專利名稱：一種用于保存動物肌肉組織中核糖核酸的試劑及應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于保存動物肌肉組織中核糖核酸的試劑及應(yīng)用方法，屬于動物基因工程和生物化學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
核糖核酸(ribonucleic acid,簡寫為RNA)是生物細胞中的遺傳信息載體,普遍存在于動物、植物、微生物及某些病毒和噬菌體內(nèi)，也是基因工程中研究基因表達以及克隆目的基因等過程需要操作的重要生物大分子。由于RNA極不穩(wěn)定，容易發(fā)生特異性或非特異性降解，所以在實驗過程中通常選用新鮮的樣本并且立刻提取純化RNA，這極大地増加了實驗的復(fù)雜程度并降低了樣品收集和處理的效率。因此，研究人員也開發(fā)了不同的方法直接保存新鮮樣本，以便以后提取完整的RNA。針對動物的肌肉組織而言，直接保存樣本以便之后提取RNA的方法主要有兩類。第一種方法是樣品采集后直接放入液氮保存。這種方法對于這對樣本的采集時間和保存具有很大的限制性，尤其體現(xiàn)在對于特殊設(shè)備的需求上，例如液氮罐。如果不能將新鮮采集的肌肉樣本立刻至于液氮中，除了 RNA分子可能發(fā)生降解之外，由于應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生新的RNA都可引起RNA狀態(tài)的改變，給后續(xù)的實驗帶來操作誤差。第二類方法是將采集的組織樣品置于市售的RNA保存液中，室溫短期保存或者低溫長期保存。但是，商品化的組織RNA保存液價格較為昂貴，且使用量較大，一般是樣本體積的5-10倍，極不經(jīng)濟。目前使用的可以手工配制的組織RNA保存液的配方均為含有多種鹽類水相體系，例如檸檬酸鈉，硫酸銨，異硫氰酸胍，こニ胺四こ酸等。其不但配制復(fù)雜，成本較高，而且水相體系還存在樣品浸潤時間較長的問題，一般需要在4攝氏度下放置24小時，使用不方便。因此，研究和開發(fā)用于保存動物肌肉組織中核糖核酸的試劑及應(yīng)用方法具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種用于保存動物肌肉組織中核糖核酸的試劑及應(yīng)用方法。利用本發(fā)明所述的有機相試劑能夠?qū)崿F(xiàn)快速浸潤和處理肌肉組織樣品，達到高效而經(jīng)濟的保存其中RNA組分的目的。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種用于保存動物肌肉組織中核糖核酸的保存液，所述保存液由こ醇、甲醇和三氯こ酸配比而成，其特征在于所述こ醇含量以體積百分比計占保存液總體積的95、9%，所述甲醇含量以體積百分比計占保存液總體積的1飛％，所述三氯こ酸含量以質(zhì)量百分比計占保存液總質(zhì)量的0. f 1%。上述用于保存動物肌肉組織中核糖核酸的保存液中所述保存液中こ醇含量以體積百分比計優(yōu)選占保存液總體積的96. 5 98%，所述甲醇含量以體積百分比計優(yōu)選占保存液總體積的2 3. 5%，所述三氯こ酸含量以質(zhì)量百分比計優(yōu)選占保存液總質(zhì)量的0. 2^0. 35%。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了一種用于保存動物肌肉組織中核糖核酸的浸潤液，所述浸潤液由甲醇和こ醇配比而成，其特征在于所述甲醇含量以體積百分比計占浸潤液總體積的90、9%，所述こ醇含量以體積百分比計占浸潤液總體積的f 10%。上述用于保存動物肌肉組織中核糖核酸的浸潤液中所述浸潤液中甲醇含量以體積百分比計優(yōu)選占浸潤液總體積的95、8%，所述こ醇含量以體積百分比計優(yōu)選占浸潤液總體積的2 5%。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了ー種保存動物肌肉組織中核糖核酸的方法，步驟是將新鮮采集的動物肌肉樣品切成粒徑不大于IOmm的塊狀，用其等體積量的上述的浸潤液沖洗1-2次,然后轉(zhuǎn)到體積量為其體積2-5倍的浸潤液中，室溫放置0. 5-2小時；之后過濾除去浸潤液；將除去浸潤液的樣品置于含有其3-10倍體積量的上述保存液的瓶中，密封瓶ロ，常溫下保存動物肌肉組織24-48小時；或4°C保存動物肌肉組織1-2周；或者置于液氮中保存動物肌肉組織1-1. 5年。其中，上述保存動物肌肉組織中核糖核酸的方法中所述樣品優(yōu)選切成粒徑為
4-5mm的塊狀。所述用于浸潤樣品的浸潤液使用體積量優(yōu)先選擇樣品體積的3_4倍，室溫放置時間優(yōu)選為1-1. 2小吋。所述用于保存樣品的保存液使用體積量優(yōu)先選擇樣品體積的
5-8倍。基于上述保存動物肌肉組織中核糖核酸的方法，在對保存的動物肌肉組織進行RNA提取之前，可直接過濾除去保存液，實施總RNA提取。本發(fā)明提供的動物肌肉組織有機浸潤液可以在常溫下快速完成肌肉組織的浸潤并用于后續(xù)的保存，與傳統(tǒng)的水相保存液相比，浸潤時間縮短了 10倍以上。本發(fā)明提供的動物肌肉組織RNA有機相保存液具有配制簡單，成本較低，使用方便的特點。同時，本發(fā)明提供的保存動物肌肉組織中核糖核酸的方法，不但降低了 RNA提取對于動物肌肉組織的保存要求，方便樣品采集，還可以把因為樣品RNA降解的原因造成的實驗失敗率降到最低，為實驗的準確性提供保障，為獲得高質(zhì)量的RNA及相關(guān)技術(shù)的研究奠定基礎(chǔ)。


圖1從本發(fā)明所述方法保存不同時間的雞肌肉組織中提取總RNA的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。其中，泳道I為從未經(jīng)保存的新鮮雞肌肉組織提取的總RNA ;泳道2為從常溫下保存48小時雞肌肉組織提取的總RNA ;泳道3為從4攝氏度保存I周雞肌肉組織提取的總RNA ;泳道4為從液氮中保存I年雞肌肉組織提取的總RNA。圖2以從本發(fā)明所述方法保存不同時間的雞肌肉組織中提取總RNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)擴增雞￠-肌動蛋白基因并進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測的結(jié)果。其中，泳道I為以從未經(jīng)保存的新鮮雞肌肉組織提取的總RNA為模板的擴增結(jié)果；泳道2為以從常溫下保存48小時雞肌肉組織提取的總RNA為模板的擴增結(jié)果；泳道3為以從4攝氏度保存I周雞肌肉組織提取的總RNA為模板的擴增結(jié)果；泳道4為以從液氮中保存I年雞肌肉組織提取的總RNA為模板的擴增結(jié)果，泳道5為D2000分子量標記。圖3從本發(fā)明所述方法保存不同時間的牛肌肉組織中提取總RNA的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果。其中，泳道I為從未經(jīng)保存的新鮮牛肌肉組織提取的總RNA ;泳道2為從常溫下保存48小時牛肌肉組織提取的總RNA ;泳道3為從4攝氏度保存I周牛肌肉組織提取的總RNA ;泳道4為從液氮中保存I年牛肌肉組織提取的總RNA。圖4以從本發(fā)明所述方法保存不同時間的牛肌肉組織中提取總RNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-PCR)擴增牛￠-肌動蛋白基因并進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測的結(jié)果。其中，泳道I為以從未經(jīng)保存的新鮮牛肌肉組織提取的總RNA為模板的擴增結(jié)果；泳道2為以從常溫下保存48小時牛肌肉組織提取的總RNA為模板的擴增結(jié)果；泳道3為以從4攝氏度保存I周牛肌肉組織提取的總RNA為模板的擴增結(jié)果；泳道4為以從液氮中保存I年牛肌肉組織提取的總RNA為模板的擴增結(jié)果，泳道5為D2000分子量標記。
具體實施例方式下面通過式實例來進ー步闡明本發(fā)明，這些實施例僅在于說明本發(fā)明而絕不限制 本發(fā)明。實施例1雞的肌肉組織中RNA的保存以取自剛孵化出的汶上蘆花雞腿部的肌肉組織為例。浸潤液的配置將9. 5ml甲醇與0. 5mlこ醇充分混勻，置于室溫待用。保存液的配置將0. 2mg三氯こ酸溶于IOmlこ醇中，振蕩至固體完全溶解，配制成三氯こ酸母液；將9. 79mlこ醇，0. 2ml甲醇和0. Olml三氯こ酸母液充分混勻，置于室溫待用。將新鮮采集的雞的肌肉組織樣品切成邊長為5mm小塊，使用0. 125ml浸潤液沖洗一次，將樣品置于0. 375ml的浸潤液中室溫放置I小時；過濾除去浸潤液；將樣品置于
0.8ml的保存液中，密封于樣品瓶中。分別在常溫下保存24小吋，4攝氏度保存I周和置于液氮中保存I年后取出樣品，過濾除去保存液。利用常規(guī)的Trizol法提取保存的雞肌肉組織總RNA :取75mg肌肉組織，加入ImlTrizol (Invitrogen Life Technologies公司)快速充分勻衆(zhòng)組織；電動勻衆(zhòng)器采用DEPC水配制的75%こ醇處理除去RNase，室溫靜置5min，使其充分裂解；加入氯仿0. 2ml，用力振搖，室溫放置3min ；4°C 12，OOOg離心15min，吸取上層水相，移置另ー離心管；加入0. 5ml冷異丙醇，將管中液體混勻，室溫靜置20min ；4°C 12，OOOg離心lOmin，棄上清；加入75%こ醇(DEPC水配制)1ml，充分洗滌沉淀，4°C 10，OOOg離心5min，棄上清，室溫干燥；加入適量的DEPC水溶解RNA。提取的總RNA均利用紫外分管光度計分別檢測260nm和280nm的吸光度A260和A280，計算二者的比值。結(jié)果為未經(jīng)保存的新鮮雞肌肉組織提取的總RNA的0D260/280值為1. 88 ;常溫下保存24小時的雞肌肉組織提取的總RNA的0D260/280值為1. 85 ;4攝氏度保存I周的雞肌肉組織提取的總RNA的0D260/280值為1. 93 ;置于液氮中保存I年雞肌肉組織提取的總RNA的0D260/280值為1. 82。純化的總RNA吸光度A260/A280比值均為1. 8-1. 95，并且不同樣本之間無明顯差別。提取的總RNA均利用常規(guī)的1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結(jié)果如附圖1所示在所有樣品中，28S和18S RNA條帶均清晰可見，5S RNA條帶也可檢測到，并且不同樣本之間
無明顯差別。提取的總RNA均進行針對管家基因￠-肌動蛋白基因的反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)擴增，所使用的引物序列為上游引物5’ -CTGACTGACCGCGTTACTCC-3’和下游引物5’-GGGGTACTTCAGGGTCAGGA-3’。然后利用常規(guī)的1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結(jié)果如附圖2所示在所有樣品中，長度為241bp的目的產(chǎn)物條帶均清晰可見，并且不同樣本之間無明
顯差別。以上結(jié)果表明利用本發(fā)明所述的保存動物肌肉組織的方法，可以高效而經(jīng)濟的保存雞的肌肉組織中的RNA。實施例2牛的肌肉組織中RNA的保存以取自魯西黃牛的腿部肌肉組織為例。 浸潤液的配置將9. 7ml甲醇與0. 3mlこ醇充分混勻，置于室溫待用。保存液的配置將0. 35mg三氯こ酸溶于IOmlこ醇中，振蕩至固體完全溶解，配制成三氯こ酸母液；將9. 69mlこ醇，0. 3ml甲醇和0. Olml三氯こ酸母液充分混勻，置于室溫待用。將新鮮采集的雞的肌肉組織樣品切成邊長為5mm小塊，使用0. 125ml浸潤液沖洗一次，將樣品置于0. 4ml的浸潤液中室溫放置1. 2小時；過濾除去浸潤液；將樣品置于
0.9ml的保存液中，密封于樣品瓶中。分別在常溫下保存48小吋，4攝氏度保存I周和置于液氮中保存I年后取出樣品，過濾除去保存液。利用常規(guī)的Trizol法提取保存的牛肌肉組織總RNA :取75mg肌肉組織，加入ImlTrizol (Invitrogen Life Technologies公司)快速充分勻衆(zhòng)組織；電動勻衆(zhòng)器采用DEPC水配制的75%こ醇處理除去RNase，室溫靜置5min，使其充分裂解；加入氯仿0. 2ml，用力振搖，室溫放置3min ；4°C 12，OOOg離心15min，吸取上層水相，移置另ー離心管；加入0. 5ml冷異丙醇，將管中液體混勻，室溫靜置20min ；4°C 12，OOOg離心lOmin，棄上清；加入75%こ醇(DEPC水配制)1ml，充分洗滌沉淀，4°C 10，OOOg離心5min，棄上清，室溫干燥；加入適量的DEPC水溶解RNA。。提取的總RNA均利用紫外分管光度計分別檢測260nm和280nm的吸光度A260和A280,計算二者的比值。結(jié)果為未經(jīng)保存的新鮮牛肌肉組織提取的總RNA的0D260/280值為1. 7 ;常溫下保存48小時的牛肌肉組織提取的總RNA的0D260/280值為1. 86 ；4攝氏度保存I周的牛肌肉組織提取的總RNA的0D260/280值為1. 78 ;置于液氮中保存I年牛肌肉組織提取的總RNA的0D260/280值為1. 79。純化的總RNA吸光度A260/A280比值均為
1.7-1. 9，并且不同樣本之間無明顯差別。純化的總RNA均利用常規(guī)的1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結(jié)果如附圖3所示在所有樣品中，28S和18S RNA條帶均清晰可見，并且不同樣本之間無明顯差別。純化的總RNA均進行針對管家基因￠-肌動蛋白基因的反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)擴增，所使用的引物序列為上游引物5’ -CACCCCGCTTCTCTCTAAGGA-3’和下游引物5’ -CTCAACCCGCTCCCAAGG-3’。然后利用常規(guī)的1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結(jié)果如附圖4所示在所有樣品中，長度為233bp的目的產(chǎn)物條帶均清晰可見，并且不同樣本之間無明顯差另1J。
以上結(jié)果表明利用本發(fā)明所述的保存動物肌肉組織的方法，可以高效而經(jīng)濟的保 存牛的肌肉組織中的RNA。
權(quán)利要求
1.一種用于保存動物肌肉組織中核糖核酸的保存液，所述保存液由乙醇、甲醇和三氯乙酸配比而成，其特征在于所述乙醇含量以體積百分比計占保存液總體積的95、9%，所述甲醇含量以體積百分比計占保存液總體積的1飛％，所述三氯乙酸含量以質(zhì)量百分比計占保存液總質(zhì)量的O. f 1%。
2.如權(quán)利要求1所述用于保存動物肌肉組織中核糖核酸的保存液，其特征在于所述保存液中乙醇含量以體積百分比計占保存液總體積的96. 5 98%，所述甲醇含量以體積百分比計占保存液總體積的2 3. 5%，所述三氯乙酸含量以質(zhì)量百分比計占保存液總質(zhì)量的O.2 O. 35%。
3.一種用于保存動物肌肉組織中核糖核酸的浸潤液，所述浸潤液由甲醇和乙醇配比而成，其特征在于所述甲醇含量以體積百分比計占浸潤液總體積的90、9%，所述乙醇含量以體積百分比計占浸潤液總體積的廣10%。
4.如權(quán)利要求3所述用于保存動物肌肉組織中核糖核酸的浸潤液，其特征在于所述浸潤液中甲醇含量以體積百分比計占浸潤液總體積的95、8%，所述乙醇含量以體積百分比計占浸潤液總體積的2 5%。
5.一種保存動物肌肉組織中核糖核酸的方法，步驟是將新鮮采集的動物肌肉樣品切成粒徑不大于IOmm的塊狀，用其等體積量的權(quán)利要求3所述的浸潤液沖洗1_2次，然后轉(zhuǎn)到體積量為其體積2-5倍的浸潤液中，室溫放置O. 5-2小時；之后過濾除去浸潤液；將除去浸潤液的樣品置于含有其3-10倍體積量的權(quán)利要求1所述保存液的瓶中，密封瓶口，常溫下保存動物肌肉組織24-48小時；或4°C保存動物肌肉組織1-2周；或者置于液氮中保存動物肌肉組織1-1. 5年。
6.如權(quán)利要求5所述保存動物肌肉組織中核糖核酸的方法，其特征在于所述樣品切成粒徑為4-5mm的塊狀。
7.如權(quán)利要求5所述保存動物肌肉組織中核糖核酸的方法，其特征在于所述用于浸潤樣品的浸潤液使用體積量選擇樣品體積的3-4倍，室溫放置時間為1-1. 2小時。
8.如權(quán)利要求5所述保存動物肌肉組織中核糖核酸的方法，其特征在于所述用于保存樣品的保存液使用體積量選擇樣品體積的5-8倍。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于保存動物肌肉組織中核糖核酸的試劑及應(yīng)用方法，所述試劑包括保存液和浸潤液，利用所述有機相試劑可快速浸潤和處理肌肉組織樣品，實現(xiàn)高效而經(jīng)濟的保存其中核糖核酸組分的目的。同時，本發(fā)明所提供的保存液具有配制簡單，成本較低，使用方便的特點，且本發(fā)明所述保存動物肌肉組織中核糖核酸的方法，不但降低了核糖核酸提取對于動物肌肉組織的保存要求，方便樣品采集，還可以把因為核糖核酸降解的原因造成的實驗失敗率降到最低，為實驗的準確性提供保障，為之后獲得高質(zhì)量的核糖核酸及進行相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。
文檔編號C12N15/10GK103013983SQ20121059477
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月31日
發(fā)明者林浴霜, 胡瑋 申請人:山東大學(xué)