的引物，所述引物序列為：上游引物GPVF：ACGTATTTCCGGCTGTTAGGTTGACCACGCGCAT；下游引物GPVR：TTGCGCGCCAGGAAGTGTTTTAT。本發(fā)明根據(jù)NCBI(National？Center？for？Biotechnology？Information）數(shù)據(jù)庫(kù)中鵝細(xì)小病毒基因組結(jié)構(gòu)特征，設(shè)計(jì)特異性的引物，設(shè)計(jì)一組基于鵝細(xì)小病毒全基因組的引物，將該引物的PCR經(jīng)克隆測(cè)序后，根據(jù)鵝細(xì)小病毒基因組結(jié)構(gòu)特性，即可獲得鵝細(xì)小病毒全基因。該方法僅需一組引物即可獲得鵝細(xì)小病毒全基因序列。
【IPC分類】C12N15/11
【公開號(hào)】CN105063039
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510562469
【發(fā)明人】萬春和, 黃瑜, 陳紅梅, 程龍飛, 傅光華, 傅秋玲, 施少華, 陳翠騰
【申請(qǐng)人】福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所
【公開日】2015年11月18日
【申請(qǐng)日】2015年9月8日