專利名稱：應(yīng)用as-pcr檢測牛白細胞粘附缺陷的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動物分子檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種在體外檢測牛白細胞粘附缺陷 (BLAD)的方法。
背景技術(shù)：
白細胞粘附缺陷(Bovine LeukocyteAdhesion Deficiency，簡稱 BLAD)是一 種可以影響牛免疫系統(tǒng)的常染色體隱性遺傳缺陷，于1983年在美國牛群中首次發(fā)現(xiàn) (Hagemoser et al.，1983)。該遺傳缺陷主要是由白細胞表面的一種叫做整合素的糖蛋白 表達缺陷所致(Gerardi et al.，1996)，因為在炎癥反應(yīng)時，外周血液中的中性粒細胞會發(fā) 生一系列反應(yīng)，包括被趨化物質(zhì)和炎性刺激物致敏、粘附到血管內(nèi)皮上、穿過血管壁、在基 質(zhì)中向炎癥部位趨化，最終到達病原侵入的部位，對病原體直接做出反應(yīng)等，而其中最為關(guān) 鍵的是中性粒細胞與血管內(nèi)皮粘附分子相互作用而粘附到血管內(nèi)皮上，這個過程必須由中 性粒細胞表面的整合素糖蛋白分子介導(dǎo)才能發(fā)生(Springer et al. , 1990 ；Nagahata et al.，1995)。當(dāng)整合素的表達水平低于時，臨床上會出現(xiàn)嚴(yán)重的感染，甚至?xí)＜吧?整合素分子是由α亞基(⑶11)和β亞基(⑶18)以非共價鍵相連構(gòu)成的異源二聚體；每 個整合素分子都是由α亞單位和共同的β亞單位構(gòu)成才能行使功能(Kishimoto et al.， 1987 ；Springer et al.，1990)。Shuster et al. (1992)對患有 BLAD 的荷斯坦奶牛的 CD18 編碼基因進行了序列分析發(fā)現(xiàn)了兩個點突變，其中一個突變(A 383G)引起了該糖蛋白中 位于胞外高度保守區(qū)的第128位氨基酸的改變，由天門冬氨酸變成了甘氨酸，致使白細胞 表面的整合素表達明顯減少或缺乏，從而引起臨床發(fā)病。在臨床上，發(fā)病個體的白細胞為正 常個體的7-20倍，白細胞表面整合素表達減弱或者無表達(Nagahataet al.，1997)，BLAD 患病個體還表現(xiàn)為不愛運動，生長發(fā)育受阻，肝、腎變性，脾大；反復(fù)的細菌感染廣泛的卡 他性支氣管肺炎等，還可觀察到多發(fā)性肺壞死灶，胃炎，口膜潰瘍，嚴(yán)重的牙周炎，牙齦萎 縮，壞死性喉炎，頌下軟組織膨大、輕微腹瀉等(Nagahata et al. , 1995 ；Van Garderen et al.，1994)我國荷斯坦種公牛主要從美國、加拿大、德國以及澳大利亞和新西蘭等國進口，包 括進口的活牛和胚胎。以前我國對該疾病沒有足夠的認(rèn)識和重視，引入了大量潛在的BLAD 攜帶者，同時引入的大量沒有系譜資料的荷斯坦母牛，同樣是潛在的攜帶者。這些引進的種 公牛在我國的大量使用，使得我國的DUMPS攜帶者數(shù)目增加，由于沒有自主產(chǎn)權(quán)的檢測技 術(shù)，因而無法公布母牛的檢測結(jié)果，很難根據(jù)系譜推斷DUMPS的傳播途徑。我國針對遺傳性 疾病展開的工作剛剛起步，在奶牛實際育種中開展的工作還不多，并且僅局限在實驗室中 (李艷華等，2008)，我們應(yīng)該在生產(chǎn)實踐中及時檢測出冷凍精液及母牛中DUMPS的攜帶者 并予以淘汰，以減少經(jīng)濟效益的損失。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，尋找一種簡便有效的在體外檢測牛
3白細胞粘附缺陷的方法。實現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)路線如下所示本發(fā)明建立了一種快速、準(zhǔn)確檢測牛白細胞粘附缺陷的AS-PCR方法，其具體步驟 如下(1)引物設(shè)計根據(jù)GenBank提供的牛CD18序列(登錄號281877)，并根據(jù) AS-PCR的特性，利用生物學(xué)引物設(shè)計軟件Premier 5，設(shè)計了 AS-PCR擴增引物。該引物由 上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。該引物序列詳見具體實施方式
中的實施例1所
7J\ ο(2)等位基因特異性PCR(AS-PCR)提取牛血樣基因組DNA，根據(jù)PCR擴增可直接 判斷結(jié)果。若擴增的目的片段為818bp (見SEQ ID NO :2)，則為健康個體；若擴增出的目的 片段為818bp和500bp (見序列表SEQ ID NO 2和3)，則為雜合子，即BLAD疾病攜帶者；若 個體擴增出的目的片段為500bp (見SEQ ID NO :3)，則為致病純合子。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的積極效果是提供了一種快速準(zhǔn)確篩選分型BLAD的方法和特異性引物，直接應(yīng)用于牛開展 BLAD的致病基因篩選，以利于BLAD患病個體的早期淘汰。AS-PCR技術(shù)與酶切技術(shù)相比不 需要內(nèi)切酶，且省去了酶切反應(yīng)過程，具有簡便、成本低、適用大規(guī)模檢測、可檢測所有SNP 等優(yōu)勢；AS-PCR技術(shù)對引物設(shè)計要求引物的3’末端需要剛好落在突變堿基上，又不能影響 PCR擴增，因此引物設(shè)計和AS-PCR反應(yīng)條件就尤為重要。為了提高引物的特異性，可以在 3’端的第三位或者第四位引入一個錯配；傳統(tǒng)的單管AS-PCR技術(shù)是將兩對引物放入同一 體系進行擴增，引物之間可能存在競爭，導(dǎo)致某一片段占優(yōu)勢而使其他片段的擴增變?nèi)?，?響結(jié)果的判斷，并且在摸索條件時，要考慮4個引物的濃度比、各引物的退火溫度等因素的 影響。而本發(fā)明建立的兩步AS-PCR技術(shù)是將兩引物分開擴，建立兩個PCR反應(yīng)體系對同一 份DNA樣本進行擴增，然后取等量擴增產(chǎn)物混合點樣進行檢測即可判斷基因型，大大減小 了 AS-PCR反應(yīng)條件摸索的難度。


序列表SEQ ID NO :1是本發(fā)明擴增的目的片段總序列(包括500bp和818bp目的 片段)。其中，1-19位堿基為序列表SEQ ID 4是擴增牛白細胞粘附缺陷基因⑶18的特異 引物(即說明書實施例1步驟3中編號1的引物)，481-500位堿基為序列表SEQ ID 5是擴 增牛白細胞粘附缺陷基因CD18的特異引物(即說明書實施例1步驟3中編號2的引物)， 這一對引物擴增出的目的片段為500bp ；464-481位堿基為序列表SEQID 6是擴增牛白細 胞粘附缺陷基因CD18的特異引物(即說明書實施例1步驟3中編號3的引物)，1264-1281 位堿基為序列表SEQ ID 7是擴增牛白細胞粘附缺陷基因CD18的特異引物(即說明書實 施例1步驟3中編號4的引物)，這對引物擴增出的目的片段為818bp ；481位堿基位突變 位點。在序列表SEQ ID NO :1中，有兩個引物中包括突變位點481，這是根據(jù)等位基因特異 性 PCR(allele specific polymerase chain reaction，AS-PCR 的原理所設(shè)計的，即針對 不同的等位基因設(shè)計兩對平行引物，一對野生型引物PQ和一對突變型引物WM，用這兩對引 物分別擴增含對應(yīng)等位基因的目的片斷。如圖4所示引物P和M的3’末端位于等位基因
4上，P和M引物方向相反；PQ這對引物擴增含等位基因a的目的片段，麗這對引物擴增含等 位基因b的目的片段，然后根據(jù)目的片段長度和數(shù)量差異來區(qū)分不同的等位基因。AS-PCR 技術(shù)不需要限制性內(nèi)切酶，只需一步PCR擴增和凝膠電泳檢測即可區(qū)分不同的基因型。序列表SEQ ID NO :2和SEQ ID NO :3是本發(fā)明擴增的牛白細胞粘附缺陷的目的片 段，其中SEQ ID NO 2-3中包括了擴增牛白細胞粘附缺陷基因⑶18的特異引物。序列表SEQ ID :4是擴增牛白細胞粘附缺陷基因CD18的特異引物(即說明書實施 例1步驟3中編號1的引物)序列表SEQ ID 5是擴增牛自細胞粘附缺陷基因CD18的特異引物(即說明書實施 例1步驟3中編號2的引物)。序列表SEQ ID :6是擴增牛白細胞粘附缺陷基因CD18的特異引物(即說明書實施 例1步驟3中編號3的引物)。序列表SEQ ID :7是擴增牛白細胞粘附缺陷基因CD18的特異引物(即說明書實施 例1步驟3中編號4的引物)。圖1 是本發(fā)明的技術(shù)流程圖。圖2 用血樣DNA對⑶18基因進行AS-PCR擴增，瓊脂糖檢測電泳圖。瓊脂糖凝膠 濃度為2%。圖中編號說明如下1，2泳道為健康牛群基因型，擴增的產(chǎn)物長度為818bp ；3 為隱性攜帶者牛群基因型，擴增的產(chǎn)物長度為818bp和500bp ；M為Marker (2000bp)。圖3 是本發(fā)明擴增的牛白細胞粘附缺陷的目的片段，圖中下劃線的序列是擴增 的818bp片段和500bp片段的共用區(qū)。該基因片段開始和末尾的粗體字是引物序列。圖4 是等位基因PCR原理圖。
具體實施例方式下面結(jié)合實施實例并對照附圖對本發(fā)明作進一步詳細說明。實施例1 牛白細胞粘附缺陷(BLAD)基因型鑒定1、奶牛血樣的采集及處理取奶牛血樣約10mL，加入0. 5mol/L的EDTA500 μ L (使終濃度為25mmol/L)抗凝， 4°C離心(SOOOrpm) IOmin,棄上層清液，分離白細胞，加入蒸餾水，搖勻，使紅細胞破裂，離心 lOmin，棄上層清液。重復(fù)兩次后，在沉淀中加入IXSETl mL和10%十二烷基硫酸鈉(SDS， 終濃度為0. 5% )，再緩慢加入蛋白酶K(終濃度為50 100 μ g/mL)，置于55°C水浴鍋消化 8 10h，4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?、從奶牛血樣中提取總NDA(1)取消化后的試樣，加入等體積的平衡酚(pH 8. 0)，緩慢顛倒離心管10min，4°C 離心(8000rpm) IOmin。(2)小心吸取含有DNA的上清液，移至另一離心管中，再次加入平衡酚，重復(fù)上述 操作。(3)吸取的上清液中加入等體積的平衡酚/氯仿/異戊醇(體積比為 25 24 1)，緩慢顛倒離心管 10min，4°C離心(8000rpm) lOmin。(4)吸取上清液后加入等體積的氯仿/異戊醇(體積比為24 1)，緩慢顛倒離心 管 10min，4°C，8000rpm 離心 IOmin0
(5)吸取上清液，加入1/10體積3mol/L NaAC及2倍體積的無水乙醇，迅速轉(zhuǎn)動離 心管，可見白色的絮狀物，即總DNA，于_20°C放置30min。(6)取出冷凍后的樣品，于IOOOOrpm轉(zhuǎn)速離心5 8min，去掉上層乙醇，加入70% 的乙醇ImL洗滌沉淀，離心(80000rpm) 5 8min。(7)加入70%的乙醇重復(fù)洗滌一次，離心(80000rpm)5 8min。(8)棄去乙醇，在室溫下?lián)]發(fā)殘留乙醇，加入適量的TE溶解DNA。(9)將DNA樣稀釋成一定的濃度，存放于_20°C冰箱保存?zhèn)溆谩?、引物設(shè)計根據(jù)牛白細胞粘附缺陷基因CD18序列(登錄號281877)，利用生物學(xué)引物設(shè)計軟 件Premier 5，設(shè)計AS-PCR擴增引物。該引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
引物序列如下
突變型(擴增的產(chǎn)物長度為500bp)
引物 1 (正向引物)5' AAGATGACGAGGAGCAGAA 3‘
示)， 引物 2 (反向引物)5 ‘ GTCCATCAGGTAGTACAGGC 3 ‘ 示)；野生型(擴增的產(chǎn)物長度為818bp)引物 3 (正向引物)5' CAAGGGCTACCCCATCGA 3 ‘ 示)，引物 4 (反向引物)5' CAGGACTGCGTGGCTAAA 3 ‘
(見序列表SEQ ID NO 4所
(見序列表SEQ ID NO 5所
(見序列表SEQ ID N0:6所
(見序列表SEQ ID N0:7所
示)°4、AS-PCR 擴增PCR反應(yīng)總體積為20 μ L (見表1)。擴增程序是94°C預(yù)熱IOmin — 94°C變性 45s — 65°C 45s — 72延伸45s (從第二步94°C變性到第四步72延伸進行35個循環(huán))，72°C 延伸 IOmin — 15°C IOmin0表IPCR反應(yīng)體系
反應(yīng)體系
體積
10倍緩沖液 25mM Mg2+ IOuM引物1、引物3 IOuM引物2、引物4 Tag酶(5υ/μ1) IOmMdNTP 1F/1R與2FAR擴增出的PCR產(chǎn)物，分別取3μ L混合，2%瓊脂糖凝膠電泳(100V， 電泳20min)，溴化乙錠(EB)染色后，在凝膠成像系統(tǒng)觀察條帶。5、BLAD基因型結(jié)果判定牛白細胞粘附缺陷(BLAD)基因型鑒定結(jié)果如圖2所示，在基因⑶18的AS-PCR產(chǎn) 物電泳圖譜中，若個體擴增出的目的片段為500bp，則為致病純合子；若擴增出的目的片段 為818bp和500bp，則為雜合子，即BLAD疾病攜帶者；若擴增的目的片段為818bp，則為健康 個體。參考文獻1. Hagemoser W A. Roth J A, Lofstedt J, et al. Granulocytopathy in a Holstein heifer. J Am V etM ed A ssoc, 1983，183 1093 10942. Gerardi A S. Bovine leukocyte adhesion deficiency -.a review of a modern disease and its imp licat ions. Res V et Sci, 1996,61 :183 186.3. Springer TA. Adhesion receptors of the immune system. Nature,1990, 346(4) 425 434.4. Nagahata H, Taniyama H, Izum isaw a Y, et al. Radiographic and immunohistochemical anylysis of leukocyte adhesion deficiency in Holsteins heifers. Can J V et Res,1995，59 :316 318.5. Kishimoto, Τ. K. , Hollander, N. , Roberts, Τ. Μ. , Anderson, D. C. &Springer, Τ. Α. Heterogeneous mutations in the beta subunit common to the LFA-I, Mac-I, and pl50,95glycoproteins cause leukocyte adhesion deficiency. Cell, 1987, 50 :193-202.6. Shuster D E, KehriliM E Jr, Ackermann M R, et al. Ident ificat ion and prevalence of a genetic defect that causes leukocyte adhesion deficiency in Hostein cattle. Proc Natl Acad Sci,1992,89 9225 ~ 9229.7. Nagahata H, Saw ada C, H iguch i H, et al. Fcreceptor-mediated phagocytosis, superoxide production and calcium signaling of beta2 integrin-deficient bovine neut rophils. Microbiol Immunol,1997,41 747 ~ 750.8. Van Garderen E,muller K E,ffent ink G H,et al. Post-mortem findings in calves suffering from bovine leukocyte adhesion deficiency (BLAD). V et Q,1994, 16 24 26.9.李艷華，張勝利，劉振君等.中國荷斯坦牛脊椎畸形綜合征的研究現(xiàn)狀與展 望·中國奶牛，2008，(6) =27-29.
權(quán)利要求
應(yīng)用AS PCR在體外檢測牛白細胞粘附缺陷的方法，其步驟如下1)設(shè)計特異性引物對，該引物對的DNA序列如下所示基因CD18的擴增引物突變型擴增產(chǎn)物長度為500bp，引物1，正向引物5′AAGATGACGAGGAGCAGAA 3′，引物2，反向引物5′GTCCATCAGGTAGTACAGGC 3′；野生型擴增產(chǎn)物長度為818bp；引物35′CAAGGGCTACCCCATCGA 3′，引物45′CAGGACTGCGTGGCTAAA 3′；2)PCR過程如下將同一份DNA樣本使用2個20μL體系進行擴增20μL體系包括10×Buffer2.0μL，25mMMg2+1.5μL，10μM用于AS PCR反應(yīng)的引物各0.5μL，10mMdNTP0.4μL，5U/μLTaq酶0.4μL，500ng/μLDNA1.0μLddH2O13.7μL，混勻、瞬時離心；PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)熱10min，94℃變性45s，65℃45s，72℃延伸45s，從第二步94℃變性到第四步72延伸進行35個循環(huán)，72℃延伸10min，15℃10min。然后各取3μLPCR產(chǎn)物混合點樣，1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢，并記錄結(jié)果。
2.權(quán)利要求1所述的引物對在AS-PCR在體外檢測牛白細胞粘附缺陷中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明屬于家畜分子檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及應(yīng)用AS-PCR方法在體外檢測牛白細胞粘附缺陷的方法。制備了一種用于牛粘附缺陷檢測方法的特異性PCR引物，它包括CD18基因擴增引物突變型擴增產(chǎn)物長度為500bp；引物15’AAGATGACGAGGAGCAGAA 3’，引物25’GTCCATCAGGTAGTACAGGC 3’；野生型擴增產(chǎn)物長度為818bp；引物35’CAAGGGCTACCCCATCGA 3’，引物45’CAGGACTGCGTGGCTAAA 3’。本發(fā)明制備的牛白細胞粘附缺陷的方法的特異性引物，可直接應(yīng)用于在體外開展牛粘附缺陷的致病基因的篩選，以利于對牛粘附缺陷個體進行早期淘汰。
文檔編號C12Q1/68GK101899511SQ20101022560
公開日2010年12月1日 申請日期2010年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月9日
發(fā)明者劉耘, 張淑君, 張瀅寅, 李翔, 楊利國, 梁愛心, 江一波, 滑國華, 熊家軍, 王成, 賈啟濤 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)