專利名稱：基于多基因的丙型流感病毒實(shí)時(shí)熒光定量rt-pcr檢測(cè)試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種rRT-PCR檢測(cè)技術(shù)，具體涉及一種基于多基因的丙型流感病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)引物和探針、試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
流感病毒基因組由8條(甲、乙型)或者7條(丙型)負(fù)鏈RNA節(jié)段構(gòu)成。根據(jù)病毒的核蛋白(NP)和基質(zhì)蛋白(M)不同分為甲型、乙型、丙型。丙型流感病毒廣泛分布于自然界，偶能引起局部地區(qū)和學(xué)校暴發(fā)。丙型流感病毒普遍感染健康人群,嬰兒出生時(shí)由母體帶來(lái)的抗體,在6個(gè)月時(shí)基本消失。從I歲起，個(gè)體血清陽(yáng)性百分比逐漸增加，大約在20 30歲達(dá)到最高水平。根據(jù)日本調(diào)查，所有10歲兒童基本上都有丙型流感病毒抗體。丙型流感病毒跟A型流感病毒一樣，能引起嬰兒和老人流涕、發(fā)燒(腋下體溫^ 38°C)，出現(xiàn)感冒癥狀。中國(guó)曾于1981年和1982年由郭元吉教授在豬群中分離到2株丙型流感病毒，但中國(guó)到目前為止人群中沒(méi)有丙型流感病毒的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)。日本對(duì)丙型病毒的監(jiān)測(cè)比較完善，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)，人群感染丙型流感病毒的陽(yáng)性率高達(dá)2.5 %，可見(jiàn)丙型流感病毒的感染率并不比甲型和乙型的陽(yáng)性率低。丙型流感病毒可以通過(guò)雞胚或者細(xì)胞分離，但分離率比較低，靈敏度不高。已有的普通RT-PCR檢測(cè)技術(shù)容易引 起環(huán)境污染，檢測(cè)靈敏度低，易導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果，不適于臨床標(biāo)本的快速檢測(cè)和鑒定。另外鑒定病毒還可以通過(guò)基因測(cè)序的方法，但耗時(shí)長(zhǎng)，成本高，普通實(shí)驗(yàn)室難于完成。因此，目前尚無(wú)一種快速、靈敏的方法用于檢測(cè)丙型流感病毒及其變異株。上述現(xiàn)有技術(shù)至少存在以下缺點(diǎn):(I)操作費(fèi)時(shí)、成本高；(2)對(duì)實(shí)驗(yàn)室的軟硬件要求也比較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種操作簡(jiǎn)單、應(yīng)用方便的基于多基因的丙型流感病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑克服現(xiàn)有技術(shù)中常規(guī)基因測(cè)序的方法，耗時(shí)長(zhǎng)，成本高且對(duì)實(shí)驗(yàn)室軟硬件要求高的缺陷。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案如下:基于多基因的丙型流感病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)引物和探針，包括丙型流感病毒特異性引物和探針，所述丙型流感病毒特異性引物和探針包括丙型流感病毒HE基因特異性引物和探針、丙型流感病毒NP基因特異性引物和探針、丙型流感病毒MP基因特異性引物和探針及丙型流感病毒NS基因特異性引物和探針中的一種或任意幾種；所述丙型流感病毒特異性引物和探針針對(duì)流感病毒HE基因相對(duì)保守區(qū)域、丙型流感病毒NP基因相對(duì)保守區(qū)、針對(duì)丙型流感病毒MP基因相對(duì)保守區(qū)和/或針對(duì)丙型流感病毒NS基因相對(duì)保守區(qū)；所述丙型流感病毒特異性引物和探針是長(zhǎng)度為18 27bp的寡核苷酸片段；其中，針對(duì)HE基因和MP基因的探針與目的基因負(fù)鏈的堿基序列一致，針對(duì)NP基因和NS基因的探針與目的基因正鏈的堿基序列一致。本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明基于多基因的丙型流感病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)引物和探針，由于包括針對(duì)流感病毒HE基因相對(duì)保守區(qū)域；針對(duì)丙型流感病毒NP基因相對(duì)保守區(qū)、針對(duì)丙型流感病毒MP基因相對(duì)保守區(qū)所述丙型流感病毒NS基因和/或針對(duì)丙型流感病毒NS基因相對(duì)保守區(qū)引物和探針，可以通過(guò)rRT-PCR法檢測(cè)丙型流感病毒，操作簡(jiǎn)單、應(yīng)用方便。在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)。進(jìn)一步，所述丙型流感病毒HE基因特異性引物和探針為:正向引物(SEQID N0.1):5’-YGGAGGAAATTTRTATGC-3’，反向引物(SEQID N0.2):5’ -GCCRATCCATGTACTTTG-3’，探針(SEQID N0.3):5，-FAM-TTCAAGACRGARGCTCCAGC-BHQ1-3，；所述丙型流感病毒NP基因特異性引物和探針為:正向引物(SEQID N0.4 ):5’ -RAGGGAAAAGAAAGCAAG-3’，反向引物(SEQID N0.5): 5’ -CTGCRTGGTAGGTTATATTG-3’，探針(SEQID N0.6):5，-FAM-AGCRGACAGYAACTTCAACGC-BHQ1-3，；丙型流感病毒MP基因特異性引物和探針為:正向引物(SEQID N0.7):5’ -GACCACAATTATGCCTGAA-3’，反向引物(SEQID N0.8):5’ -TGGTGAGirGTCGGITTC-3’，探針(SEQID N0.9):5，-FAM-TCTCCCAGGTCAAGTCTCTCCC-BHQ1-3，；丙型流感病毒NS基因特異性引物和探針為:正向引物(SEQID N0.10):5，-CGTAGAAATGAAGGGRAAG-3，，反向引物(SEQ ID N0.11):5’ -CTCCACGATGATGATACA-3’，探針(SEQID N0.12):5，-FAM-CTCCAAGCAACATAGCACCAATT-BHQ1-3，。采用本發(fā)明進(jìn)一步的有益效果是:采用上述的四套引物對(duì)和探針，在丙型流感病毒變異較小的情況下，4套引物及探針檢測(cè)均為陽(yáng)性，如果丙型流感病毒發(fā)生較大變異，可能僅出現(xiàn)I套 3套引物及探針陽(yáng)性，顯著提高檢測(cè)率。本發(fā)明提供還提供基于多基因的丙型流感病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，包括檢測(cè)溶液，所述檢測(cè)溶液包括權(quán)利要求1或2所述的丙型流感病毒HE基因特異性引物和探針、丙型流感病毒NP基因特異性引物和探針、丙型流感病毒MP基因特異性引物和探針及丙型流感病毒NS基因特異性引物和探針中的一種或任意幾種。本發(fā)明提供還提供基于多基因的丙型流感病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟:(I)利用核酸提取試劑從待測(cè)樣本中提取流感病毒RNA，得到流感病毒RNA溶液；(2)反應(yīng)體系:總體積25ul，取5ul步驟(I)制得的病毒RNA溶液，
12.5ul2 X RT-PCR Buffer, lul25 X RT-PCR Enzyme Mix,加入針對(duì)丙型流感病毒 HE 基因和/或丙型流感病毒NP基因和/或丙型流感病毒MP基因和/或丙型流感病毒NS基因的檢測(cè)上游引物分別為0.5uL及下游引物分別為0.5uL，濃度均分別為40uM和探針0.5uL，濃度均分別為 20uM, RNase Free H2O 加至 25ul ；(3)步驟(2)反應(yīng)體系按下述條件進(jìn)行rRT-PCR檢測(cè):45°C/lOmin，I 個(gè)循環(huán)，95°C/lOmin, I 個(gè)循環(huán)，95。/15s, 60° /45s，40 個(gè)循環(huán)；每次循環(huán)的退火時(shí)收集熒光，檢測(cè)結(jié)果，根據(jù)擴(kuò)增曲線和Ct判定結(jié)果。
具體實(shí)施例方式結(jié)合以下實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。本發(fā)明的丙型流感病毒rRT-PCR (real-t ime RT-PCR)檢測(cè)引物和探針，包括丙型流感病毒特異性引物和探針，包括丙型流感病毒HE基因特異性引物和探針、丙型流感病毒NP基因特異性引物和探針、丙型流感病毒MP基因特異性引物和探針及丙型流感病毒NS基因特異性引物和探針中的一種或任意幾種；所述丙型流感病毒特異性引物和探針針對(duì)流感病毒HE基因相對(duì)保守區(qū)域、丙型流感病毒NP基因相對(duì)保守區(qū)、針對(duì)丙型流感病毒MP基因相對(duì)保守區(qū)和/或針對(duì)丙型流感病毒NS基因相對(duì)保守區(qū)；所述丙型流感病毒特異性引物和探針是長(zhǎng)度為18 27bp的寡核苷酸片段；其中，針對(duì)HE基因和MP基因的探針與目的基因負(fù)鏈的堿基序列一致，針對(duì)NP基因和NS基因的探針與目的基因正鏈的堿基序列一致。所述丙型流感病毒HE基因特異性引物和探針包括以下二條引物序列和一條探針序列:正向引物(SEQID N0.1):5’-YGGAGGAAATTTRTATGC-3’，反向引物(SEQID N0.2):5’ -GCCRATCCATGTACTTTG-3’，探針(SEQID N0.3):5，-FAM-TTCAAGACRGARGCTCCAGC-BHQ1-3，；所述丙型流感病毒NP基因特異性引物和探針包括以下二條引物序列和一條探針序列:正向引物(SEQ ID N0.4 ):5’ -RAGGGAAAAGAAAGCAAG-3’，反向引物(SEQID N0.5):5’ -CTGCRTGGTAGGTTATATTG-3’，探針(SEQID N0.6):5’-FAM-AGCRGACAGYAACTTCAACGC-BHQ1-3’ ；丙型流感病毒MP基因特異性引物和探針包括以下二條引物序列和一條探針序列:正向引物(SEQID N0.7):5’ -GACCACAATTATGCCTGAA-3’，反向引物(SEQID N0.8):5’ -TGGTGAGirGTCGGITTC-3’，探針(SEQ ID N0.9):5’-FAM-TCTCCCAGGTCAAGTCTCTCCC-BHQ1-3’ ；丙型流感病毒NS基因特異性引物和探針包括以下二條引物序列和一條探針序列:正向引物(SEQID N0.10):5’-CGTAGAAATGAAGGGRAAG-3’，
反向引物(SEQID N0.11):5’-CTCCACGATGATGATACA-3’，探針(SEQID N0.12):5’-FAM-CTCCAAGCAACATAGCACCAATT-BHQ1-3’。上述探針序列兩端的標(biāo)記FAM、BHQl為熒光素標(biāo)記。本發(fā)明應(yīng)用上述的丙型流感病毒rRT-PCR檢測(cè)引物和探針檢測(cè)丙型流感病毒的試劑盒，包括檢測(cè)溶液，所述檢測(cè)溶液所述的丙型流感病毒HE基因特異性引物和探針、丙型流感病毒NP基因特異性引物和探針、丙型流感病毒MP基因特異性引物和探針及丙型流感病毒NS基因特異性引物和探針中的一種或任意幾種。本發(fā)明應(yīng)用上述的丙型流感病毒rRT-PCR檢測(cè)引物和探針檢測(cè)丙型流感病毒的方法:首先，利用核酸提取試劑從待測(cè)樣本中提取流感病毒RNA，得到流感病毒RNA溶液；再建立r-RT-PCR反應(yīng)體系:總體積25ul，取5ul步驟(I)制得的病毒RNA 溶液，12.5ul2 X RT-PCR Buffer, lul25 X RT-PCR Enzyme Mix,加入針對(duì)丙型流感病毒HE基因和/或丙型流感病毒NP基因和/或丙型流感病毒MP基因和/或丙型流感病毒NS基因的檢測(cè)上游引物分別為0.5uL及下游引物分別為0.5uL，濃度均分別為40uM和探針0.5uL，濃度均分別為20uM, RNase Free H2O加至25ul ；再將步驟(2)反應(yīng)體系按下述條件進(jìn)行rRT-PCR檢測(cè):45°C/lOmin，I 個(gè)循環(huán)，95°C/lOmin, I 個(gè)循環(huán)，95。/15s, 60° /45s，40 個(gè)循環(huán)；每次循環(huán)的退火時(shí)收集熒光，檢測(cè)結(jié)果，根據(jù)擴(kuò)增曲線和Ct判定結(jié)果。

本發(fā)明中的引物和探針的序列(5’ 一 3’ )及檢測(cè)的靶序列片段如下:
權(quán)利要求
1.基于多基因的丙型流感病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)引物和探針，包括丙型流感病毒特異性引物和探針，其特征在于， 所述丙型流感病毒特異性引物和探針包括丙型流感病毒基因特異性引物和探針、丙型流感病毒NP基因特異性引物和探針、丙型流感病毒MP基因特異性引物和探針及丙型流感病毒NS基因特異性引物和探針中的一種或任意幾種； 所述丙型流感病毒特異性引物和探針針對(duì)流感病毒基因相對(duì)保守區(qū)域、丙型流感病毒NP基因相對(duì)保守區(qū)、針對(duì)丙型流感病毒MP基因相對(duì)保守區(qū)和/或針對(duì)丙型流感病毒NS基因相對(duì)保守區(qū)； 所述丙型流感病毒特異性引物和探針是長(zhǎng)度為18 27bp的寡核苷酸片段； 其中，針對(duì)HE基因和MP基因的探針與目的基因負(fù)鏈的堿基序列一致，針對(duì)NP基因和NS基因的探針與目的基因正鏈的堿基序列一致。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基于多基因的丙型流感病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)引物和探針，其特征在于， 所述丙型流感病毒基因特異性引物和探針為:正向引物(SEQ ID N0.1):5’-YGGAGGAAAITTRTATGC-3’，反向引物(SEQ ID N0.2):5’ -GCCRATCCATGTACTTTG-3，，探針(SEQ ID N0.3):5’-FAM-TTCAAGACRGARGCTCCAGC-BHQ1-3’ ； 所述丙型流感病毒NP基因特異性引物和探針為: 正向引物(SEQ ID N0.4):5’ -RAGGGAAAAGAAAGCAAG-3’，反向引物(SEQ ID N0.5):5’ -CTGCRTGGTAGGTTATATTG-3，，探針(SEQ ID N0.6):5’-FAM-AGCRGACAGYAACTTCAACGC-BHQ1-3’ ； 丙型流感病毒MP基因特異性引物和探針為:正向引物(SEQ ID N0.7):5’ -GACCACAATTATGCCTGAA-3’，反向引物(SEQ ID N0.8):5’-TGGTGAGTTGTCGGTTTC-3’，探針(SEQ ID N0.9):5’-FAM-TCTCCCAGGTCAAGTCTCTCCC-BHQ1-3’ ； 丙型流感病毒NS基因特異性引物和探針為:正向引物(SEQ ID N0.10):5’-CGTAGAAATGAAGGGRAAG-3’，反向引物(SEQ ID N0.11):5’-CTCCACGATGATGATACA-3’，探針(SEQ ID N0.12):5’-FAM-CTCCAAGCAACATAGCACCAATT-BHQ1-3’。
3.基于多基因的丙型流感病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)試劑盒，包括檢測(cè)溶液，其特征在于，所述檢測(cè)溶液包括權(quán)利要求1或2所述的丙型流感病毒HE基因特異性引物和探針、丙型流感病毒NP基因特異性引物和探針、丙型流感病毒MP基因特異性引物和探針及丙型流感病毒NS基因特異性引物和探針中的一種或任意幾種。
4.基于多基因的丙型流感病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，包括以下步驟: (1)利用核酸提取試劑從待測(cè)樣本中提取流感病毒RNA，得到流感病毒RNA溶液； (2)反應(yīng)體系:總體積25ul,取5ul步驟(I)制得的病毒RNA溶液，12.5ul2XRT-PCRBuffer, lul25XRT-PCR Enzyme Mix,加入針對(duì)丙型流感病毒HE基因和/或丙型流感病毒NP基因和/或丙型流感病毒MP基因和/或丙型流感病毒NS基因的檢測(cè)上游引物分別為0.5uL及下游引物分別為0.5uL，濃度均分別為40uM和探針0.5uL，濃度均分別為20uM，RNase Free H2O 加至 25ul ； (3)步驟(2)反應(yīng)體系按下述條件進(jìn)行rRT-PCR檢測(cè): 45°C/lOmin，I 個(gè)循環(huán)，95°C/IOmin, I 個(gè)循環(huán)，95° /15s, 60° /45s，40 個(gè)循環(huán)；每次循環(huán)的退火時(shí)收集熒光，檢測(cè)結(jié)果`，根據(jù)擴(kuò)增曲線和Ct判定結(jié)果。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于多基因的丙型流感病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(real-time RT-PCR，rRT-PCR)檢測(cè)試劑，包括對(duì)丙型流感病毒HE基因相對(duì)保守區(qū)域、丙型流感病毒NP基因相對(duì)保守區(qū)、針對(duì)丙型流感病毒MP基因相對(duì)保守區(qū)和針對(duì)丙型流感病毒NS基因相對(duì)保守區(qū)的4套特異性引物對(duì)及探針序列，同時(shí)公開(kāi)了待檢測(cè)樣本的處理、rRT-PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件、結(jié)果分析，能快速通過(guò)rRT-PCR法檢測(cè)丙型流感病毒，且在丙型流感病毒變異較小的情況下，4套引物及探針檢測(cè)均為陽(yáng)性，如果丙型流感病毒發(fā)生較大變異，可能僅出現(xiàn)1套～3套引物及探針陽(yáng)性，可以有效的為臨床診斷、檢驗(yàn)檢疫等領(lǐng)域的預(yù)警機(jī)制提供可行的技術(shù)支持。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103103287SQ20121057317
公開(kāi)日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2012年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月25日
發(fā)明者藍(lán)雨, 王大燕, 舒躍龍 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所