用于檢測(cè)薩賓口服脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗病毒的基因組中的核苷酸置換的試驗(yàn)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了用于特異性地并且同時(shí)檢測(cè)所有三種血清型的活減毒口服脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗（薩賓）病毒、疫苗樣和疫苗衍生的脊髓灰質(zhì)炎病毒的基因組中的突變的多重SNP試驗(yàn)方法和引物。重要地，本發(fā)明的引物和試驗(yàn)消除了對(duì)昂貴、費(fèi)時(shí)和復(fù)雜程序，如完整的基因組測(cè)序的需求。這種新的試驗(yàn)?zāi)軌蛟诜浅６痰臅r(shí)間內(nèi)測(cè)試幾種樣品。因此，該試驗(yàn)是非常簡(jiǎn)單、快速且有成本效益的。還提供了包含該新引物的試劑盒。
【專利說明】用于檢測(cè)薩賓口服脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗病毒的基因組中的
核苷酸置換的試驗(yàn)
發(fā)明領(lǐng)域:
[0001]本發(fā)明廣義地屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，并且具體涉及用于檢測(cè)活減毒口服脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗(薩賓)病毒、疫苗樣和疫苗衍生的脊髓灰質(zhì)炎病毒的基因組中的特定位點(diǎn)的突變的新引物，以及含有上述引物的試劑盒。
[0002]發(fā)明背景:
[0003]Albert B Sabin博士研發(fā)了用于免疫對(duì)抗癱瘓型脊髓灰質(zhì)炎的活減毒口服脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗。他通過細(xì)致的實(shí)驗(yàn)室工作，從產(chǎn)生所有三種血清型的野生型脊髓灰質(zhì)炎病毒的疾病中非常小心地分離出突變的病毒株。將這些減毒(非神經(jīng)毒性)脊髓灰質(zhì)炎病毒株用于產(chǎn)生活減毒口服脊髓灰質(zhì)炎疫苗，該疫苗在全世界已經(jīng)使用了 50多年。薩賓還研發(fā)了用于在猴子中評(píng)價(jià)脊髓灰質(zhì)炎病毒的神經(jīng)毒性(NVT)的測(cè)試。NVT已經(jīng)成為用于證明口服脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗減毒的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量控制測(cè)試。最近已經(jīng)研發(fā)了轉(zhuǎn)基因小鼠中的神經(jīng)毒性測(cè)試，作為猴子NVT的替代方案。
[0004]NVT可檢驗(yàn)脊髓灰質(zhì)炎病毒的生物學(xué)性狀(減毒與毒性)。盡管NVT可以將毒性的嚴(yán)重程度分級(jí)，但其不能確定病毒的基因組性狀。
[0005]在20世紀(jì)80年代，描述了區(qū)分野生和薩賓OPV株的抗原和分子標(biāo)記。將全基因組測(cè)序、克隆和重組DNA技術(shù)用于了解薩賓減毒的及其親本野生的脊髓灰質(zhì)炎病毒之間的基因組差異。這些研究導(dǎo)致與薩賓疫苗脊髓灰質(zhì)炎病毒的減毒性狀相關(guān)的特定突變的檢測(cè)。
[0006]以下表1中給出了最有可能的減毒位點(diǎn):
[0007]研發(fā)了分子測(cè)試，即，通過PCR和限制酶切割(MAPREC)的突變分析，以定量薩賓疫苗株中單個(gè)位點(diǎn)(5’未翻譯區(qū)內(nèi)的主要減毒位點(diǎn))上的突變及其與NVT結(jié)果的關(guān)聯(lián)。WHO已經(jīng)推薦該測(cè)試用于測(cè)試脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗的質(zhì)量。最近，已經(jīng)研發(fā)了通過實(shí)時(shí)PCR的突變檢測(cè)。也已經(jīng)研發(fā)了能夠檢測(cè)整個(gè)脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組中的突變的微矩陣芯片。
[0008]美國(guó)專利5585477和5691134涉及用于檢測(cè)臨床樣品中的脊髓灰質(zhì)炎病毒的特異性引物，并且由此將其與非脊髓灰質(zhì)炎腸病毒(NPEV)區(qū)分開來，但沒有描述基于其遺傳性狀(即，特異性地基于減毒位點(diǎn))來區(qū)分脊髓灰質(zhì)炎病毒的特異性試驗(yàn)方法。
[0009]完整的基因組測(cè)序和全基因組微矩陣能夠確定所有已知脊髓灰質(zhì)炎減毒位點(diǎn)的精確核苷酸(A、T、G或C)，但仍然不存在快速且方便的試驗(yàn)來作為上述在單個(gè)試驗(yàn)中同時(shí)檢測(cè)脊髓灰質(zhì)炎病毒I (六個(gè)位點(diǎn))、2 (三個(gè)位點(diǎn))和3 (2個(gè)位點(diǎn))的所有已知減毒位點(diǎn)的突變的昂貴且復(fù)雜技術(shù)的替換方案。
[0010]發(fā)明目的:
[0011]本申請(qǐng)的目的在于提供用于同時(shí)檢測(cè)這三種血清型的活減毒口服脊髓灰質(zhì)炎疫苗(薩賓)病毒、疫苗樣和疫苗衍生的脊髓灰質(zhì)炎病毒的基因組中的特定位點(diǎn)的突變的多重PCR試驗(yàn)。
[0012]本發(fā)明的另一個(gè)重要目的是提供用于同時(shí)檢測(cè)這三種血清型的脊髓灰質(zhì)炎病毒的基因組中的特定減毒位點(diǎn)的突變的新引物。[0013]本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供用于多重PCR試驗(yàn)中的包含上述引物的試劑盒，所述試驗(yàn)用于同時(shí)檢測(cè)這三種血清型的活減毒口服脊髓灰質(zhì)炎疫苗(薩賓)病毒、疫苗樣和疫苗衍生的脊髓灰質(zhì)炎病毒的基因組中的特定位點(diǎn)的突變。
[0014]發(fā)明陳述
[0015]根據(jù)本發(fā)明，提供了用于同時(shí)檢測(cè)這三種血清型的活減毒口服脊髓灰質(zhì)炎疫苗(薩賓)病毒、疫苗樣和疫苗衍生的脊髓灰質(zhì)炎病毒的基因組中的特定位點(diǎn)的突變或SNP的試驗(yàn)和引物。
[0016]發(fā)明概述:
[0017]本發(fā)明涉及用于同時(shí)檢測(cè)這三種血清型的活減毒口服脊髓灰質(zhì)炎疫苗(薩賓)病毒、疫苗樣和疫苗衍生的脊髓灰質(zhì)炎病毒的基因組中的特定位點(diǎn)的突變的試驗(yàn)和新引物。本發(fā)明還提供了包含用于檢測(cè)上述病毒的基因組中的所有特定位點(diǎn)上的突變的引物的試劑盒。
[0018]參考表/流程圖/實(shí)施例等的本發(fā)明的簡(jiǎn)述:
[0019]圖1&1A描繪了對(duì)于薩賓脊髓灰質(zhì)炎病毒I和對(duì)照靶向的特定位置的核苷酸的突變-SNaP射擊試驗(yàn)(shot assay)的結(jié)果。
[0020]圖2&2A描繪了對(duì)于薩賓脊髓灰質(zhì)炎病毒2和對(duì)照靶向的特定位置的核苷酸的突變-SNaP射擊試驗(yàn)的結(jié)果。
[0021]圖3&3A描繪了對(duì)于薩賓脊髓灰質(zhì)炎病毒3和對(duì)照靶向的特定位置的核苷酸的突變-SNaP射擊試驗(yàn)的結(jié)果。
[0022]圖4描繪了 2%瓊脂糖凝膠上的第一步多重PCR結(jié)果。
[0023]表1提供了脊髓灰質(zhì)炎病毒的基因組中最有可能的減毒位點(diǎn)。
[0024]表2提供了用于制備目標(biāo)特異性區(qū)域的DNA擴(kuò)增子的引物。
[0025]參考附圖/實(shí)施例的本發(fā)明的詳述
[0026]參考表、附圖等以及特定的實(shí)施方案描述了本發(fā)明；該描述不是想要以限制意義來解釋。在參考本發(fā)明的描述時(shí)，本發(fā)明的各種供替換的實(shí)施方案將是本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的。因此預(yù)期這些供替換的實(shí)施方案可形成本發(fā)明的一部分。
[0027]本發(fā)明提供了一種試驗(yàn)方法；一套特異性的新引物和包含這些特異性引物的試劑盒，用于在單個(gè)試驗(yàn)中同時(shí)檢測(cè)所有三種亞型的脊髓灰質(zhì)炎病毒的所有已知減毒位點(diǎn)的核苷酸，所述三種亞型即脊髓灰質(zhì)炎病毒I (六個(gè)位點(diǎn))，2 (三個(gè)位點(diǎn))和3 (2個(gè)位點(diǎn))。
[0028]該試驗(yàn)的其他優(yōu)點(diǎn)在于可以利用相同原理進(jìn)一步擴(kuò)展至包括另外的位點(diǎn)。該試驗(yàn)基于多重逆轉(zhuǎn)錄PCR，以將脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組RNA轉(zhuǎn)變成cDNA和DNA擴(kuò)增子。然后將PCR產(chǎn)物用于多重SNP試驗(yàn)。使用Genetic Analyzer解析SNP試驗(yàn)產(chǎn)物，以鑒定脊髓灰質(zhì)炎病毒基因組中的減毒位點(diǎn)的核苷酸(圖1至3)。該試驗(yàn)適用于大量樣品，并且用于測(cè)試疫苗以及現(xiàn)場(chǎng)分離物。該試驗(yàn)方法可以轉(zhuǎn)變成定量試驗(yàn)。
[0029]試駘的詳細(xì)內(nèi)容:
[0030]1.從各種 來源獲得脊髓灰質(zhì)炎病毒樣品(已知血清型，例如，脊髓灰質(zhì)炎病毒1、2或3)。(從糞便樣品分離1、2和3型脊髓灰質(zhì)炎病毒，從NIBSc.PK獲得口服脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗(薩賓)株)。
[0031]2.使用反義PCR引物合成cDNA，并且在單個(gè)多重逆轉(zhuǎn)錄和PCR反應(yīng)中產(chǎn)生DNA擴(kuò)增子。
[0032]3.純化PCR產(chǎn)物(DNA擴(kuò)增子)。
[0033]4.使用本發(fā)明的“新引物”進(jìn)行多重單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)試驗(yàn)[目前用于I型脊髓灰質(zhì)炎病毒的試驗(yàn)包括6個(gè)引物對(duì)，2型包括3個(gè)引物對(duì)，3型包括2個(gè)引物對(duì)多重體]。
[0034]5.通過Genetic Analyzer上的電泳解析SNP,檢索數(shù)據(jù)，并且使用Gene Mapper軟件分析這些數(shù)據(jù)。
[0035]本發(fā)明的新穎性和創(chuàng)造性在新的引物設(shè)計(jì)、用于同時(shí)檢測(cè)所有減毒位點(diǎn)的突變的多重試驗(yàn)的便利性和特異性以及包含這些特異性引物的試劑盒中是固有的。為了更好地理解本發(fā)明，如下提供進(jìn)一步的詳細(xì)內(nèi)容:
[0036]表1:脊髓灰質(zhì)炎病毒的基因組中最有可能的減毒位點(diǎn)
[0037]
脊髓灰質(zhì)炎病毒(薩賓)減毒位點(diǎn)減毒等位基因&基因組位置_
脊髓灰質(zhì)炎病毒 I6480-G、935-T、2438-A、2795-A、2879-T、
___6203-C_
脊髓灰質(zhì)炎病毒 2__3__481-A, 2908-A、2909-T_
脊髓灰質(zhì)炎病毒32_ 472-Τ、2034-T_
[0038]1.引物的設(shè)計(jì):用于檢測(cè)特`異性突變的新PCR引物
[0039]a.引物比待研究的減毒位點(diǎn)短一個(gè)核苷酸
[0040]b.已經(jīng)設(shè)計(jì)了可變長(zhǎng)度的5’端尾，并且結(jié)合在引物中。
[0041]c.尾片段不與引物靶向的基因組序列反應(yīng)(互補(bǔ))。
[0042]d.設(shè)計(jì)遞增長(zhǎng)度的引物(堿基對(duì)),使得在Genetic Analyzer中解析時(shí)，以遞升次序首先表示第一個(gè)減毒位點(diǎn)，而最后一個(gè)位點(diǎn)在最后。
[0043]2,試駘方法
[0044]a.該試驗(yàn)?zāi)軌蜩b定靶向的所有核苷酸位置的等位基因，即，可以檢測(cè)脊髓灰質(zhì)炎病毒1、2和3中的所有減毒位點(diǎn)的核苷酸。
[0045]b.如果應(yīng)當(dāng)包括新位點(diǎn)，可以在一個(gè)多重試驗(yàn)中結(jié)合其他引物。
[0046]c.對(duì)于三種脊髓灰質(zhì)炎病毒血清型，設(shè)計(jì)不同的引物組。
[0047]d.一個(gè)試驗(yàn)中可以研究所有減毒位點(diǎn)。
[0048]表2:用于制備目標(biāo)特異性區(qū)域的DNA擴(kuò)增子的引物
[0049]
【權(quán)利要求】
1.用于同時(shí)檢測(cè)三種血清型的脊髓灰質(zhì)炎病毒的基因組中的特定位點(diǎn)的突變或SNP的試驗(yàn)，其包括以下步驟: a.從各種來源獲得脊髓灰質(zhì)炎病毒樣品， b.通過使用反義PCR引物合成cDNA，產(chǎn)生步驟a的脊髓灰質(zhì)炎病毒的DNA擴(kuò)增子， c.純化步驟b的DNA擴(kuò)增子， d.使用SEQID 1-1I的PCR引物，進(jìn)行多重單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)試驗(yàn)， e.通過電泳解析SNP, f.檢索數(shù)據(jù)，并使用GeneMapper軟件分析這些數(shù)據(jù)。
2.如權(quán)利要求1中所要求的用于同時(shí)檢測(cè)三種血清型的脊髓灰質(zhì)炎病毒的基因組中的特定位點(diǎn)的突變或SNP的試驗(yàn)，其中所述病毒選自1-型脊髓灰質(zhì)炎病毒(薩賓病毒)、2-型脊髓灰質(zhì)炎病毒和3-型脊髓灰質(zhì)炎病毒。
3.如權(quán)利要求1中所要求的用于同時(shí)檢測(cè)三種血清型的脊髓灰質(zhì)炎病毒的基因組中的特定位點(diǎn)突變的或SNP的試驗(yàn)，其中所述引物序列IDl至6檢測(cè)1-型脊髓灰質(zhì)炎病毒(薩賓病毒)中的SNP，引物序列ID7至9檢測(cè)2-型脊髓灰質(zhì)炎病毒中的SNP，引物序列IDlO至II用于檢測(cè)3-型脊髓灰質(zhì)炎病毒中的SWP。
4.如權(quán)利要求1中所要求的用于同時(shí)檢測(cè)三種血清型的脊髓灰質(zhì)炎病毒的基因組中的特定位點(diǎn)的突變或SNP的試驗(yàn)，其中所述引物檢測(cè)三種血清型的活減毒口服脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗(薩賓)病毒、疫苗樣和疫苗衍生的脊髓灰質(zhì)炎病毒中的SNP。
5.如權(quán)利要求1中所要求的用于同時(shí)檢測(cè)三種血清型的脊髓灰質(zhì)炎病毒的基因組中的特定位點(diǎn)的突變或SNP的試驗(yàn)，其中所述引物在其長(zhǎng)度上具有變化。
6.如權(quán)利要求5中所要求的用于同時(shí)檢測(cè)三種血清型的脊髓灰質(zhì)炎病毒的基因組中的特定位點(diǎn)的突變或SNP的試驗(yàn)，其中引物中的變化是比待研究的減毒位點(diǎn)短一個(gè)核苷酸。
7.如之前所述權(quán)利要求任一項(xiàng)中要求的試驗(yàn)，其中所述引物已經(jīng)設(shè)計(jì)成結(jié)合可變長(zhǎng)度的5’端尾。
8.如之前所述權(quán)利要求任一項(xiàng)中要求的試驗(yàn)，其中以遞增的長(zhǎng)度設(shè)計(jì)引物，使得當(dāng)在Genetic Analyzer中解析時(shí)，以遞升次序首先表示第一個(gè)減毒位點(diǎn)，而最后一個(gè)位點(diǎn)在最后。
9.如權(quán)利要求1中所要求的試驗(yàn)，其中如果要包括新的位點(diǎn)，則可以將附加引物并入一個(gè)多重試驗(yàn)中。
10.用于檢測(cè)所有三種血清型的活減毒口服脊髓灰質(zhì)炎病毒疫苗(薩賓)病毒、疫苗樣和疫苗衍生的脊髓灰質(zhì)炎病毒的基因組中的特定位點(diǎn)的突變或SNP的試劑盒，其中該試劑盒包含所述序列ID I至II的引物。
【文檔編號(hào)】C12Q1/70GK103717756SQ201280023280
【公開日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2012年3月7日 優(yōu)先權(quán)日:2012年3月7日
【發(fā)明者】J·M·達(dá)什潘德, S·S·南迪, D·K·沙瑪 申請(qǐng)人:印度醫(yī)學(xué)研究理事會(huì)