專利名稱：從動物胰臟中提取胰蛋白酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及從動物胰臟中分離胰蛋白酶的方法。
背景技術(shù)：
胰蛋白酶Trypsin(Parenzyme)為蛋白酶的一種，EC3. 4. 21. 4。在脊椎動物中，作為消化酶而起作用。在胰臟是作為酶的前體胰蛋白酶原而被合成的。作為胰液的成分而分泌，受腸激酶，或胰蛋白酶的限制分解成為活化胰蛋白酶，是肽鏈內(nèi)切酶，它能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側(cè)切斷。它不僅起消化酶的作用，而且還能限制分解糜蛋白酶原、羧肽酶原、磷脂酶原等其它酶的前體，起活化作用。是特異性最強(qiáng)的蛋白酶，在決定蛋白質(zhì)的氨基酸排列中，它成為不可缺少的工具。
糜胰蛋白酶與彈性蛋白酶在結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制方面也具有密切關(guān)系，但其特異性則完全不同。胰蛋白酶系自牛、羊或豬胰中提取的一種蛋白水解酶。中國藥品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定按干燥品計算，每Img的效價不得少于2500單位。由牛、羊、豬胰臟提取而得的一種肽鏈內(nèi)切酶， 只斷裂賴氨酸或精氨酸的羧基參與形成的肽鍵。白色或米黃色結(jié)晶性粉末。溶于水，不溶于乙醇、甘油、氯仿和乙醚。分子量24000，ρΙ1(λ 5，最適pH值7.8 8. 5左右。pH > 9. O 不可逆失活。Ca2+對酶活性有穩(wěn)定作用；重金屬離子、有機(jī)磷化合物、DFP、天然胰蛋白酶抑制劑對其活性有強(qiáng)烈抑制。臨床用于抗炎消腫，工業(yè)上用于皮革制造、生絲處理、食品加工坐寸ο
胰蛋白酶為蛋白質(zhì)水解酶，能選擇地水解蛋白質(zhì)中由賴氨酸或精氨酸的羧基所構(gòu)成的肽鏈，能消化溶解變性蛋質(zhì)，對未變性的蛋白質(zhì)無作用，因此，能使膿、痰液、血凝塊等分解、變稀，易于引流排除，加速創(chuàng)面凈化，促進(jìn)肉芽組織新生，此外還有抗炎癥作用。臨床上用于膿胸、血胸、外科炎癥、潰瘍、創(chuàng)傷性損傷、瘺管等所產(chǎn)生的局部水腫、血腫及膿腫等。 噴霧吸入，用于呼吸道疾病。也可用于治療毒蛇咬傷。還常用于動物細(xì)胞培養(yǎng)前對組織的處理。
胰蛋白酶的作用是 使細(xì)胞間的蛋白質(zhì)水解從而使細(xì)胞離散。不同的組織或者細(xì)胞對胰酶的作用反應(yīng)不一樣。胰酶分散細(xì)胞的活性還與其濃度、溫度和作用時間有關(guān)，在PH 為8. O、溫度為37°C時，胰酶溶液的作用能力最強(qiáng)。使用胰酶時，應(yīng)把握好濃度、溫度和時間，以免消化過度造成細(xì)胞損傷。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白質(zhì)可降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液時應(yīng)選用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如=D-Hanks液。終止消化時，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對細(xì)胞的作用。
用現(xiàn)有的方法提取胰蛋白酶是相當(dāng)困難的。2006年7月上海阿敏制藥有限公司公開了一種糜胰蛋白酶的制備方法(200610023582. O)，其采用低溫酸提、梯度鹽析、冰水透析、親和層析、乙醇醇析的產(chǎn)品工藝，得到糜胰蛋白酶。2011年I月馬忠仁等申請了一種提取糜胰蛋白酶的方法(200910170682. X)，其采用了 CaCl2激活糜胰蛋白酶原成為糜胰蛋白酶的同時加入飽和度的(NH4)2SO4，使其生成硫酸鈣沉淀吸附糜胰蛋白酶，經(jīng)過洗脫、鹽析、 超濾和凍干獲得白色的糜胰蛋白酶的凍干粉末。產(chǎn)品均為糜胰蛋白酶的混合物，沒有單純的提取胰蛋白酶。本發(fā)明降低了成本，且能將胰蛋白酶提取出來。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從動物的胰臟中提取胰蛋白酶，實現(xiàn)糜胰蛋白酶的分離。本發(fā)明的技術(shù)方案是利用硫酸溶液將胰腺細(xì)胞中含有的酶原提取出來，然后根據(jù)等電點沉淀的原理，調(diào)節(jié)PH，硫酸銨分級鹽溶、鹽析將胰蛋白酶原等沉淀析出，包括如下步驟(I)提取エ序?qū)⑿迈r的胰臟絞碎成胰漿，稱重。按每千克胰漿加入2 3L的
0.1 0. 2mol/L硫酸溶液，浸潰20 28小吋，將浸潰物置濾袋過濾，濾干后棄去濾渣，留取濾液；(2)鹽溶エ序浸潰液中加入硫酸銨，達(dá)到30 50%飽和度，靜置10 16小吋，過濾，留取濾液；(3)鹽析エ序濾液中加入硫酸銨，達(dá)到50 80%飽和度，靜置10 16小時，過濾，留取濾餅；(4)每克濾餅加入2 5ml的水溶解，重復(fù)上述⑵、(3)操作；(5)姆克濾餅用I 3ml的水溶解,然后姆克濾餅中加入0.1 Iml的飽和硫酸銨溶液，調(diào)節(jié)pH至4.0 6.0 ;(6)結(jié)晶エ序溶液在20 30°C溫度中靜置24 72小時，有針狀糜蛋白酶結(jié)晶析出；離心，調(diào)節(jié)pH至2. 0 5. 0，每IOOOml溶液中加300 400g固體硫酸銨，達(dá)到50 80%飽和度，靜置12 16小時，抽濾；

(7)干燥エ序取沉淀物，干燥，即得胰蛋白酶粗品。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)ー步說明。實施例1所述的利用稀酸溶液將胰腺細(xì)胞中含有的酶原提取出來，然后根據(jù)等電點沉淀的原理，調(diào)節(jié)pH以沉淀除去大量的酸性雜蛋白以及非蛋白雜質(zhì)，再以硫酸銨分級鹽析將胰蛋白酶原等沉淀析出，包括如下步驟1.提取エ序1.1新鮮的胰臟，用鑷子和剪刀將脂肪結(jié)締組織等除去，置絞碎機(jī)中絞碎，稱重15Kg；1. 2絞碎物置塑料桶中，用0. 125mol/L硫酸溶液30L浸潰24小時，在浸潰期中每小時攪拌I次；1. 3將浸潰物置濾袋過濾，濾渣再用0. 125mol/L硫酸溶液15L浸潰I小吋，濾干后棄去濾渣；2.鹽溶、鹽析エ序2.1將兩次浸潰液合并,體積為44. 9L,置塑料桶中，每IOOOml溶液中加入固體硫酸銨242g，達(dá)到40%飽和度，共加10. 866Kg固體硫酸銨，靜置12小時；2. 2過濾，留取過濾液，濾液體積為44L，固體棄去；
2. 3在每IOOOml清液中加入固體硫酸銨205g，達(dá)到70 %飽和度，共用硫酸銨9.020kg，靜置12小時；
2. 4過濾，留取濾餅，稱重269. 2g，棄濾液；
2. 5用807. 6ml水溶解，再按2. 1,2. 2,2. 3,2. 4步驟分次加固體硫酸銨近40%和 70%飽和度沉淀；
2. 670%飽和度沉淀物，稱重178. 5g，用267. 8ml水溶解，加入89. 3ml飽和硫酸銨溶液，并用5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至5. 00 ;
2. 7將溶液靜置25°C恒溫箱中48小時，有針狀的糜蛋白酶粗品結(jié)晶析出；
2. 8過濾，母液用O. 25mol/L硫酸調(diào)節(jié)pH至3. O,其體積為328. 4ml加入硫酸銨 100. Sg，靜置12小時；
3.干燥工序
取沉淀物，置真空干燥箱內(nèi)干燥，即得胰蛋白酶粗品，稱重91. Sg,即每千克胰臟可得6. 12克胰蛋白酶.
實施例2
1.提取工序
1.1新鮮的胰臟，用鑷子和剪刀將脂肪結(jié)締組織等除去，置絞碎機(jī)中絞碎，稱重 IOKg;
1. 2絞碎物置塑料桶中，用O. 150mol/L硫酸溶液25L浸潰24小時，在浸潰期中每小時攪拌I次；
1. 3將浸潰物置濾袋過濾，濾渣再用O. 150mol/L硫酸溶液12. 5L浸潰I小時，濾干后棄去濾洛;
2.鹽溶、鹽析工序
2.1將兩次浸潰液合并,體積為37. 4L,置塑料桶中，每IOOOml溶液中加入固體硫酸銨225g，達(dá)到35%飽和度，共力8. 415Kg固體硫酸銨，靜置12小時；
2. 2過濾，留取過濾液，濾液體積為36. 8L,固體棄去；
2. 3在每IOOOml清液中加入固體硫酸銨186g，達(dá)到65 %飽和度，共用硫酸銨6.845kg，靜置12小時；
2. 4過濾，留取濾餅，稱重180. 2g,棄濾液；
2. 5用720. 8ml水溶解，再按2. 1,2. 2,2. 3,2. 4步驟分次加固體硫酸銨近35%和 65%飽和度沉淀；
2. 6取65%飽和度沉淀物，稱重90. 5g，用181ml水溶解，加入54. 3ml飽和硫酸銨溶液，并用5mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至5. 10 ;
2. 7將溶液靜置25°C恒溫箱中48小時，有針狀的糜蛋白酶粗品結(jié)晶析出；
2. 8過濾，母液用O. 25mol/L硫酸調(diào)節(jié)pH至2. 9，其體積為234. 7ml加入硫酸銨 82. lg，靜置15小時；
3.干燥工序
取沉淀物，置真空干燥箱內(nèi)干燥，即得胰蛋白酶粗品，稱重60. 9g，即每千克胰臟可得6. 09克胰蛋白酶
以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實施例而已，并非是對本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實質(zhì)對以 上實施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種從動物胰臟中提取胰蛋白酶的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟 (1)提取エ序?qū)游锏囊扰K絞碎成胰漿，用硫酸溶液浸潰，過濾，留取濾液； (2)鹽溶エ序濾液中加入硫酸銨，使硫酸銨的飽和度達(dá)到30 50%，靜置，過濾，留取濾液； (3)鹽析エ序濾液中加入硫酸銨，使硫酸銨的飽和度達(dá)到50 80%，靜置，過濾，留取濾餅； (4)所得濾餅加水溶解，加入飽和硫酸銨溶液，調(diào)節(jié)pH值至4.0 5. 5 ; (5)結(jié)晶エ序溶液靜置至有針狀糜蛋白酶結(jié)晶析出；離心，調(diào)節(jié)pH值至2.0 5.0，在溶液中加入固體硫酸銨，抽濾； (6)干燥エ序取沉淀物，干燥，即得胰蛋白酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在干步驟(I)中，硫酸溶液的濃度為0.1 0. 2mol/L ;胰漿與硫酸溶液的重量比為1: 2 1: 3 ;浸潰時間是20 28小吋。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在干步驟(4)中，水與濾餅的重量比為I I 3 I ;調(diào)節(jié)pH值至4.0 6.0 ;加入的飽和硫酸銨溶液與濾餅的重量比為1: 10 I Io
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟(5)中，溶解靜置環(huán)境溫度為20 300C ;調(diào)節(jié)pH值至2. 0 5. 0 ;每IOOOml溶液中加入固體硫酸銨的重量為300 400g。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述動物胰臟為新鮮的牛胰臟、新鮮的豬胰臟。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于在步驟(4)之前，還包括將所得濾餅用水溶解，重復(fù)步驟(2)和步驟(3)的操作步驟，水與濾餅的重量比為2 :1 5 :1。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從動物胰臟中提取胰蛋白酶的方法。本發(fā)明的技術(shù)方案是利用硫酸溶液將胰腺細(xì)胞中含有的酶原提取出來，然后根據(jù)等電點沉淀的原理，調(diào)節(jié)pH，硫酸銨分級鹽溶、鹽析將胰蛋白酶原等沉淀析出。本法每千克胰臟可得6克胰蛋白酶。
文檔編號C12N9/76GK103060296SQ20121059800
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月30日
發(fā)明者王議鋒, 劉翠珍, 葛翠鳳, 宋超龍 申請人:青島九龍生物醫(yī)藥有限公司