專利名稱：一種耐貯獼猴桃新品種的選育方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物新品種的選育方法，具體指耐貯獼猴桃品種的選育新方法。
背景技術(shù)：
獼猴桃是典型的呼吸躍變型果實(shí)，研究發(fā)現(xiàn)乙烯對(duì)于獼猴桃等呼吸躍變型果實(shí)的成熟具有舉足輕重的作用，通過(guò)控制獼猴桃果實(shí)內(nèi)乙烯的生成可有效延長(zhǎng)獼猴桃貯存的時(shí)間。在乙烯生物合成的過(guò)程中，有三個(gè)酶起著相當(dāng)重要的作用，分別為腺苷蛋氨酸合成酶(SAM synthetase, SAMS)、ACC合成酶(ACC synthase, ACS)、ACC氧化酶(ACC oxidase,ACO)，其中ACO在乙烯生物合成過(guò)程中特別關(guān)鍵，通過(guò)調(diào)控ACO基因及其表達(dá)，就可以很好的控制果實(shí)內(nèi)源乙烯的合成，從而達(dá)到延長(zhǎng)果實(shí)貯藏時(shí)間的目的。 大多數(shù)采用轉(zhuǎn)基因方法獲得的耐貯獼猴桃新品種均帶有篩選標(biāo)記，隨著轉(zhuǎn)基因植物研究的深入和轉(zhuǎn)基因作物的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化，轉(zhuǎn)基因植物的安全性越來(lái)越受到人們的重視，帶有篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植物品種由于潛在的各種安全性問(wèn)題，特別是由于抗生素篩選標(biāo)記引發(fā)的轉(zhuǎn)基因食品安全性問(wèn)題，目前無(wú)法通過(guò)國(guó)家農(nóng)業(yè)部的審查。因此，開(kāi)發(fā)獲得無(wú)篩選標(biāo)記的耐貯獼猴桃轉(zhuǎn)基因植株，對(duì)于耐貯獼猴桃新品種的選育和轉(zhuǎn)基因植物安全都具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
為解決耐貯獼猴桃新品種選育現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明人通過(guò)大量試驗(yàn)，終于發(fā)明出一種耐貯獼猴桃的選育新方法，運(yùn)用該方法，能確保得到的獼猴桃新品種不僅耐貯藏，而且不帶篩選標(biāo)記，安全性高。本發(fā)明包括以下幾個(gè)步驟
(I)ACO基因的獲得。從獼猴桃葉片中提取RNA，再將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后通過(guò)設(shè)計(jì)引物獲得ACO基因。(2)將ACO基因反向連接入雙右邊界雙元載體，將載體轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌中，通過(guò)葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入愈傷組織中，再通過(guò)篩選培養(yǎng)基獲得抗性愈傷組織，經(jīng)過(guò)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得含有篩選標(biāo)記再生苗。雙右邊界雙元載體是指載體有一條左邊界和兩條右邊界，其中標(biāo)記基因在左邊界和第一條右邊界鏈接，目的基因是在第一條右邊界和第二條右邊界之間。(3)上游引物為Term F: 5' -GGT, GCT, TTC, CCA, GTC, CAA, ATC, GTT-3'，下游引物STermR: 5' -CCA, GGT, TTA, GTC, GTC, TCG, TGT, CTG, GT-3'，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，80 — 105°C預(yù)變性3 — IOmin后運(yùn)行下循環(huán)，94°C 35 s，59°C 35 s，72°C 40 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72°C10 min，25°C 30 s，取PCR產(chǎn)物5 — 30 μ L進(jìn)行O. 6% —1. 5%瓊脂糖凝膠電泳分離獲得陽(yáng)性植株(含有目的基因的植株，575bp)。(4)通過(guò)遺傳分離獲得無(wú)篩選標(biāo)記的含有目的基因的植株，將同時(shí)含有hpt基因和aco基因的共轉(zhuǎn)化植株轉(zhuǎn)移至溫室栽培，隨機(jī)挑選其中10 — 50個(gè)TO代植株進(jìn)行自交產(chǎn)生Tl代后對(duì)Tl代植株的基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，從而獲得無(wú)篩選標(biāo)記的含有目的基因的植株，含有目的基因的植株即為新的耐貯獼猴桃品種。本發(fā)明的特點(diǎn)是將選擇標(biāo)記基因和目的功能基因分別構(gòu)建到一個(gè)雙元表達(dá)載體的兩段不同T_DNA上，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化將目的基因和選擇標(biāo)記基因整合到同一染色體的不同部位，通過(guò)后代的篩選，獲得無(wú)選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植株。該方法獲得的耐貯獼猴桃品種安全性高，易于通過(guò)國(guó)家農(nóng)業(yè)部審查。
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)實(shí)例對(duì)耐貯獼猴桃選育的具體方法進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施例1 (I)ACO基因的獲得，從獼猴桃葉片中提取RNA，再將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后通過(guò)設(shè)計(jì)引物獲得ACO基因。(2)將ACO基因反向連接入雙右邊界雙元載體，將載體轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌中，通過(guò)葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入愈傷組織中，再通過(guò)篩選培養(yǎng)基獲得抗性愈傷組織，經(jīng)過(guò)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得含有篩選標(biāo)記再生苗。(3)上游引物為 Term F: 5' -GGT, GCT, TTC, CCA, GTC, CAA, ATC, GTT-3'，下游引物為 Term R: 5' -CCA, GGT, TTA, GTC, GTC, TCG, TGT, CTG, GT-3'，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，95°C預(yù)變性 5min后運(yùn)行下循環(huán)，94°C 35 s，59°C 35 s，72°C 40 s，共 35 個(gè)循環(huán)，最后 72°C 10 min,25°C 30 s，取PCR產(chǎn)物10 μ L進(jìn)行1. 0%瓊脂糖凝膠電泳分離獲得陽(yáng)性植株。(4)通過(guò)遺傳分離獲得無(wú)篩選標(biāo)記的含有目的基因的植株，將同時(shí)含有hpt基因和aco基因的共轉(zhuǎn)化植株轉(zhuǎn)移至溫室栽培，隨機(jī)挑選其中17個(gè)TO代植株進(jìn)行自交產(chǎn)生Tl代后對(duì)Tl代植株的基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，從而獲得無(wú)篩選標(biāo)記的含有目的基因的植株，含有目的基因的植株即為新的耐貯獼猴桃品種。實(shí)施例2
(1)ACO基因的獲得，從獼猴桃葉片中提取RNA，再將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后通過(guò)設(shè)計(jì)引物獲得ACO基因；
(2)將ACO基因反向連接入雙右邊界雙元載體，將載體轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌中，通過(guò)葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入愈傷組織中，再通過(guò)篩選培養(yǎng)基獲得抗性愈傷組織，經(jīng)過(guò)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得含有篩選標(biāo)記再生苗；
(3)上游引物為Term F: 5' -GGT, GCT, TTC, CCA, GTC, CAA, ATC, GTT-3'，下游引物為Term R: 5' -CCA, GGT, TTA, GTC, GTC, TCG, TGT, CTG, GT-3 ;，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，102 °C 預(yù)變性8min 后運(yùn)行下循環(huán)，94°C 35 s，59°C 35 s，72°C 40 s，共 35 個(gè)循環(huán)，最后 72°C 10 min,25°C 30 s，取PCR產(chǎn)物25 μ L進(jìn)行1. 3%瓊脂糖凝膠電泳分離獲得陽(yáng)性植株；
(4)通過(guò)遺傳分離獲得無(wú)篩選標(biāo)記的含有目的基因的植株，將同時(shí)含有hpt基因和aco基因的共轉(zhuǎn)化植株轉(zhuǎn)移至溫室栽培，隨機(jī)挑選其中40個(gè)TO代植株進(jìn)行自交產(chǎn)生Tl代后對(duì)Tl代植株的基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，從而獲得無(wú)篩選標(biāo)記的含有目的基因的植株，含有目的基因的植株即為新的耐貯獼猴桃品種。
權(quán)利要求
1.一種耐貯獼猴桃新品種的選育方法，其特征在于包含以下幾個(gè)步驟(1)ACO基因的獲得，從獼猴桃葉片中提取RNA，再將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后通過(guò)設(shè)計(jì)引物獲得ACO基因；(2)將ACO基因反向連接入雙右邊界雙元載體，將載體轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌中，通過(guò)葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入愈傷組織中，再通過(guò)篩選培養(yǎng)基獲得抗性愈傷組織，經(jīng)過(guò)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得含有篩選標(biāo)記再生苗；(3)上游引物為Term F: 5' -GGT, GCT, TTC, CCA, GTC, CAA, ATC, GTT-3'，下游引物為 Term R: 5' -CCA, GGT, TTA, GTC, GTC, TCG, TGT, CTG, GT-3'，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，80 — 105°C預(yù)變性 3 — IOmin 后運(yùn)行下循環(huán)，94°C 35 s，59°C 35 s，72°C 40 s，共 35 個(gè)循環(huán)，最后 72°C ·10 min，25°C 30 s，取PCR產(chǎn)物5 — 30 μ L進(jìn)行O. 6% 一1. 5%瓊脂糖凝膠電泳分離獲得陽(yáng)性植株；(4)通過(guò)遺傳分離獲得無(wú)篩選標(biāo)記的含有目的基因的植株，將同時(shí)含有hpt基因和aco 基因的共轉(zhuǎn)化植株轉(zhuǎn)移至溫室栽培，隨機(jī)挑選其中10 - 50個(gè)TO代植株進(jìn)行自交產(chǎn)生Tl代后對(duì)Tl代植株的基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，從而獲得無(wú)篩選標(biāo)記的含有目的基因的植株。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種耐貯獼猴桃的選育方法，該方法包括(1)ACO基因的獲得；(2)將ACO基因反向連接入雙右邊界雙元載體，將載體轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌中，通過(guò)葉盤(pán)轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入愈傷組織中，再通過(guò)篩選培養(yǎng)基獲得抗性愈傷組織，經(jīng)過(guò)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)獲得含有篩選標(biāo)記的再生苗；(3)使用PCR法檢測(cè)再生苗，獲得陽(yáng)性植株；(4)通過(guò)遺傳分離獲得無(wú)篩選標(biāo)記的含有目的基因的植株。本發(fā)明的特點(diǎn)是將選擇標(biāo)記基因和目的功能基因分別構(gòu)建到兩個(gè)雙元表達(dá)載體或同一質(zhì)粒的兩段不同T_DNA上，經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化將目的基因和選擇標(biāo)記基因整合到不同染色體或同一染色體的不同部位，通過(guò)后代的篩選，獲得無(wú)選擇標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植株。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102994545SQ201210558359
公開(kāi)日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月21日
發(fā)明者田宏現(xiàn), 苑平, 劉藝 申請(qǐng)人:吉首大學(xué)