傳染性胰臟壞死病病毒標準樣品及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開傳染性胰臟壞死病病毒標準樣品及其制備方法，其屬于檢測用病毒樣品及其制備方法【技術領域】，具體包括即先將傳染性胰臟壞死病病毒分離株經特異性PCR方法及ELISA試驗檢測，通過特異序列測定分析后，進行病毒增殖和TCID50滴度測定，再通過病毒培養(yǎng)物加入蔗糖脫脂奶粉凍干，均勻性和穩(wěn)定性測試后，進行定值即為成品。傳染性胰臟壞死病病毒標準樣品成品為凍干粉末狀，1mL/支，安瓿瓶真空包裝，其為定性樣品，用于該病毒檢測的質量控制、新方法研制等。對積極開展我國水生動物及其產品檢測標準樣品的研制，添補該測量領域的空白，具有很重要的現(xiàn)實意義。
【專利說明】傳染性胰臟壞死病病毒標準樣品及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于檢測用病毒培養(yǎng)物標準品及其制備方法【技術領域】，具體涉及IPNV標準樣品及其制備方法?！颈尘凹夹g】
[0002]傳染性膜臟壞死病病毒(InfectiousPancreatic Necrosis Virus, IPNV),為雙股核糖核酸類型，病毒顆粒呈六角形或近似圓形，20面體，直徑50-72納米，少數(shù)可大到75-110納米，有單層衣殼，沒有囊膜，有92個殼粒。對乙醚、氯仿等脂溶劑、胰酶及乙二胺四乙酸不敏感，對甘油也很穩(wěn)定，對熱和酸穩(wěn)定?？梢栽诙喾N冷水性魚類的細胞株中增殖，并使細胞產生病變；而在溫水性魚類的細胞株中不增殖，也不出現(xiàn)細胞病變。敏感細胞接種病毒后，在15°C _25°C均能出現(xiàn)細胞病變，最適溫度為15-20°C。該病毒現(xiàn)有VR299、Sp、Ab、He等不同血清型。傳染性膜臟壞死病(Infectious Pancreatic Necrosis, IPN)是由傳染性胰臟壞死病病毒(Infectious Pancreatic Necrosis Virus, IPNV)引起的危害極其嚴重的一種魚病，該病是世界性魚病，主要危害溪鱒、虹鱒、克氏鮭、紅克鮭、銀大馬哈魚、枇杷鱒、紅大馬哈魚等魚苗和幼魚。最早發(fā)生在加拿大、美國，后來在丹麥、法國、希臘、英國、德國、挪威、意大利、瑞典、日本等國發(fā)生流行，本世紀80年代又傳入朝鮮、我國臺灣省及東北、山西、山東、甘肅等養(yǎng)殖虹鱒地區(qū)。在我國山西省某虹鱒養(yǎng)殖場于1986年和1987年有過二次大流行，造成90%的虹鱒稚魚死亡，東北地區(qū)也有過流行。該病往往屬于急性流行，死亡率高達50% -100%，而20周齡以上的幼魚一般不發(fā)病。此病常在水溫10°C -15°C時流行，IO0C以下或15°C以上發(fā)病少，而且病情較輕，死亡率低。發(fā)病后殘存未死的，可數(shù)年以上用到終身成為帶毒者，并通過糞例、魚卵、精液排出病毒，繼續(xù)傳播。自80年代該病傳入我國以來，隨著進出口貿易的急劇增加，IPNV已經成為口岸水生動物及其產品的檢疫對象。
[0003]實驗室的質量控制一直是人們關注的事情，傳染性胰臟壞死病已有國際或國內的標準方法。然而標準方法的使用并不總能保證測試結果的良好的重復性，針對內部質量控制，許多實驗室使用自己的標準樣品，這種樣品制備特別費時，進一步來講個體的內部標準樣品與不同的實驗室結果的比對是不可能的。為了幫助實驗室完成好的質量保證，遼寧出入境檢驗檢疫局從2005年就開始做這項工作。本標準樣品的研制成功，不僅為檢測研究、醫(yī)藥研究、應用研究提供了標準樣品的需求，同時為檢驗檢疫機構技術指導、服務出口企業(yè)提供技術上的支持。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的技術方案為，先將傳染性胰臟壞死病病毒分離株經特異性PCR方法及ELISA試驗檢測，通過特異序列測定分析后，進行病毒增殖和TCID5tl滴度測定，再通過病毒培養(yǎng)物加入蔗糖脫脂奶粉凍干，均勻性和穩(wěn)定性測試后，進行定值即為成品。
[0005]本發(fā)明所涉及的傳染性胰臟壞死病病毒標準樣品的來源是:遼寧地區(qū)實驗室分離株，IPNV毒株由遼寧出入境檢驗檢疫局的實驗室分離保存，毒株名稱:IPNV-DL。(發(fā)表的相關文章:胡曉利，李偉，肇慧君，吳斌.虹鱒魚傳染性胰臟壞死病病毒的分離與鑒定[J].中國動物檢疫，2012，29 (3):27-30)。
[0006]本發(fā)明為了完成本項標準樣品的制備工作，遼寧出入境檢驗檢疫局成立了研制工作小組，IPNV標準樣品制備工藝流程見圖1。
[0007]本發(fā)明一方面涉及一種傳染性胰臟壞死病病毒標準樣品的制備方法，其步驟包括:
[0008]a.1PNV-DL毒株感染CHSE-214細胞獲得病毒增殖液；
[0009]b.將步驟a中獲得的病毒增殖液低溫真空冷凍干燥制備成混合凍干粉；
[0010]c.檢測步驟b中獲得的混合凍干粉樣品均勻性、穩(wěn)定性后定值并分裝。
[0011]本發(fā)明的上述技術方案涉及的傳染性胰臟壞死病病毒標準樣品的制備方法，步驟a包括:將已長滿單層的CHSE-214細胞用0.05%胰酶消化，懸浮于含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基中，以I~2X IO6個細胞/細胞瓶分裝，待細胞長至培養(yǎng)單層80%面積時，倒掉含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基，加入200 μ L步驟a中的感染IPNV-DL病毒的組織病料稀釋液的上清液，20°C感作lh，再用無血清的M199培養(yǎng)基清洗兩次，覆蓋含1%甲基纖維素、2%血清的M199維持液；20°C低溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，直至細胞病變達到80%時，反復凍融3次后，40C，lOOOOrpm，離心lOmin，得上清液即為IPNV-DL病毒增殖液；
[0012]本發(fā)明的上述技術方案涉及的傳染性胰臟壞死病病毒標準樣品的制備方法，其所述步驟b中低溫真空冷凍干燥凍干保護劑為:按蔗糖:去離子水的重量體積比為5%，脫脂奶粉:去離子水的重量體積比20%配制，108°C高壓滅菌15min。
[0013]本發(fā)明的上述技術方案涉及的傳染性胰臟壞死病病毒標準樣品的制備方法，其所述步驟b中低溫真空冷凍干燥條件:將IPNV-DL病毒增殖液經6000rpm，離心IOmin去除細胞碎片后，保留上清液，在無菌操作條件下按1:1體積比和凍干保護劑混合，在_40°C冰柜中預凍24h，在設定的凍干條件進行凍干，其中所述的設定的凍干條件為冷肼溫度為_80°C，真空度30mtorr，凍干時間24h ；
[0014]本發(fā)明的上述技術方案涉及的傳染性胰臟壞死病病毒標準樣品的制備方法，其所述步驟a中感染IPNV-DL病毒的組織病料稀釋液為:用M199細胞培養(yǎng)液將感染IPNV-DL病毒的組織病料樣品勻漿、依次稀釋成1:10、1:100及1:1000三個稀釋度。
[0015]本發(fā)明的上述技術方案涉及的傳染性胰臟壞死病病毒標準樣品的制備方法，其所述步驟a中獲得病毒增殖液TCID5tl為10_8__5/0.lmL。
[0016]本發(fā)明另一方面涉及一種由上文所述方法制備的傳染性胰臟壞死病病毒標準樣品O
[0017]利于本發(fā)明上述技術方案所述方法制備傳染性胰臟壞死病病毒標準樣品，即先將傳染性胰臟壞死病病毒分離株經特異性PCR方法及ELISA試驗檢測，通過特異序列測定分析后，進行病毒增殖和TCID5tl滴度測定，再通過病毒培養(yǎng)物加入蔗糖脫脂奶粉凍干，均勻性和穩(wěn)定性測試后，進行定值即為成品。傳染性胰臟壞死病病毒標準樣品成品為凍干粉末狀，ImL/支，安瓿瓶真空包裝，其為定性樣品，用于該病毒檢測的質量控制、新方法研制等。應在生物安全II級條件下，加入2mL超純水進行水化，待樣品完全溶解后即可使用，用完之后立即放入-20°C冰箱保存。避光、-20°C條件貯存，室溫可存放30天。產品性質:乳白或淡黃色粉末。[0018]均勻性檢驗:在制備的標準樣品中隨機取8份樣品，每個樣品分為2個小樣，根據(jù)GB15805.1-2008傳染性胰臟壞死病病毒檢疫方法中的IPNV ELISA法，將測定結果進行分析統(tǒng)計，結果顯示為無顯著性差異，即所測樣品是均勻的。
[0019]穩(wěn)定性檢驗:在兩種溫度類型條件下，對標準樣品進行穩(wěn)定性試驗(GB15805.1-2008傳染性胰臟壞死病病毒檢疫方法中的IPNV ELISA法):一種是在貯存溫度(-200C )下的穩(wěn)定性試驗，隨機取24份樣品(樣品A和B)，每個月檢測2份，共計12個月；另一種是在較高的溫度(模擬樣品的運輸條件4°C)下的穩(wěn)定性試驗，樣品取24份，每I天檢測2份共計12天。將測定結果分析統(tǒng)計，無顯著性差異即所測樣品是均勻的、穩(wěn)定的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1.1PNV-DL標準樣品制備工藝流程。
[0021]圖2.1PNV-DL PCR擴增結果，經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結果顯示擴增出224bp大小的片段，與預期相符。1:DL2000Marker ;2~7 =PCR擴增產物擴增出224bp大小的片段；8:陰性對照。
[0022]圖3.PCR擴增產物測序后與GENBANK上公布的多株IPNV核苷酸序列進行比對分析，序列比對結果顯示擴增片段的核苷酸與多株IPNV序列同源性較高。
[0023]圖4.CHSE-214細胞隨感染IPNV-DL時間的增長細胞病變檢測圖；圖4a:正常 CHSE-214 細胞 100X ;圖 4b:CHSE-214 細胞 100X (接毒 48h)；圖 4c:CHSE_214 細胞100X(接毒72h);圖4d:CHSE-214細胞100X (接毒72h);從圖示結果分析可以證明:IPNV接種單層CHSE-214細胞48h后，細胞開始聚集、圓縮脫落，細胞病變結果如圖所示。結果顯示CHSE-214細胞隨感染IPNV時間的增長，細胞病變越加明顯。
【具體實施方式】
[0024]下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0025]本發(fā)明中使用的傳染性胰臟壞死病病毒感染病料由本實驗室保存(發(fā)表的相關文章:胡曉利，李偉，肇慧君，吳斌.虹鱒魚傳染性胰臟壞死病病毒的分離與鑒定[J].中國動物檢疫，2012，29 (3):27-30)。M199培養(yǎng)基為美國Gibco公司產品；胎牛血清購自杭州四季青生物工程公司。PCR試劑 盒、蛋白酶K均購自大連TaKaRa有限公司；pMD18_T載體，宿主菌DH5 a、PCR試劑盒、分子量標準DL-2000、DNA快速純化回收試劑盒、質粒提取試劑盒等均為TaKaRa公司產品；IPNV ELISA檢測試劑盒購自TEST-LINE Ltd ;氨芐青霉素(Amp)為上海生工公司產品；其余試劑均為分析純產品。CHSE-214細胞購自ATCC。
[0026]根據(jù)IPNV-DL的保守基因N基因序列，設計特異性引物，由寶生物公司合成，序列如表1，利用該特異性引物分別擴增224bp大小的片段。引物終濃度均為20i!mOl/L。
[0027]表1檢測IPNV-DL的引物序列
[0028]
【權利要求】
1.一種傳染性胰臟壞死病病毒標準樣品的制備方法，其特征在于，制備步驟包括: a.感染IPNV-DL病毒的組織病料稀釋液接種CHSE-214細胞獲得病毒增殖液；步驟包括:將已長滿單層的CHSE-214細胞用0.05%胰酶消化，懸浮于含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基中，以I~2X IO6個細胞/細胞瓶分裝，待細胞長至培養(yǎng)單層80%面積時，倒掉含10%胎牛血清的M199培養(yǎng)基，加入200 μ L步驟a中的感染IPNV-DL病毒的組織病料稀釋液的上清液，20°C感作lh，再用無血清的M199培養(yǎng)基清洗兩次，覆蓋含1%甲基纖維素、2%血清的M199維持液；20°C低溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，直至細胞病變達到80%時，反復凍融3次后，40C，lOOOOrpm，離心lOmin，得上清液即為IPNV-DL病毒增殖液； b.將步驟a中獲得的病毒增殖液低溫真空冷凍干燥制備成混合凍干粉；所述低溫真空冷凍干燥條件:將IPNV-DL病毒增殖液經6000rpm，離心IOmin去除細胞碎片后，保留上清液，在無菌操作條件下按1:1體積比和凍干保護劑混合，在_40°C冰柜中預凍24h，在設定的凍干條件進行凍干，其中所述的設定的凍干條件為冷肼溫度為_80°C，真空度30mton.，凍干時間24h ;所述凍干保護劑為:按蔗糖:去離子水的重量體積比為5%，脫脂奶粉:去離子水的重量體積比20%配制，108°C高壓滅菌15min ； c.檢測步驟b中獲得的混合凍干粉樣品均勻性、穩(wěn)定性后定值并分裝。
2.根據(jù)權利要求1所述的標準樣品的制備方法，其特征在于，所述步驟a中感染IPNV-DL病毒的組織病料稀釋液為:用M199細胞培養(yǎng)液將感染IPNV-DL病毒的組織病料樣品勻漿、依次稀釋成1:10、1:100及1:1000三個稀釋度。
3.根據(jù)權利要求1`所述的標準樣品的制備方法，其特征在于，所述步驟a中獲得病毒增殖液 TCID5tl 為 10_8…5/0.ImL0
4.由權利要求1所述的方法制備的傳染性胰臟壞死病病毒標準樣品。
【文檔編號】C12N7/00GK103614342SQ201310554941
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月7日 優(yōu)先權日:2013年11月7日
【發(fā)明者】吳斌, 肇慧君, 胡強, 宋立奇 申請人:吳斌, 肇慧君, 胡強, 宋立奇