專(zhuān)利名稱(chēng)：一株高產(chǎn)中性蛋白酶的米曲霉菌株及其液體發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株高產(chǎn)中性蛋白酶的米曲霉突變株及其液體發(fā)酵技術(shù),屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
中性蛋白酶作用條件溫和，是最早發(fā)現(xiàn)并廣泛應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的蛋白酶制劑，可廣泛應(yīng)用于食品、飼料、制藥等行業(yè)，現(xiàn)在市場(chǎng)上多是由細(xì)菌發(fā)酵生產(chǎn)中性蛋白酶，還未發(fā)現(xiàn)有通過(guò)液體發(fā)酵米曲霉來(lái)生產(chǎn)中性蛋白酶的方法。米曲霉液體發(fā)酵具有酶系豐富、發(fā)酵容易控制、發(fā)酵后提取工藝簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，因此受到越來(lái)越多的關(guān)注，米曲霉液體發(fā)酵受其表型的影響，產(chǎn)孢子的菌株進(jìn)行液體發(fā)酵時(shí)往往會(huì)出現(xiàn)菌絲結(jié)團(tuán)、發(fā)酵料液粘稠等不利現(xiàn)象，進(jìn)一步影響發(fā)酵活力。所以，選育高產(chǎn)中性蛋白酶的米曲霉菌株，表型適合液體發(fā)酵，可進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)中性蛋白酶是非常有意義的任務(wù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株適于液體發(fā)酵高產(chǎn)中性蛋白酶的米曲霉菌株及其液體發(fā)酵生產(chǎn)方法。本發(fā)明提供一種米曲霉(Aspergillus oryzae)菌種,該菌株已經(jīng)于2012年11月22日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，(郵編100101)，保藏編號(hào)為CGMCC No6848。所述米曲霉突變菌株CGMCC6848采用米曲霉M321和米曲霉J5進(jìn)行多輪原生質(zhì)體電融合育種選育獲得。米曲霉M321在麩皮豆柏固體培養(yǎng)基中發(fā)酵酶活最高15000u/g，液體發(fā)酵中性蛋白酶最高450u/ml，米曲霉J5固體發(fā)酵產(chǎn)酶最高活力為8000u/g，液體發(fā)酵最高酶活為10000u/ml，突變株CGMCC6848液體發(fā)酵酶活達(dá)到20000u/ml，經(jīng)發(fā)酵條件優(yōu)化后，液體發(fā)酵平均產(chǎn)酶活力在25000u/ml。米曲霉M321是經(jīng)紫外誘變篩選到的高產(chǎn)中性蛋白酶菌株，其液體發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶酶活力極低，不到500u/ml，米曲霉J5生長(zhǎng)表型為菌絲型不產(chǎn)孢子，液體培養(yǎng)其菌絲短細(xì)，發(fā)酵液混合均勻，物料、溶氧傳遞效果良好，為了得到一株適合液體發(fā)酵的高產(chǎn)中性蛋白酶菌株，對(duì)兩株菌先進(jìn)行紫外滅活后再進(jìn)行多輪電融合選育，直到選育出一株低產(chǎn)孢子、高產(chǎn)蛋白酶的菌株。所述米曲霉囷株所廣中性蛋白酶酶活力在20821u/mL以上。米曲霉突變菌株CGMCC6848液體發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶的的方法，包括如下步驟種子培養(yǎng)菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，搖瓶培養(yǎng)基配方為淀粉3-10%，大豆蛋白2-5%，麩皮0. 2-0. 5 %，硝酸鈉0. 2-0. 5 %，磷酸二氫鉀0. 2-0. 5 %，玉米漿0. 5-2 %。培養(yǎng)溫度31-33°C，培養(yǎng)時(shí)間50-70小時(shí)。液體發(fā)酵在50L發(fā)酵罐進(jìn)行液體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，接種量10-15%，發(fā)酵過(guò)程補(bǔ)料控制pH在6. 0-6. 5，培養(yǎng)溫度30-32°C，罐壓0. 07MPa，風(fēng)量0. 2-1. 5vvm，培養(yǎng)周期100-120小時(shí)。
中性蛋白酶的提取與精制發(fā)酵結(jié)束后，按發(fā)酵液體積加入40%的水和O. 3%氯化鈣，加入3%珍珠巖助濾劑，進(jìn)行壓濾，濾液經(jīng)超濾濃縮后可進(jìn)行酒精溶析得到固體酶制齊U，也可將濃縮液加入穩(wěn)定劑(金屬離子)得到液體酶制劑。發(fā)酵培養(yǎng)基配方為淀粉5-10%，大豆蛋白3-6%，麩皮1_3%，硝酸鈉O. 3-1%，磷酸二氫鉀O. 2-0.8%，玉米漿1_2%，補(bǔ)料配方為淀粉10-20%，豆餅粉4-8%，硫酸銨
0.2-0. 5%，玉米漿 O. 8-1. 5%。有益效果
本發(fā)明通過(guò)對(duì)原始菌株進(jìn)行誘變提高酶活后，對(duì)兩株不同表型的米曲霉進(jìn)行原生質(zhì)體融合篩選，再經(jīng)過(guò)培養(yǎng)基優(yōu)化和發(fā)酵工藝條件優(yōu)化，建立了液體發(fā)酵中性蛋白酶的方法，發(fā)酵活力在2. 5萬(wàn)u/ml，生產(chǎn)的中性蛋白酶在40°C保溫Ih后剩余酶活為91%，具有良好的耐熱性，可廣泛應(yīng)用于食品、飼料、紡織等行業(yè)。


圖1不同pH下的相對(duì)酶活圖2不同溫度下的相對(duì)酶活
具體實(shí)施例方式以下通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做更詳細(xì)的說(shuō)明，具體實(shí)施案例僅為舉例說(shuō)明，不作為對(duì)本發(fā)明實(shí)施范圍的限定。菌株的選育I原生質(zhì)體的制備取兩株出發(fā)菌株的新鮮斜面，用無(wú)菌水洗脫菌體，在有玻璃珠的試管振蕩使菌體分散，離心收集菌體，用O. 6M山梨醇滲透壓穩(wěn)定劑(O.1M檸檬酸緩沖液+0. 6M山梨醇+0. OlM EDTA)懸浮，離心洗滌后收集用滲透壓穩(wěn)定劑懸浮，置冰中備用。然后加入溶菌酶
1.2%、蝸牛酶O. 8%、纖維素酶O. 8%，在32°C進(jìn)行酶解6小時(shí)，制得原生質(zhì)體備用，其中原生質(zhì)體制備率和再生率的計(jì)算方法如下在普通培養(yǎng)基培養(yǎng)并計(jì)菌落數(shù)為A ;將原生質(zhì)體懸浮液稀釋一定倍數(shù)，在普通培養(yǎng)基培養(yǎng)并計(jì)菌落數(shù)為B ;在高滲再生培養(yǎng)基培養(yǎng)并計(jì)菌落數(shù)為C。原生質(zhì)體制備率=(A-B) /A*100 %原生質(zhì)體再生率=(C-B)/(A-B)*100%普通培養(yǎng)基配方(g/1)=KH2PO4Ig, MgSO4O. 5g，(NH4)2SO4O. 6g，可溶性淀粉 20g，瓊脂粉 20g，豆汁 IOOOml0豆汁再生培養(yǎng)基(g/1)KH2P04lg,MgS040 . 8g，(NH4)2SO4O. 6g，NaC135. lg，可溶性淀粉12g，瓊脂粉20g，豆汁1000ml。2原生質(zhì)體電融合將制得的兩株菌的原生質(zhì)體稀釋到濃度為IO6個(gè)/ml，各取5ml分別置于2個(gè)平板上，在超凈工作臺(tái)中，于18W紫外燈15cm處照射15min，將紫外滅活的兩親本菌株的原生質(zhì)體懸液用O. 6mol/l的山梨醇溶液洗滌2次后分別懸于電擊液中，然后將兩親本菌株的原生質(zhì)體混合均勻，進(jìn)行電融合操作，選用方波脈沖，條件為低壓120v ;脈沖寬度100ms ;脈沖個(gè)數(shù):10 ;脈沖間隔時(shí)間8s ;高壓3000v ;脈沖寬度0. 5ms :脈沖個(gè)數(shù)3 ;脈沖間隔時(shí)間6s，電融合結(jié)束后，將融合液經(jīng)稀釋后接種在再生培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)5天，長(zhǎng)出單菌落后再將單菌落依次挑取接種在酪蛋白平板上，30°C培養(yǎng)4天，計(jì)算HC值，從中選出5株產(chǎn)孢子少且HC (HC =水解圈直徑/菌落直徑)值高的新菌株，分別是F-13、F-21、F-40、F-53、F-69。3搖瓶發(fā)酵篩選將選出的5株菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，淀粉5 %，大豆蛋白4%，麩皮O. 5 %，硝酸鈉0.3%,磷酸二氫鉀O. 4%，玉米漿1.2%。培養(yǎng)溫度31 °C培養(yǎng)時(shí)間65小時(shí)，培養(yǎng)結(jié)束后用福林酚法測(cè)發(fā)酵液中中性蛋白酶活力，5株菌搖瓶實(shí)驗(yàn)中性蛋白酶活力如下
權(quán)利要求
1.一株高產(chǎn)中性蛋白酶的米曲霉菌株(Aspergillus oryzae),菌株保藏號(hào)為CGMCC6848。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)中性蛋白酶的米曲霉菌株，所述米曲霉菌株具有低產(chǎn)孢子、高產(chǎn)中性蛋白酶的特性，發(fā)酵活力在2. 5萬(wàn)u/ml。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)中性蛋白酶的米曲霉菌株，所述米曲霉菌株所產(chǎn)中性蛋白酶酶活力在20821u/mL以上。
4.一種利用米曲霉菌株CGMCC6848生產(chǎn)中性蛋白酶的方法，包括如下步驟。
種子培養(yǎng)菌株進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，搖瓶培養(yǎng)基配方為淀粉3-10%，大豆蛋白2-5%，麩皮O.2-0. 5%，硝酸鈉O. 2-0. 5%，磷酸二氫鉀O. 2-0. 5%，玉米漿O. 5-2% 培養(yǎng)溫度31-33 °C，培養(yǎng)時(shí)間50-70小時(shí)； 液體發(fā)酵在50L發(fā)酵罐進(jìn)行液體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，接種量10-15%，發(fā)酵過(guò)程補(bǔ)料控制pH在6.0-6. 5，培養(yǎng)溫度30-32。。，罐壓O. 07MPa,風(fēng)量O. 2-1. 5vvm,培養(yǎng)周期100-120小時(shí)；發(fā)酵后進(jìn)行中性蛋白酶的提取與精制。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種利用米曲霉菌株CGMCC6848生產(chǎn)中性蛋白酶的方法，其特征在于所述中性蛋白酶的提取與精制方法如下發(fā)酵結(jié)束后，按發(fā)酵液體積加入40%的水和O. 3%氯化鈣，加入3%珍珠巖助濾劑，進(jìn)行壓濾，濾液經(jīng)超濾濃縮后可進(jìn)行酒精溶析得到固體酶制劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述一種利用米曲霉菌株CGMCC6848生產(chǎn)中性蛋白酶的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為淀粉5-10%，大豆蛋白3-6%，麩皮1-3%，硝酸鈉O. 3-1%，磷酸二氫鉀O. 2-0. 8%,玉米漿1_2%，補(bǔ)料配方為淀粉10-20%，豆餅粉4_8%，硫酸銨O. 2-0. 5%，玉米漿O. 8-1. 5%ο
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)中性蛋白酶的米曲霉菌株在生產(chǎn)中性蛋白酶中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株高產(chǎn)中性蛋白酶的米曲霉突變株及其液體發(fā)酵方法，所述米曲霉菌株所產(chǎn)中性蛋白酶酶活力在20821u/mL以上。米曲霉突變菌株CGMCC 6848液體發(fā)酵產(chǎn)中性蛋白酶的方法，包括如下步驟1.種子培養(yǎng)；2.液體發(fā)酵；3.中性蛋白酶的提取與精制。本發(fā)明建立的液體發(fā)酵中性蛋白酶的方法，發(fā)酵活力在2.5萬(wàn)u/ml，生產(chǎn)的中性蛋白酶在40℃保溫1h后剩余酶活為91％，具有良好的耐熱性，可廣泛應(yīng)用于食品、飼料、紡織等行業(yè)。
文檔編號(hào)C12N1/15GK103013844SQ201210559100
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月20日
發(fā)明者劉順啟, 王興吉, 李方方, 劉文龍 申請(qǐng)人:山東隆科特酶制劑有限公司