白細胞分析系統(tǒng)和方法
【專利摘要】本發(fā)明提供用于分析血液樣本、且更具體來說用于進行白細胞(WBC)差異分析的系統(tǒng)和方法。所述系統(tǒng)和方法借助于熒光染色和熒光觸發(fā)策略來篩查WBC。因此，來自未溶解紅細胞(RBC)和溶解RBC的片段的干擾被大致上消除。所述系統(tǒng)和方法還使得能夠開發(fā)適用于測定含有易碎WBC的樣本的相對溫和的WBC試劑。在一個實施方案中，所述系統(tǒng)和方法包括：(a)用就發(fā)射光譜而言對應于血液學儀器的激發(fā)源的專有細胞膜可透性熒光染料染色血液樣本；(b)使用熒光觸發(fā)器篩查所述血液樣本的WBC；并且(c)使用(1)軸向光損失、(2)中等角度散射、(3)90°偏振側(cè)向散射、(4)90°去偏振側(cè)向散射以及(5)熒光發(fā)射的測量結(jié)果來進行差異分析。
【專利說明】白細胞分析系統(tǒng)和方法
[0001]相關申請的交叉引用
[0002]本申請根據(jù)美國法典35篇119條(e)款要求題為分析白細胞的方法(MethodFor Analyzing White Blood Cells)并在2011年5月4日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/482，541的權益，所述臨時專利申請的全部公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。
[0003]本申請還涉及2012年4月26日提交的、代理人案卷號為ADDV-017 (11041US01)，題為“有核紅細胞分析系統(tǒng)和方法(NUCLEATED RED BLOOD CELL ANALYSIS SYSTEMAND METHOD) ”的申請?zhí)杧x/xxx，xxx ；和2012年4月26日提交的、代理人案卷號為ADDV-018(11042US01)，題為“嗜堿性粒細胞分析系統(tǒng)和方法(BASOPHIL ANALYSIS SYSTEMAND METHOD) ”的申請?zhí)杧x/xxx, xxx,這些申請的全部公開內(nèi)容以引用的方式整體并入本文。
【技術領域】
[0004]本發(fā)明涉及血液學系統(tǒng)和方法。更具體來說，本發(fā)明涉及用于分析血液樣本以鑒定、分類和/或定量血液樣本中的白細胞(WBC)和WBC子群體的系統(tǒng)和方法。
【背景技術】
[0005]開發(fā)用于分析WBC (包括計數(shù)和分類)的準確且高效的血液學測定已成為一個挑戰(zhàn)。開發(fā)準確且高效的測定具有困難的一個原因在于WBC在樣本中的總血細胞中的濃度相對較低(約0.1%至0.2%)。努力使用于分析WBC以及配制強健WBC試劑的先進方法工程化仍然是自動血液學分析 儀領域中的一個最優(yōu)先考慮事項。
[0006]通常，溶解紅細胞(RBC)是在計數(shù)和分類WBC和WBC子群體之前消除來自RBC的干擾且濃縮WBC所需的。更具體來說，準確且高效的WBC分析要求:(I)在小于30秒內(nèi)完全溶解RBC ； (2)在溶解之后使RBC的大片段斷裂成小片；以及(3)保存WBC用于準確計數(shù)和恰當分類。如果血液樣本“溶解不足”，那么未溶解RBC即使在極小濃度下也會干擾WBC計數(shù)和差異分析。類似地，溶解RBC的較大片段可干擾WBC計數(shù)和差異分析。實際上，難以使未溶解RBC和/或溶解RBC的較大片段與淋巴細胞(最小的WBC)分離。如果血液樣本“溶解過度”，那么由于對WBC的細胞膜的過度損傷對WBC的分類可能會受不利影響。
[0007]在一些情況下，WBC分析的困難性可能因為存在兩種特殊類型的樣本:即含有溶解抗性紅細胞(rstRBC)的樣本和含有易碎淋巴細胞的樣本而加劇。在樣本含有rstRBC的情況下，WBC計數(shù)和淋巴細胞百分比由于除真實淋巴細胞以外的粒子的影響而被錯誤地報道為“較高”，從而對患者造成不當診斷和治療的風險。在樣本含有易碎淋巴細胞的情況下，損傷淋巴細胞在WBC差異分析中可能不顯示其特征。此外，暴露的WBC核可被計數(shù)為有核紅細胞(nRBC)，從而在某些測定中產(chǎn)生假陽性nRBC計數(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本文提供用于分析血液樣本、且更具體來說用于進行白細胞(WBC)差異分析的系統(tǒng)和方法。一般說來，所公開的系統(tǒng)和方法借助于突光染色和突光觸發(fā)策略篩查WBC。因此，來自未溶解RBC (例如rstRBC)和RBC片段的干擾被大致上或完全消除，由此確保對WBC和WBC子群體的準確計數(shù)和區(qū)別。所述系統(tǒng)和方法還使得能夠開發(fā)適用于測定含有易碎淋巴細胞(或其它易碎WBC)的樣本(包括老化樣本)的相對溫和的WBC試劑。
[0009]在一個實施方案中，舉例而言，本文公開的系統(tǒng)和方法包括:(a)用就發(fā)射光譜而言對應于血液學儀器的激發(fā)源的專有細胞膜可透性熒光染料染色血液樣本；(b)使用熒光觸發(fā)器篩查所述血液樣本的WBC ;以及(c)使用(I)軸向光損失、(2)中等角度散射、
(3)90°偏振側(cè)向散射、(4)90°去偏振側(cè)向散射以及(5)熒光發(fā)射的測量結(jié)果的組合來進行差異分析。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]并入本文的附圖構成說明書的一部分。附圖連同本書面描述一起進一步用于說明提供的系統(tǒng)和方法的原理，并且使得相關領域技術人員能夠制造和使用提供的系統(tǒng)和方法。在附圖中，相同參考數(shù)字指示相同或功能上類似的元件。
[0011]圖1A-1E顯示全血樣本的頻率曲線，其顯示在溶解之后的WBC和RBC殘余物。
[0012]圖1A是顯示軸向光損失信號的測量結(jié)果的頻率曲線。
[0013]圖1B是顯示中等角度散射的測量結(jié)果的頻率曲線。 [0014]圖1C是顯示90°偏振側(cè)向散射的測量結(jié)果的頻率曲線。
[0015]圖1D是顯示90°去偏振側(cè)向散射的測量結(jié)果的頻率曲線。
[0016]圖1E是顯示熒光的測量結(jié)果的頻率曲線。
[0017]圖2是顯示使用熒光觸發(fā)器排除對RBC的任何片段的考慮的細胞圖。
[0018]圖3是顯示使用熒光觸發(fā)器排除對RBC的任何片段的考慮的另一細胞圖。
[0019]圖4是示出血液學儀器的示意圖。
[0020]圖5A-5J顯示五部分WBC差異分析的細胞圖。
[0021]圖5A是描繪軸向光損失對中等角度散射的細胞圖。
[0022]圖5B是描繪90°偏振側(cè)向散射對軸向光損失的細胞圖。
[0023]圖5C是描繪90°偏振側(cè)向散射對中等角度散射的細胞圖。
[0024]圖是描繪90°去偏振側(cè)向散射對軸向光損失的細胞圖。
[0025]圖5E是描繪90°去偏振側(cè)向散射對中等角度散射的細胞圖。
[0026]圖5F是描繪90°去偏振側(cè)向散射對90°偏振側(cè)向散射的細胞圖。
[0027]圖5G是描繪熒光對軸向光損失的細胞圖。
[0028]圖5H是描繪熒光對中等角度散射的細胞圖。
[0029]圖51是描繪熒光對90°偏振側(cè)向散射的細胞圖。
[0030]圖5J是描繪熒光對90°去偏振側(cè)向散射的細胞圖。
[0031]圖6A是示出使用傳統(tǒng)方法分析含有溶解抗性RBC的全血樣本的細胞圖。
[0032]圖6B是根據(jù)所提出的一個實施方案由熒光觸發(fā)的血液學分析儀產(chǎn)生的顯示軸向光損失對中等角度散射的細胞圖。
[0033]圖7A是示出使用傳統(tǒng)方法分析老化全血樣本的細胞圖。
[0034]圖7B是根據(jù)所提出的一個實施方案由熒光觸發(fā)的血液學分析儀產(chǎn)生的顯示軸向光損失對中等角度散射的細胞圖。
【具體實施方式】
[0035]本文提供用于分析血液樣本、且更具體來說用于進行白細胞(WBC)差異分析以鑒定、分類并且計數(shù)WBC和WBC子群體的系統(tǒng)和方法。一般說來，所公開的系統(tǒng)和方法借助于熒光染色和熒光觸發(fā)策略來篩查WBC。因此，來自如溶解抗性紅細胞(rstRBC)的未溶解紅細胞(RBC)和RBC片段的干擾被大致上消除。所公開的系統(tǒng)和方法由此確保對WBC和WBC子群體的準確計數(shù)和區(qū)別。所述系統(tǒng)和方法也使得能夠開發(fā)適于測定含有易碎淋巴細胞(或其它易碎WBC)的樣本(包括老化樣本)的相對溫和的WBC試劑。
[0036]在一個實施方案中，舉例而言，本文公開的系統(tǒng)和方法包括:(a)用就發(fā)射光譜而言對應于血液學儀器的激發(fā)源的專有細胞膜可透性熒光染料染色血液樣本；(b)使用熒光觸發(fā)器篩查所述血液樣本的WBC ;以及(c)使用(I)軸向光損失、(2)中等角度散射、
(3)90°偏振側(cè)向散射、(4)90°去偏振側(cè)向散射以及(5)熒光發(fā)射的測量結(jié)果的組合來進行WBC差異分析。
[0037]如本文所用，表述“熒光信息”意指從血液學分析儀的熒光通道收集的數(shù)據(jù)。如本文所用，表述“熒光通道”意指設置在合適的波段下的用于測量自樣本發(fā)射的熒光的量的檢測裝置，如光電倍增管。
[0038](I)熒光染料的使用。
[0039]WBC在其核中含有相對較高濃度的DNA。然而，成熟RBC不含有DNA。因此，選擇熒光染料來區(qū)別兩類血細胞；即含有核酸的血細胞和不含有核酸的血細胞。染料的目的在于易于穿透到活細胞中，以高親和力結(jié)合DNA，并且在染料由適當光源激發(fā)時以足夠斯托克斯位移(Stokes shift)發(fā)射強烈熒光。染料在可見波段中的峰吸收大致上匹配光源波長(在50nm光源波長內(nèi)、更優(yōu)選在25nm光源波長內(nèi))以適當激發(fā)染料并獲得最佳結(jié)果。
[0040]所選熒光染料優(yōu)選:1)能夠結(jié)合核酸，2)能夠穿透WBC的細胞膜，3)當經(jīng)受光源時可在所選波長下激發(fā)，4)在由光源激發(fā)后發(fā)射熒光，并且5)在液體中具有生物穩(wěn)定性和可溶性。染料可選自由以下組成的組:卩丫唳橙(acridine orange)、SYBRl1、SYBR綠系列染料、碘化己錠(hexidium iodide)、SYTOl1、SYTOl2, SYTOl3, SYT014、SYT016、SYT021、RNA選擇性SYT0、SYT024、SYT025及其任何等效物。染料用于“活化”WBC，并且基于血液學分析儀中配置的熒光觸發(fā)器來“篩出”未溶解RBC和RBC的片段。染料通常以約0.1ng/mL至約0.lmg/mL的濃度存在。盡管各種染料可用，但所選染料通常與血液學分析儀的激發(fā)源配對以便使用單一專有染料在意圖受鑒定、定量和/或分析的所有WBC子群體中進行染色并激發(fā)熒光發(fā)射。因此，單一(即專有)染料可用于同時鑒定、定量和分析所有WBC子群體。
[0041]在一個實施方案中，以WBC試劑形式、以足以進行染色并且活化多達每微升1，000X 103個WBC的量、與以下各物組合來提供熒光染料:1)至少一種表面活性劑；2)至少一種緩沖劑；3)至少一種鹽；以及/或4)至少抗微生物劑。如“TRITON” X-100或皂素(saponin)的至少一種表面活性劑用于破壞RBC的膜，并且減小RBC的片段的大小。所述至少一種表面活性劑通常以約0.001%至約5%的濃度存在。如來自“TRIADINE”或“PR0CLIN”家族的抗微生物劑的至少一種抗微生物劑用于防止試劑受微生物污染。至少一種抗微生物劑的濃度應足以在所需保存期限保存試劑。如磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或4-(2-羥乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(HEPES)的至少一種緩沖劑用于調(diào)整反應混合物的pH以控制RBC的溶解和保存WBC。至少一種緩沖劑通常以約0.01%至約3%的濃度存在。pH通常在約3至約12的范圍內(nèi)。如NaCl或Na2SO4的至少一種鹽用于調(diào)整重量摩爾滲透濃度(osmolality，或同滲重摩)以增加溶解效應和/或使WBC保存最優(yōu)化。至少一種鹽可以約0.01%至約3%的濃度存在。在某些情況下，至少一種緩沖劑可充當至少一種鹽，或至少一種鹽可充當至少一種緩沖劑。一般說來，較低重量摩爾滲透濃度或低張性用于加速RBC溶解。重量摩爾滲透濃度通常在約20m0sm至約250m0sm的范圍內(nèi)。
[0042]可在以約I體積份樣本對約35體積份WBC試劑的比率混合血液樣本與WBC試劑之后，使RBC在高于室溫的溫度(例如在約30°C至約50°C之間，如約40°C )下歷經(jīng)相對較短的時期(例如小于約25秒、小于約17秒、或甚至小于約9秒)發(fā)生溶解。用多個光學通道和至少一個熒光通道收集分析數(shù)據(jù)。
[0043]圖1A-E用收集的光學信息的頻率曲線和熒光信息的頻率曲線顯示真實WBC與未溶解RBC和RBC片段的分離。圖1A中的頻率曲線顯示軸向光損失(ALL)的測量結(jié)果。圖1B中的頻率曲線顯示中等角度散射(IAS)的測量結(jié)果。圖1C中的頻率曲線顯示90°偏振側(cè)向散射(PSS)的測量結(jié)果。圖1D中的頻率曲線顯示90°去偏振側(cè)向散射(DSS)的測量結(jié)果。圖1E中的頻率曲線顯示熒光(FLl)的測量結(jié)果。在頻率曲線(histograms)中，水平軸指示檢測通道的值(或通道名稱，即ALL、IAS、PSS、DSS或FLl)。垂直軸指示血液樣本的組分的計數(shù)。在頻率曲線中，線100指示RBC殘余物，并且線200指示W(wǎng)BC。如本文所用，“RBC殘余物”與“RBC的片段”同義。如通過比較圖1E與圖1A-1D所示，熒光信息顯示兩組粒子(即WBC和RBC 殘余物)之間的分離比任何光學通道獲得的分離好得多，由此有助于隨后分析。
[0044](2)熒光觸發(fā)器的使用。
[0045]在由光源激發(fā)熒光染料后，血細胞發(fā)射不同量級的熒光信號。熒光信號的量級差異由細胞內(nèi)部的核酸(即DNA)的量產(chǎn)生。DNA的量越大，熒光信號較高的可能性越大。此外，穿透細胞膜的功效、染料大小、染料與DNA之間的結(jié)合動力學、染料與DNA之間的親和力及其它因素也會影響熒光信號。成熟RBC發(fā)射最小熒光信號，因為在成熟RBC內(nèi)不存在DNA0有核紅細胞(nRBC)發(fā)射非常強的熒光信號，不僅因為nRBC的核內(nèi)部存在DNA，而且因為nRBC的膜在溶解程序期間被破壞所以染色也更容易。未溶解RBC或RBC片段不發(fā)射熒光，但其可發(fā)射非常弱的自體熒光。如參照圖1E所示，發(fā)射強得多的熒光信號的細胞是具有核的細胞，即WBC(和nRBC，當存在時)。
[0046]因此，本文提供的系統(tǒng)和方法使用熒光觸發(fā)器來收集和分析WBC。舉例而言，通常在來自RBC的信號與來自WBC的信號之間設置的熒光觸發(fā)器可用于單獨收集來自WBC的信號供進一步分析用。使用FLl觸發(fā)器的兩個實施例顯示于圖2和圖3中。圖2是顯示使用熒光觸發(fā)器消除RBC的任何片段(無核粒子)以及收集含核事件(例如WBC和/或nRBC)的細胞圖。熒光染料是吖啶橙并且熒光染料的濃度是3 μ g/mL。熒光光電倍增管的電壓設定為350伏特。圖3是顯示使用熒光觸發(fā)器消除RBC的任何片段(無核粒子)以及收集含核事件(例如WBC和/或nRBC)的細胞圖。熒光染料是吖啶橙并且熒光染料的濃度是
0.03 μ g/mL。熒光光電倍增管的電壓設定為500伏特。在使用吖啶橙染色(即使在染料濃度顯著不同下，即圖2中的3 μ g/mL和圖3中的0.03 μ g/mL)和適當設置FLl觸發(fā)器的WBC測定中，僅FLl觸發(fā)器以上的事件是含核事件(例如WBC和/或nRBC (如果存在))并且因此被捕獲供進一步分析用。
[0047](3)用于分析的多個光學通道和至少一個熒光通道的使用。
[0048]在一個實施方案中,借助于多角度偏振散射分離技術(MAPSS)進行WBC差異分析，其中熒光信息得以增強。至少一個光電二極管或至少一個光電倍增管或至少一個光電二極管與至少一個光電倍增管兩者是檢測由穿過流動池的各血細胞散射的光所需的。兩個或更多個光電二極管用于測量度量約0°散射的ALL信號和度量低角度(例如約3°至約15° )散射的IAS信號。兩個或更多個光電倍增管用于檢測90° PSS信號和90° DSS信號。對適當波長范圍內(nèi)的FLl測量來說，取決于對光源波長的選擇而需要其它光電倍增管。因此，在系統(tǒng)上捕獲的各事件展現(xiàn)多方面的信息，如ALL、IAS (—個或多個通道)、PSS、DSS和熒光(一個或多個通道)。來自這些檢測通道的信息用于進一步分析血細胞。
[0049]圖4是示出適于血液學分析(包括流式細胞術)的裝置的發(fā)光和檢測光學器件的不意圖?，F(xiàn)參照圖4,裝置10包括光源12、用于光束彎曲的前鏡14和后鏡16、含有第一圓柱形透鏡20和第二圓柱形透鏡22的光束擴展器模塊18、聚焦透鏡24、精細光束調(diào)整器26、流動池28、前向散射透鏡30、靶心檢測器32、第一光電倍增管34、第二光電倍增管36和第三光電倍增管38。靶心檢測器32具有用于0°光散射的內(nèi)部檢測器32a和用于7°光散射的外部檢測器32b。
[0050]在隨后論述中，光源優(yōu)選是激光器。然而，也可使用其它光源，例如像燈(例如萊燈、氣燈)。光源12可為可商購自Coherent, Inc.，Santa Clara, CA的垂直偏振氣冷Coherent Cube激光器?？墒褂貌ㄩL在350nm至700nm的范圍內(nèi)的激光器。激光器的操作條件大致上與當前與 “CELL-DYN”自動血液學分析儀一起使用的激光器的操作條件類似。
[0051]關于流動池、透鏡、聚焦透鏡、精細光束調(diào)整機構和激光聚焦透鏡的其它細節(jié)可見于以引用的方式并入本文的美國專利號5，631，165中，尤其在第41欄第32行至第43欄第11行。圖4中所示的前向光路系統(tǒng)包括球面平凸透鏡30和位于透鏡的后聚焦平面中的兩元件光電二級管檢測器32。在這個構造中，兩元件光電二極管檢測器32內(nèi)的每個點映射來自穿過流動池28移動的細胞的光的一個特定收集角。檢測器32可以是能夠檢測軸向光損失(ALL)和中等角度前向散射(IAS)的靶心檢測器。美國專利號5，631，165在第43欄第12-52行描述這個檢測器的各種替代物。
[0052]第一光電倍增管34(PMT1)測量去偏振側(cè)向散射(DSS)。第二光電倍增管36 (PMT2)測量偏振側(cè)向散射(PSS)，并且視所選熒光染料和所用光源而定，第三光電倍增管38(PMT3)測量自440nm至680nm的熒光發(fā)射。光電倍增管在廣泛波長范圍內(nèi)收集熒光信號以增加信號強度。側(cè)向散射和熒光發(fā)射由二向色光束分離器40和42導向這些光電倍增管，所述二向色光束分離器在所需波長下高效傳輸和反射以使得能夠進行高效檢測。美國專利號5，631，165在第43欄第53行至第44欄第4行描述關于光電倍增管的各種其它細節(jié)。
[0053]當通過使用浸潰收集系統(tǒng)(immersion collection system)測量突光時,在光電倍增管34、36和38處的靈敏性得以增強。浸潰收集系統(tǒng)是借助于折射率匹配層使第一透鏡30光學連接于流動池28，從而使得能夠在寬泛角度上收集光的收集系統(tǒng)。美國專利號5，631，165在第44欄第5_31行描述這個光學系統(tǒng)的各種其它細節(jié)。[0054]集光器44是一種用于高分辨率顯微術中的具有足夠用于受衍射限制的成像的像差校正的光學透鏡系統(tǒng)。美國專利號5，631，165在第44欄第32-60行描述這個光學系統(tǒng)的各種其它細節(jié)。
[0055]圖4中所示的其它部件(即狹縫46、場透鏡48和第二狹縫50)的功能描述于美國專利號5，631，165第44欄第63行至第45欄第26行中。插入光電倍增管的光路中以改變所檢測光的波長或偏振化或波長與偏振化兩者的光學濾光片52或56和偏光器52或56也描述于美國專利號5，631，165第44欄第63行至第45欄第26行中。適用于本文中的光學濾光片包括帶通濾光片和長通濾光片。
[0056]光電倍增管34、36和38檢測側(cè)向散射(在軸近似垂直于入射激光光束的錐體中散射的光)或熒光(在與入射激光光束的波長不同的波長下自細胞發(fā)射的光)。
[0057]盡管以上參考美國專利號5，631，165的所選部分，但美國專利號5，631，165以引用的方式整體并入本文。
[0058]圖5A-J顯示增強的五部分WBC差異分析的一個實施例。使用MAPSS技術和FLl通道分離嗜中性粒細胞(NE)、淋巴細胞(LY)、單核細胞(MO)、嗜酸性粒細胞(EO)和嗜堿性粒細胞(BA)。圖5A中的細胞圖顯示ALL對IAS。圖5B中的細胞圖顯示90° PSS對ALL。圖5C中的細胞圖顯示90° PSS對IAS。圖中的細胞圖顯示90° DSS對ALL。圖5E中的細胞圖顯示90° DSS對IAS。圖5F中的細胞圖顯示90° DSS對90° PSS。圖5G中的細胞圖顯示FLl對ALL。圖5H中的細胞圖顯示FLl對IAS。圖51中的細胞圖顯示FLl對90° PSS。圖5J中的細胞圖顯示FLl對90。DSS。
[0059]除從四個傳統(tǒng)MAPSS通道(ALL、IAS、PSS、DSS)收集的信息之外，F(xiàn)Ll通道進一步區(qū)分細胞子群體(圖5G至 5J，包括圖5G和5J)。對于使用吖啶橙作為篩查WBC的染料的情況，相對于其它WBC子群體，即嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和淋巴細胞，嗜堿性粒細胞顯示相對較低的FLl信號，并且單核細胞顯示相對較高的FLl信號。在細胞圖中，點510代表嗜中性粒細胞，點520代表嗜酸性粒細胞，點530代表淋巴細胞，點540代表嗜堿性粒細胞，并且點550代表單核細胞。來自所有光學維度和熒光維度的組合定量信息提供對含有WBC的血液樣本的增強且更可靠的差異分析。
[0060]圖6A是示出使用傳統(tǒng)方法分析含有rstRBC的全血樣本的細胞圖。圖6A顯示使用可商購的“CELL-DYN” Sapphire?血液學分析儀獲得的ALL對IAS的細胞圖。圖6B是使用FLl觸發(fā)器增強的血液學分析儀獲得的顯示ALL對IAS的細胞圖。全血樣本與圖6A中分析的全血樣本相同。熒光染料吖啶橙的濃度為3 μ g/mL。結(jié)果顯示本文所述的方法準確且高效用于先前提及的兩種最具挑戰(zhàn)性的情況。在傳統(tǒng)方法中，未溶解RBC(即出現(xiàn)在細胞圖的左下方的事件)被認為是淋巴細胞，由此導致WBC計數(shù)較高和淋巴細胞百分比較高。圖6B顯示通過本文所述的方法分析含有rstRBC的樣本的WBC的結(jié)果。在本文所述的方法中，對WBC的分析是準確的，因為無RBC或RBC殘余物被識別到。
[0061]圖7A是示出使用傳統(tǒng)方法分析含有更多易碎WBC的老化(28小時之久)全血樣本的細胞圖。圖7A是使用“CELL-DYN” Sapphire?血液學分析儀獲得的顯示ALL對IAS的細胞圖。圖7B是使用FLl觸發(fā)器增強的血液學分析儀獲得的顯示ALL對IAS的細胞圖。全血樣本與圖7A中分析的全血樣本相同。熒光染料吖啶橙的濃度為3 μ g/mL。
[0062]本文所述的方法增強血液學分析儀對WBC的分析。本文所述的方法提供更準確的WBC計數(shù)和對WBC子群體的更準確分類，因為來自未溶解RBC和RBC片段的干擾被大致上消除。使用熒光為改進WBC的差異分析提供進一步信息。當分析具有rstRBC的樣本和具有易碎WBC的樣本時，本文所述的方法顯示超過傳統(tǒng)方法的優(yōu)勢。
[0063]其它實施方案
[0064]在一個實施方案中，提供一種用于對已用突光染料染色的血液樣本進行WBC差異分析的血液學分析儀。所述分析儀包括被定位來激發(fā)血液樣本內(nèi)的粒子的激發(fā)源。所述分析儀進一步包括多個檢測器，包括:(I)軸向光損失檢測器，其被定位來測量所激發(fā)血液樣本的軸向光損失；(2)中等角度散射檢測器，其被定位來測量所激發(fā)血液樣本的中等角度散射；(3)偏振側(cè)向散射檢測器,其被定位來測量所激發(fā)血液樣本的90°偏振側(cè)向散射；
(4)去偏振側(cè)向散射檢測器，其被定位來測量所激發(fā)血液樣本的90°去偏振側(cè)向散射；以及(5)熒光檢測器，其被定位來測量從所激發(fā)血液樣本發(fā)射的熒光。所述分析儀進一步包括處理器，其被配置來接收來自所述多個檢測器的(I)軸向光損失、(2)中等角度散射、
(3)90°偏振側(cè)向散射、(4)90°去偏振側(cè)向散射以及(5)熒光的測量結(jié)果。所述處理器也被配置來基于發(fā)射高于熒光閾值的熒光的粒子的所有五種測量結(jié)果進行血液樣本的WBC差異分析。處理器可進一步被配置來預篩查接收的測量結(jié)果排除對不滿足熒光閾值的任何粒子的考慮。 軸向光損失檢測器可測量在0°散射下的軸向光損失。中等角度散射檢測器可測量在約3°至約15°下的光角度散射。多個檢測器可包括一個或多個光電倍增管。激發(fā)源可為被配置來在對應于熒光染料的波長下發(fā)射光的激光器?；蛘撸蛇x擇熒光染料以與激發(fā)源對應。熒光染料可以是細胞膜可透性和核酸結(jié)合性的。
[0065]血液學分析儀可進一步包括用于以WBC試劑稀釋血液樣本的孵育子系統(tǒng)。WBC試劑可包括熒光染料和一種或多種溶解劑?；蛘撸琖BC試劑可包括(a)至少一種表面活性劑；
(b)至少一種緩沖劑或至少一種鹽；(c)至少一種抗微生物劑；以及(d)熒光染料。孵育子系統(tǒng)可被配置來持續(xù)小于約25秒、小于約17秒或小于約9秒的時期以WBC試劑孵育血液樣本。孵育子系統(tǒng)還可被配置來在范圍從約30°C至約50°C的溫度，如約40°C下以WBC試劑孵育血液樣本。
[0066]在另一實施方案中，提供一種配置血液學分析儀以對已用熒光染料染色的血液樣本進行WBC差異分析的方法。所述方法包括定位激發(fā)源以激發(fā)血液樣本內(nèi)的粒子。所述方法進一步包括定位多個檢測器以測量所激發(fā)血液樣本的(I)軸向光損失、(2)中等角度散射、(3)90°偏振側(cè)向散射、(4)90°去偏振側(cè)向散射以及(5)突光。所述方法進一步包括配置處理器，其被配置來接收來自多個檢測器的(I)軸向光損失、(2)中等角度散射、(3)90°偏振側(cè)向散射、(4)90°去偏振側(cè)向散射以及(5)熒光的測量結(jié)果。所述方法還包括配置處理器以基于發(fā)射高于熒光閾值的熒光的粒子的所有五種測量結(jié)果進行血液樣本的WBC差異分析。所述方法可包括配置處理器以預篩查所接收的測量結(jié)果從而排除對不滿足熒光閾值的任何粒子的考慮。軸向光損失檢測器可測量在0°散射下的軸向光損失。中等角度散射檢測器可測量在約3°至約15°下的光角度散射。多個檢測器可包括一個或多個光電倍增管。所述方法還可包括配置激發(fā)源以在對應于熒光染料的波長下發(fā)射光?；蛘?，可選擇熒光染料以與激發(fā)源對應。熒光染料可以是細胞膜可透性和核酸結(jié)合性的。
[0067]所述方法可進一步包括配置血液學分析儀的孵育子系統(tǒng)以用WBC試劑孵育血液樣本。WBC試劑可包括熒光染料和溶解劑。或者，WBC試劑可包括(a)至少一種表面活性劑；(b)至少一種緩沖劑或至少一種鹽；(C)至少一種抗微生物劑；以及(d)熒光染料。孵育子系統(tǒng)可被配置來持續(xù)小于約25秒、小于約17秒或小于約9秒的時期以WBC試劑孵育血液樣本。孵育子系統(tǒng)還可被配置來在范圍從約30°C至約50°C的溫度，如約40°C下以WBC試劑孵育血液樣本。
[0068]在另一實施方案中，提供一種用于進行WBC差異分析的血液學分析儀，所述血液學分析儀包括:(1)用于激發(fā)血液樣本內(nèi)的粒子的裝置，其包括定位激光光源以當所述血液樣本橫穿過所述血液學分析儀的流動池或其等效物時激發(fā)所述血液樣本；(2)用于測量來自所述血液樣本內(nèi)的所激發(fā)粒子的多個光散射信號的裝置，其包括多個檢測器(如上所論述)或其等效物；(3)用于測量來自所述血液樣本內(nèi)的所激發(fā)粒子的熒光信號的裝置，其包括熒光檢測器(如上所論述)或其等效物；(4)用于篩查所激發(fā)粒子以排除對不滿足熒光閾值的任何粒子的考慮的裝置，其包括配置有熒光觸發(fā)器的處理器(如上所論述)或其等效物；以及(5)用于基于穿過所述篩查裝置的粒子的多個光散射信號和熒光信號進行WBC差異分析的裝置，其包括被配置來進行WBC差異分析的處理器(如上所論述)或其等效物。血液學分析儀可進一步包括用于持續(xù)小于約25秒的孵育期以WBC試劑孵育血液樣本的裝置，其包括孵育子系統(tǒng)(如上所論述)或其等效物。血液學分析儀可進一步包括用于在范圍從約30°C至約50°C的溫度下以WBC試劑孵育血液樣本的裝置，其包括孵育子系統(tǒng)(如上所論述)或其等效物。
[0069]在另一實施方案中，提供一種用自動血液學分析儀進行WBC分析的方法。所述方法包括:(a)用WBC試劑稀釋全血樣本，其中所述WBC試劑包括RBC溶解劑(lysingagent，裂解劑)和穿透WBC膜并 且結(jié)合WBC核酸的熒光染料；(b)在范圍從約30°C至約50°C的溫度下持續(xù)小于約25秒的孵育期孵育步驟(a)的所稀釋血液樣本；(c)將來自步驟(b)的所孵育樣本遞送至血液學分析儀中的流動池；(d)當所孵育樣本橫穿過所述流動池時，用激發(fā)源激發(fā)來自步驟(c)的所孵育樣本；(e)收集來自所激發(fā)樣本的多個光散射信號和熒光發(fā)射信號；以及(f)基于步驟(e)中收集的所有信號進行WBC差異分析，同時基于熒光發(fā)射信號排除對所述稀釋血液樣本內(nèi)不滿足熒光閾值的任何粒子的考慮。WBC試劑可包括:(a)至少一種表面活性劑；(b)至少一種緩沖劑或至少一種鹽；(c)至少一種抗微生物劑；以及
(d)至少一種熒光染料。激發(fā)源的波長可為約350nm至約700nm?？赏ㄟ^帶通濾光片或長通濾光片在約360nm至約750nm的波長下收集突光發(fā)射。
[0070]在又一實施方案中，提供一種借助于自動血液學分析儀計數(shù)和分類WBC的方法，所述方法包括以下步驟:(a)用至少一種WBC試劑稀釋全血樣本；(b)在所選溫度范圍內(nèi)持續(xù)足夠時期孵育步驟(a)的所稀釋樣本以溶解RBC，保存WBC，使至少一種熒光染料穿透所述WBC的細胞膜，并且結(jié)合所述WBC的核內(nèi)的核酸；(c)以液流形式將步驟(b)的所孵育樣本遞送至流動池；(d)當所孵育樣本橫穿過所述流動池時借助于光源激發(fā)步驟(C)的所孵育樣本；(e)同時收集多個光學散射信號與至少一個熒光發(fā)射信號；以及(f)借助于步驟
(e)中收集的信號區(qū)別和定量WBC。實施方案的特征包括但不限于:(I)在溶解RBC的程序期間使用至少一種熒光染料來結(jié)合和染色給定血液樣本中的WBC和其它含核細胞中的核酸，并且在由來自如激光光束的給定光源的光子在適當波長下激發(fā)后誘導熒光發(fā)射；(2)使用熒光觸發(fā)器來分離和收集發(fā)射強烈熒光的事件(例如涉及WBC和其它含核細胞的事件)；(3)使用多個光學通道和至少一個熒光通道來收集數(shù)據(jù)和分析如此收集的數(shù)據(jù)以便鑒定每個細胞群體并揭示其它信息。
[0071]在又一實施方案中，本文公開的系統(tǒng)和方法包括:(a)用就發(fā)射光譜而言對應于血液學儀器的激發(fā)源的專有細胞膜可透性熒光染料染色血液樣本；(b)使用熒光觸發(fā)器來篩查所述血液樣本的WBC;以及(c)使用測量結(jié)果的組合來進行差異分析。測量結(jié)果的組合可包括一個或多個選自由以下組成的組的測量結(jié)果:軸向光損失、中等角度散射、90°偏振側(cè)向散射、90°去偏振側(cè)向散射、一個或多個熒光發(fā)射測量結(jié)果、多環(huán)中等角度散射及其任何組合或等效物。
[0072]在一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種或多種能夠執(zhí)行本文所述的功能性的計算機系統(tǒng)。舉例而言，本文論述的任何方法/分析步驟都可在具有一個或多個處理器、數(shù)據(jù)通信基礎結(jié)構(例如通信總線、交叉條或網(wǎng)絡)、顯示器接口和/或存儲體或存儲單元的計算機系統(tǒng)中實施。存儲體或存儲單元可包括具有在執(zhí)行時使處理器執(zhí)行本文所述的一個或多個功能的指令(例如控制邏輯或軟件)的計算機可讀存儲介質(zhì)。術語“計算機可讀存儲介質(zhì)”、“計算機程序介質(zhì)”和“計算機可用介質(zhì)”用于泛指介質(zhì)，如可移動存儲驅(qū)動器、可移動存儲單元、通過通信接口傳輸?shù)臄?shù)據(jù)和/或安裝在硬盤驅(qū)動器中的硬盤。所述計算機程序產(chǎn)品向計算機系統(tǒng)提供計算機軟件、指令和/或數(shù)據(jù)，所述計算機程序產(chǎn)品也用于將所述計算機系統(tǒng)從通用計算機轉(zhuǎn)變成被編程來執(zhí)行本文所述的特定功能的專用計算機。當適當時，處理器、相關部件和等效系統(tǒng)以及子系統(tǒng)因此充當用于執(zhí)行所選操作和功能的“裝置”的實例。用于執(zhí)行所選操作和功能的這類“裝置”也用于將通用計算機轉(zhuǎn)變成被編程來執(zhí)行所述所選操作和功能的專用計算機。
[0073]結(jié)論
[0074]已出于說明和描述目的提出本發(fā)明的以上描述。本篇描述不意圖是詳盡的或?qū)⒈景l(fā)明限于所公開的精 確形式。鑒于以上教導，其它修改和變化可為可能的。選擇和描述這些實施方案是為最佳地說明本發(fā)明的原理和它的實際應用，并且由此使得本領域其他技術人員能夠最佳地利用如適于所涵蓋的特定用途的各種實施方案和各種修改形式中的
【發(fā)明內(nèi)容】
。意圖將隨附權利要求解釋為包括本發(fā)明的其它替代性實施方案；包括等效結(jié)構、部件、方法和裝置。
[0075]以上詳述涉及說明一個或多個示例性實施方案的附圖。其它實施方案是可能的?？稍诓幻撾x本發(fā)明的精神和范圍下對所述實施方案進行修改。因此，詳述不意圖具有限制性。此外，概述和摘要章節(jié)可闡述本發(fā)明的一個或多個而非所有如由
【發(fā)明者】所設想的示例性實施方案，并且因此不意圖以任何方式限制本發(fā)明和隨附的權利要求。
【權利要求】
1.一種用于對已用熒光染料染色的血液樣本進行白細胞(WBC)差異分析的血液學分析儀，所述分析儀包括: 激發(fā)源，其被定位來激發(fā)所述血液樣本內(nèi)的粒子； 多個檢測器，包括(1)軸向光損失檢測器，其被定位來測量所激發(fā)血液樣本的軸向光損失；(2)中等角度散射檢測器，其被定位來測量所激發(fā)血液樣本的中等角度散射；(3)偏振側(cè)向散射檢測器，其被定位來測量所激發(fā)血液樣本的90°偏振側(cè)向散射；(4)去偏振側(cè)向散射檢測器，其被定位來測量所激發(fā)血液樣本的90°去偏振側(cè)向散射；以及(5)熒光檢測器，其被定位來測量從所激發(fā)血液樣本發(fā)射的熒光；以及處理器，其被配置來 (a)接收來自所述多個檢測器的(1)軸向光損失、(2)中等角度散射、(3)90°偏振側(cè)向散射、(4)90°去偏振側(cè)向散射以及(5)熒光的測量結(jié)果，并且 (b)基于發(fā)射高于熒光閾值的熒光的粒子的所有五種測量結(jié)果進行所述血液樣本的WBC差異分析。
2.如權利要求1所述的血液學分析儀，其中所述處理器進一步被配置來預篩查所接收的測量結(jié)果以排除對不滿足所述熒光閾值的任何粒子的考慮。
3.如權利要求1所述的血液學分析儀，其中所述軸向光損失檢測器測量在0°散射下的軸向光損失。
4.如權利要求1所述的血液學分析儀，其中所述中等角度散射檢測器測量在約3°至約15°下的光角度散射。
5.如權利要求1所述的血液學分析儀，其中所述多個檢測器包括一個或多個光電倍增管。
6.如權利要求1所述的血液學分析儀，其中所述激發(fā)源是激光器。
7.如權利要求6所述的血液學分析儀，其中所述激光器被配置來在對應于所述熒光染料的波長下發(fā)射光。
8.如權利要求1所述的血液學分析儀，其中所述熒光染料被選擇來與所述激發(fā)源對應，并且其中所述熒光染料是細胞膜可透性和核酸結(jié)合性的。
9.如權利要求1所述的血液學分析儀，其進一步包括: 孵育子系統(tǒng)，其用于以WBC試劑稀釋所述血液樣本。
10.如權利要求9所述的血液學分析儀，其中所述WBC試劑包括所述熒光染料和溶解劑。
11.如權利要求9所述的血液學分析儀，其中所述WBC試劑包括(a)至少一種表面活性劑；(b)至少一種緩沖劑或至少一種鹽；(c)至少一種抗微生物劑；以及(d)所述熒光染料。
12.如權利要求9所述的血液學分析儀，其中所述孵育子系統(tǒng)被配置來在小于約25秒的時期以所述WBC試劑孵育所述血液樣本。
13.如權利要求9所述的血液學分析儀，其中所述孵育子系統(tǒng)被配置來在小于約17秒的時期以所述WBC試劑孵育所述血液樣本。
14.如權利要求9所述的血液學分析儀，其中所述孵育子系統(tǒng)被配置來在小于約9秒的時期以所述WBC試劑孵育所述血液樣本。
15.如權利要求9所述的血液學分析儀，其中所述孵育子系統(tǒng)被配置來在范圍從約30°C至約50°C的溫度下以所述WBC試劑孵育所述血液樣本。
16.如權利要求9所述的血液學分析儀，其中所述孵育子系統(tǒng)被配置來在約40°C的溫度下以所述WBC試劑孵育所述血液樣本。
17.一種用于進行白細胞(WBC)差異分析的血液學分析儀，所述血液學分析儀包括: 用于激發(fā)血液樣本內(nèi)的粒子的裝置； 用于測量來自所述血液樣本內(nèi)的所激發(fā)粒子的多個光散射信號的裝置； 用于測量來自所述血液樣本內(nèi)的所激發(fā)粒子的熒光信號的裝置； 用于篩查所激發(fā)粒子以排除對不滿足熒光閾值的任何粒子的考慮的裝置；以及 用于基于穿過所述篩查裝置的粒子的所述多個光散射信號和所述熒光信號進行WBC差異分析的裝置。
18.如權利要求17所述的血液學分析儀，其進一步包括: 用于在小于約25秒的孵育期以WBC試劑孵育所述血液樣本的裝置。
19.如權利要求17所述的血液學分析儀，其進一步包括: 用于在范圍從約30°C至約50°C的溫度下以WBC試劑孵育所述血液樣本的裝置。
20.一種用自動血液學分析儀進行白細胞(WBC)分析的方法，所述方法包括: (a)用WBC試劑稀釋全血樣本，其中所述WBC試劑包括紅細胞(RBC)溶解劑和穿透WBC膜并且結(jié)合TOC核酸的熒光染料； (b)在范圍從約30°C至約50°C的溫度下在小于約25秒的孵育期孵育步驟(a)的所稀釋血液樣本； (C)將來自步驟(b)的所孵育樣本遞送至所述血液學分析儀中的流動池； (d)當所孵育樣本橫穿過所述流動池時，用激發(fā)源激發(fā)來自步驟(C)的所孵育樣本； (e)收集來自所激發(fā)樣本的多個光散射信號和熒光發(fā)射信號；以及 (f)基于步驟(e)中收集的所有信號進行WBC差異分析，同時基于所述熒光發(fā)射信號排除對所稀釋血液樣本內(nèi)不滿足熒光閾值的任何粒子的考慮。
21.如權利要求20所述的方法，其中所述WBC試劑包括(a)至少一種表面活性劑；(b)至少一種緩沖劑或至少一種鹽；(c)至少一種抗微生物劑；以及(d)至少一種熒光染料。
22.如權利要求20所述的方法，其中所述激發(fā)源的波長為約350nm至約700nm。
23.如權利要求20所述的方法，其中通過帶通濾光片或長通濾光片在約360nm至約750nm的波長下收集突光發(fā)射。
【文檔編號】C12M1/34GK103987834SQ201280023386
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2012年4月26日 優(yōu)先權日:2011年5月4日
【發(fā)明者】吳炯, 賈科莫·瓦卡 申請人:雅培制藥有限公司