專利名稱：一種測定CoQ10抑制紫外光B輻射損傷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于紫外線輻射的防護技術(shù)領(lǐng)域，特別是提供了一種測定CoQlO(輔酶Q10)抑制紫外光B輻射損傷的方法。
背景技術(shù)：
太陽光中的紫外線輻射是一種非常顯著的環(huán)境因子，它主要作用于人的皮膚。根據(jù)波長大小，太陽光中的紫外線可以分為三類:1)長波紫外線(UVA)，波長為320 400nm，是長波紫外線，幾乎全部到達地面，能穿透真皮；2)中波紫外線(UVB)，波長為280 320nm，可以穿透皮膚，大部分可到達地面；3)短波紫外線(UVC)，波長為200 280nm，均被臭氧層所吸收，不能到達地面。日光中的紫外線，主要為長波紫外線(UVA)和中波紫外線(UVB)，是導(dǎo)致皮膚日曬傷、光老化及皮膚癌的重要因素。在相同劑量下，UVB的光損傷作用比UVA約大800-1000倍。另外紫外輻射對生物體危害作用表現(xiàn)在生態(tài)環(huán)境的破壞、引起皮膚灼傷或癌變、抑制免疫系統(tǒng)、損傷眼底或引起白內(nèi)障、加速材料的老化等。入射到地球表面的紫外輻射強度受多種因素的影響，如氣候條件、地理因素、人類活動等。人類活動引起的地球兩極臭氧空洞的形成已導(dǎo)致入射到地球表面的紫外輻射(尤其是UVB)的增強。據(jù)WHO估計，地球上的動物、植物以及浮游生物等，在未來的40 100年將會受到越來越強的UV (特別是UVB)的輻射作用，UV輻射甚至?xí)θ祟惖纳姝h(huán)境造成不可估量的影響，所以深入研究紫外輻射生物學(xué)效應(yīng)的機制，避免紫外輻射損傷并加強對其防護等具有重要意義。其中近幾十年來，由于臭氧層的破壞、過度日光浴等原因使人體暴露部位的皮膚衰老約80%以上屬于光老化。大量非保護的日光暴露，不僅有損于人的美容、使受損傷人群增多，而且可以引起皮膚松弛、粗糙、萎縮、皺紋、色素沉著、毛細血管擴張、紫癜等，其中最危險的是發(fā)展成皮膚癌。防護UV，延緩光老化日益受到人們的關(guān)注，已經(jīng)成為人們?nèi)粘Ｉ畹闹匾矫妗］o酶Q10,又名泛醌(ubiquinone),是生物體內(nèi)廣泛存在的脂溶性醌類化合物,其在生物體內(nèi)發(fā)揮關(guān)鍵的生理藥理調(diào)節(jié)作用。外源性補充的輔酶QlO在治療心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、以及皮膚抗皺等方面具有廣泛的臨床應(yīng)用。研究表明，輔酶QlO可以促進皮膚細胞增殖，促進膠原蛋白、彈性蛋白的生成，并可以抑制皮膚黑色素生成，具有光保護作用。輔酶QlO已經(jīng)被廣泛用于化妝品中以達到抗氧化和抗衰老的目的。然而其中的一些機制并未闡明。CoQlO對細胞的功能和分子功能具有重要的意義。CoQlO是線粒體呼吸鏈上的電子載體，可以通過巰基損耗，激活特定的磷酸化激酶和阻止DNA的氧化損傷而有效降低人角質(zhì)形成細胞中UV介導(dǎo)的的氧化水平上調(diào)。細胞內(nèi)源的CoQlO的水平隨年齡增加而降低，而通過飲食或外服的方式補充CoQlO有可能可以延緩老年性的皮膚老化過程。有文獻也證實CoQlO可以抵抗老年性的皮膚老化過程。CoQlO可以通過抑制成纖維組織內(nèi)MMPs的表達而減小面部皺紋面積；在經(jīng)過六個月的連續(xù)局部使用后，發(fā)現(xiàn)輔酶QlO也可以通過促進人類新生成纖維細胞的增殖，增強IV型和第七型膠原的基因表達來減少眼睛周圍的皺紋面積。另外，有一項研究也發(fā)現(xiàn)，CoQlO可以通過抑制前炎性因子PGE-2和IL-6的產(chǎn)生而阻止人皮膚成纖維細胞內(nèi)由于UV介導(dǎo)的炎性反應(yīng)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種測定CoQlO抑制紫外光B輻射損傷的方法，對輔酶QlO在保護皮膚和抑制紫外光損傷的功能上有了進一步的認識。本發(fā)明通過一系列實驗證明CoQlO具有抑制輻射光損傷的功能，顯示出對防治紫外線損傷有著優(yōu)異的效果。CoQlO添加入化妝品中可使化妝品具有抑制光輻射功效，也能夠作為降低光輻射損傷癥狀的藥品添加劑。將CoQlO添加入化妝品中可使化妝品具有抗紫外輻射的功效，也能夠作為降低皮膚炎癥因子產(chǎn)生的藥品添加劑。紫外光B輻射可直接損傷表皮細胞DNA，DNA直接吸收UVB產(chǎn)生光產(chǎn)物，主要為6_4光產(chǎn)物((6-4) PPs)和環(huán)丁烷嘧啶二聚體(CPDs)，約80% (PD如沒有修復(fù)或修復(fù)不完善，這種空間結(jié)構(gòu)的變化將阻礙DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄，進而影響蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能。UVB同時可誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧(R0S)，從而引起下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，造成生物大分子的損傷，其中包括對多種細胞因子分泌的調(diào)節(jié)。最近許多研究證實核轉(zhuǎn)錄因子NF-kappa B在皮膚光損傷和皮膚惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。通過干預(yù)核轉(zhuǎn)錄因子NF-kappa B途徑可以有效地降低光損傷。核轉(zhuǎn)錄因子-κB (Nuclear Factor Kappa B, NF-KAPPA B)屬于 REL 家族廣泛存在的轉(zhuǎn)錄子，可以調(diào)節(jié)炎癥、免疫、細胞進程、凋亡和致癌的相關(guān)基因。通常以同源或異源二聚體的形式存在，最常見的形式為p50/p65組成的二聚體。細胞在非刺激狀態(tài)下，NF-κ B與核因子κ B抑制蛋白(Inhibitor kappa B, I κ B)結(jié)合，以一種未被激活的形式存在于細胞漿。NF-kB可被多種刺激所激活，包括紫外線、炎癥細胞因子、各種絲裂原等。NF-kB是一種廣泛表達的核轉(zhuǎn)錄因子，其參與激活多種人類腫瘤，引起腫瘤細胞凋亡的抑制。已經(jīng)證實有三種途徑可以激活NF- κ B,使其從胞質(zhì)遷移入胞核，并同目標(biāo)基因E的特定序列結(jié)合。在“經(jīng)典途徑”中，例如炎癥刺激因子激活I(lǐng) κ B激酶復(fù)合物中的I ΚΚ，活化的I KK磷酸化I KBa上的絲氨酸32和36殘基 或I KBB上的絲氨酸19和23殘基而使蛋白酶體降解。IKBa的降解使NF-K B蛋白核定位序列暴露出來,從而導(dǎo)致二聚體結(jié)構(gòu)從胞質(zhì)遷移入胞核，并同DNA結(jié)合，影響基因的表達，從而引起下游細胞因子的表達增加。另外兩種激活途徑在紫外線激活NF- κ B作用機制還未闡明。從國外文獻來看，評價紫外光對皮膚細胞的損傷主要是通過檢測細胞內(nèi)CPD含量和炎癥細胞因子水平來實現(xiàn)。CPD含量檢測通常采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)，炎癥細胞因子采用的是Luminex檢測方法。而其中蛋白水平的分子相互機制則是通過蛋白質(zhì)印跡法(western-blot)來探索的。在本發(fā)明中，通過如下步驟測定表明CoQlO是否具抑制紫外光B輻射損傷的作用:1.CoQlO用水、甲醇、乙醇、DMSO溶解。 2.HaCat細胞用完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為4_10 X IO4/孔，接種于細胞板中，貼壁后換用1%、2%、3%、5%的低血清培養(yǎng)基，同時加入I所述的CoQlO溶液，CoQlO終濃度為luM、5uM、IOuM0并使用爪^(51^/0112或201111/0112)照射，分別以照射后不同時間點(4h—24h)為觀察時間點。
3.所述HaCat細胞培養(yǎng)4h—24h后，用ELISA試劑盒檢測各組細胞內(nèi)CPDs的含量。CoQlO劑量相關(guān)性的檢測:六孔板培養(yǎng)HaCat細胞，選取照射后繼續(xù)培養(yǎng)4h和24h作為觀測時間點，每個時間點都設(shè)六組:UVB未照射組(-UVB)、單純UVB照射組(UVB)、微載體組(NLC)、輔酶QlO劑量I μ M組(UVB+1 μ Μ)、輔酶QlO劑量5 μ M組(UVB+5 μ Μ)、輔酶QlO劑量10 μ M組(UVB+10 μ Μ),每個組重復(fù)兩個孔，每個孔接2 X IO5的細胞量，共需4塊六孔板，4.8 X IO6的細胞量。照射劑量為5mJ/cm2，4h — 24h之后分別收集細胞，用試劑盒提取DNA，采用硫酸魚精蛋白ELISA法檢測CPDs。4.所述HaCat細胞UVB輻射6h—24h，提取RNA，QPCR檢測細胞因子IL-1 a、IL_6、IL-8和TNF- α基因表達水平。所述HaCat細胞UVB福射6h—24h,采用Luminex檢測試劑盒檢測細胞因子IL-1 α、IL-6、IL-8 和 TNF- α 分泌情況。5.所述HaCat細胞UVB福射6h后,采用western-blot方法檢測各組NF- κ B表達情況。本實驗室前期研究結(jié)果表明，輔酶QlO可明顯抑制UVB照射之后人角質(zhì)形成細胞(HaCat細胞)和人成纖維細胞(ESF細胞)中活性氧水平和基質(zhì)金屬蛋白酶_1的產(chǎn)生和白細胞介素-1a的分泌。本發(fā)明在此基礎(chǔ)上，進一步研究了輔酶QlO對UVB照射后的角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞的DNA損傷、細胞因子表達水平的影響，并進一步研究了輔酶QlO的光保護作用機制與核轉(zhuǎn)錄因子B (NF-B)信號通路的相關(guān)性，藉此可為輔酶QlO作為防曬劑的防護開發(fā)提供理論證明，并以此為研究平臺，深入研究紫外線照射皮膚后引起皮膚一系列細胞水平、基因水平的變化及這些生物學(xué)效應(yīng)的具體分子機制。CoQlO具有抑制光輻射損傷的作用；CoQ10可以作為抗光輻射損傷的成分添加到化妝品中，CoQlO的應(yīng)用是將CoQlO添加入化妝品中，可使化妝品(包括美白爽膚水、面霜、面膜等)具有抑制光輻射的功效。也可以作為藥品用于治療光輻射損傷癥狀。


圖1顯示CoQltl對Hacat細胞輻射后CPDs含量的影響。圖2顯示CoQltl對Hacat細胞輻射細胞因子IL-1 α、IL-6, IL-8和TNF-α基因表達水平的影響。圖3顯示CoQltl對Hacat細胞輻射細胞因子IL-1 α、IL-6, IL-8和TNF- α分泌的影響。圖4顯示CoQltl對Hacat細胞輻射后NF- κ B、I κ B α和IKK α表達的影響。
具體實施例方式1、CPDs含量檢測輔酶QlO劑量相關(guān)性的研究:六孔板培養(yǎng)HaCat細胞，選取照射后繼續(xù)培養(yǎng)24h作為觀測時間點，此時間點都設(shè)六組:UVB未照射組(-UVB)、單純UVB照射組(UVB)、微載體組(NLC)、輔酶 QlO 劑量 I μ M 組(UVB+1 μ Μ)、輔酶 QlO 劑量 5 μ M 組(UVB+5 μ Μ)、輔酶 QlO 劑量10 μ M組(UVB+10 μ Μ),每個組重復(fù)兩個孔，每個孔接2 X IO5的細胞量，共需4塊六孔板，
4.8 X IO6的細胞量。照射劑量為5mJ/cm2，24h之后分別收集細胞，用試劑盒提取DNA，采用硫酸魚精蛋白ELISA法檢測CPDs。2、QPCR 檢測(I)RNA的提取實驗I)用加入 β -ME 的 Buffer RLT Plus 600ul，吹散細胞。2)渦旋30s，破碎細胞。3)將細胞裂解溶液轉(zhuǎn)移至gDNA過濾柱上，將柱置于2mL離心管中10，OOOrpm離心30s。棄柱，保留溶液。4)細胞裂解溶液中加入一個體積600 μ 170%乙醇，吹打混勻。5)轉(zhuǎn)移700 μ I樣品至RNeasy過濾柱,柱子置于2ml離心管，^ 10, OOOrpm離心30s，棄溶液。6)向RNeasy過濾柱中加入700 μ I的Buffer Rffl小心的蓋上蓋子，10, OOOrpm離心30s，棄溶液。7)向 RNeasy 過濾柱中加入 500 μ I 的 Buffer REP10, OOOrpm 離心 30s,棄溶液。8)向 RNeasy 過濾柱中加入 500 μ I 的 Buffer REP 10，OOOrpm 離心 2min,,棄溶液，將RNeasy過濾柱放入一個新的2ml離心管全速空甩離心lmin。。9)將RNeasy柱放入新的1.5ml離心管中，在膜上加入30的RNase-free water,彡10, OOOrpm離心lmin，將RNA溶解于水中。10)測定 RNA 濃度。(2)反轉(zhuǎn)錄實驗I)變性:RNA+Primer+dNTPs (共 10 μ ,不足部分用 DEPC-treated water 補足)65°C，5min，接著放置于冰上至少lmin。2)退火:cDNA合成混合物體系如下所示
權(quán)利要求
1.一種測定CoQlO抑制紫外光B輻射損傷的方法，其特征在于，測定步驟如下: (1)CoQlO用水、甲醇、乙醇、DMSO溶解； (2)HaCat細胞用完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為4-10X104/孔，接種于細胞板中，貼壁后換用1%、2%、3%、5%的低血清培養(yǎng)基，同時加入(I)所述的CoQlO溶液，CoQlO終濃度為1uM、5uM、10uM ;并使用濃度為5mJ/cm2或20mJ/cm2的UVB照射，分別以照射后4h — 24h不同時間點為觀察時間點； (3)HaCat細胞培養(yǎng)4h—24h后，用ELISA試劑盒檢測各組細胞內(nèi)CPDs的含量；CoQ10劑量相關(guān)性的檢測； (4)所述HaCat細胞UVB輻射6h—24h，提取RNA,QPCR檢測細胞因子IL-1 a、IL-6、IL-8和TNF- α基因表達水平； 所述HaCat細胞UVB輻射6h—24h，采用Luminex檢測試劑盒檢測細胞因子IL_1 α、IL-6、IL-8和TNF- α分泌情況； (5)所述HaCat細胞UVB輻射6h后，采用western-blot方法檢測各組NF-κ B表達情況。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的CoQlO劑量相關(guān)性的檢測包括:六孔板培養(yǎng)HaCat細胞，選取照射后繼續(xù)培養(yǎng)4h和24h作為觀測時間點，每個時間點都設(shè)六組:UVB未照射組(-UVB)、單純UVB照射組(UVB)、微載體組(NLC)、CoQlO劑量I μΜ組(UVB+ΙμΜ)、CoQlO 劑量 5μΜ 組(UVB+δμΜ)、CoQlO 劑量 10 μ M 組(UVB+10 μ Μ)，每個組重復(fù)兩個孔，每個孔接2 X IO5的細胞量，共需4塊六孔板，4.8 X IO6的細胞量； 照射劑量為5mJ/cm2，4h-24h之后分別收集細胞，用試劑盒提取DNA，采用硫酸魚精蛋白ELISA 法檢測 CPDs。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的CoQlO具有生物活性物質(zhì)特點CoQlOo
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的生物活性物質(zhì)特點是一種脂溶性醌，其結(jié)構(gòu)類似于維生素K，因其母核六位上的側(cè)鏈——聚異戊烯基的聚合度為10而得名，是一種醌環(huán)類化合物；分子式C59H9004，分子量863.36。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的CoQlO具有抑制光輻射損傷的作用；CoQ10的應(yīng)用是將CoQlO添加入化妝品中，使化妝品具有抑制光輻射的功效；所述的化妝品包括美白爽膚水、面霜、面膜。
全文摘要
一種測定CoQ10抑制紫外光B輻射損傷的方法，屬于紫外線輻射的防護技術(shù)領(lǐng)域。測定步驟包括CoQ10用水、甲醇、乙醇、DMSO溶解；HaCat細胞用完全培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度為4-10×104/孔，接種于細胞板中，貼壁后換用1％、2％、3％、5％的低血清培養(yǎng)基，分別以照射后4h－24h不同時間點為觀察時間點，HaCat細胞培養(yǎng)4h--24h后，用ELISA試劑盒檢測各組細胞內(nèi)CPDs的含量。優(yōu)點在于，CoQ10可以作為抗光輻射損傷的成分添加到化妝品中，也可作為美白成分應(yīng)用于化妝品中或作為藥品用于治療光輻射損傷癥狀。
文檔編號C12Q1/68GK103207276SQ201210593009
公開日2013年7月17日 申請日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者張文娟, 黨磊, 趙仁濱 申請人:北京天辰空間生物醫(yī)藥研發(fā)有限公司