用于增加植物的碳、氮、生物量和產(chǎn)量的表達(dá)構(gòu)建體和方法
【專利摘要】同化的C和N很大程度地影響植物生長和農(nóng)作物產(chǎn)量。之前的嘗試企圖用一個(gè)或兩個(gè)基因改變植物的碳和氮狀態(tài)。本發(fā)明涉及三個(gè)基因的同時(shí)共同過表達(dá)，其中一個(gè)基因(PECPase)有效地捕獲CO2，而另外兩個(gè)編碼參與氮同化的酶(Asp?AT和GS)。組合的效果為植物的碳和氮狀態(tài)以及生產(chǎn)力的增加。
【專利說明】用于增加植物的碳、氮、生物量和產(chǎn)量的表達(dá)構(gòu)建體和方法
[0001]以下的說明書說具體地描述了本發(fā)明及其實(shí)施方式。
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及用于增強(qiáng)植物的碳(C)、氮(N)、生物量和產(chǎn)量的表達(dá)構(gòu)建體。
[0003]另外，本發(fā)明提供了通過使用前述的表達(dá)構(gòu)建體增強(qiáng)C和N水平并隨之改進(jìn)植物的生物量和產(chǎn)量的方法，所述構(gòu)建體利用源自酶(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(以下稱為“PEPCase”)，谷氨酰胺合成酶(以下稱為“GS”)和天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(以下稱為“AspAT”))之基因的共同過表達(dá)(co-overexpression)。特別地,本發(fā)明涉及編碼所述蛋白的核酸序列在植物細(xì)胞中表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物。
[0004]更特別地，本發(fā)明涉及用實(shí)現(xiàn)在組成型啟動(dòng)子控制下的三個(gè)基因的共同過表達(dá)的遺傳構(gòu)建體轉(zhuǎn)化植物，所述三個(gè)基因中一個(gè)基因PEPCase編碼負(fù)責(zé)捕獲CO2的酶，而另外兩個(gè)編碼參與N同化的酶(AspAT和GS)，其中N同化所需要的C骨架由PEPCase滿足，其包括用AspAT+GS+PEPCase基因轉(zhuǎn)化的植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)和此基因在植物中的表達(dá)，從而提高植物的C和N狀態(tài)以及生物量和產(chǎn)量。
[0005]發(fā)明背景和現(xiàn)有技術(shù)
[0006]本發(fā)明涉及具有三個(gè)基因(即AspAT、GS和PEPCase)的共同過表達(dá)從而導(dǎo)致C、N含量、生物量和產(chǎn)量組分提高的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物。PEPC酶(EC.4.1.1.31)是在植物中普遍存在的酶，在HC03_和Mg2+的存在下催化磷酸烯醇丙酮酸(以下稱為“PEP”)的β-羧化，得到草酰乙酸(oxaloacetate)(以下稱為“0ΑΑ”)和無機(jī)磷酸鹽(inorganic phosphate)(以下稱為“Pi”)，它主要具有為三羧酸循環(huán)補(bǔ)充中間體的回補(bǔ)作用。在高等植物中，有具有不同器官特異性的幾個(gè)PEPC酶同種型，他們參與多種功能，包括氣孔開放、果實(shí)成熟和種子成熟。C4和CAM植物的葉含有高水平的PEPC酶，其催化光合作用的初始CO2固定。在C3植物的葉中觀察到低得多的PEPC酶水平，其有助于回補(bǔ)功能并在細(xì)胞pH調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用。
[0007]GS(EC6.3.1.2)催化氨(以下稱為“NH3”)與谷氨酸(以下成為“Glu”)的ATP依賴性縮合產(chǎn)生谷氨酰胺(以下成為“Gin”)。隨后，谷氨酸合酶(GOGAT)轉(zhuǎn)移Gln的酰胺基到α-酮戊二酸以產(chǎn)生兩個(gè)分子的Glu。Gln和Glu 二者是蛋白質(zhì)、核酸和葉綠素的有機(jī)N的主要來源。
[0008]AspAT (EC2.6.1.1)催化天冬氨酸(以下稱為“Asp”)的氨基到α -酮戊二酸以形成OAA和Glu的可逆轉(zhuǎn)移。在植物中，已提出AspAT發(fā)揮幾種代謝作用，包括:在根部同化NH3+的過程中回收C骨架，提供酰胺前體用于主要的氮轉(zhuǎn)運(yùn)分子(例如天冬酰胺(以下稱為“Asn”)和?；?的生物合成，在種子填充(filling)期間募集Asn氮以及參與C4植物中的細(xì)胞內(nèi)C穿梭，提供用于Asp家族氨基酸的生物合成的前體。
[0009]在生物量產(chǎn)生、產(chǎn)量或收獲指數(shù)方面，植物的表現(xiàn)依賴于多個(gè)內(nèi)部和環(huán)境因素。在這些因素中，植物的C和 N水平是控制植物生產(chǎn)力的重要因子之一。越來越多的C和N同化的細(xì)節(jié)表明，調(diào)控系統(tǒng)響應(yīng)于代謝和環(huán)境這兩種因素來協(xié)調(diào)這些營養(yǎng)物質(zhì)的攝取和分布。植物感受到其C和N狀態(tài)的變化并傳遞該信息給細(xì)胞核，在細(xì)胞核帶來中基因表達(dá)的改變。由于植物生長和農(nóng)作物產(chǎn)量很大程度地受C和N同化的影響，過去已經(jīng)進(jìn)行了很多嘗試來改造有效的C和N同化。然而還沒有報(bào)告顯示出植物中C、N狀態(tài)、生物量及產(chǎn)量的顯著改進(jìn)。
[0010]表1舉例說明對(duì)于在不同植物中提高C和/或N及生物量的多種策略方面可獲得的信息狀態(tài)
[0011]表1
[0012]
【權(quán)利要求】
1.SEQ ID N0.7所示的用于AspAT、GS和PEPCase基因之共表達(dá)的表達(dá)構(gòu)建體，其包含與至少一個(gè)控制序列和轉(zhuǎn)錄終止子序列相連的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示核苷酸序列，其中SEQ ID NO:1示出AspAT基因，SEQ ID NO:2示出GS基因以及SEQID NO:3示出PEPCase基因，所述表達(dá)構(gòu)建體可用于使植物相對(duì)于野生型或未轉(zhuǎn)化植物具有提高的碳、氮、生物量和產(chǎn)量。
2.權(quán)利要求1所述的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述控制序列如SEQID N0.4所示，所述轉(zhuǎn)錄終止子序列如SEQ ID N0.5所示。
3.權(quán)利要求1所述的表達(dá)構(gòu)建體，其中所述控制序列是選自以下的組成型啟動(dòng)子:CaMV35S啟動(dòng)子、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶啟動(dòng)子、泛素啟動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。
4.權(quán)利要求1所述的表達(dá)構(gòu)建體，其中所使用的終止子優(yōu)選選自Nos終止子和CaMV3' UTR。
5.權(quán)利要求1所述的表達(dá)構(gòu)建體，其中具有所述SEQID N0.7的多核苷酸在植物中過表達(dá)。
6.用于制備權(quán)利要求1所述的表達(dá)構(gòu)建體的方法，其中所述方法包括以下步驟: i)使用SEQID NO:10和SEQ ID NO:11所示引物擴(kuò)增編碼SEQ ID NO:1所示基因的cDNA序列，使用SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示引物擴(kuò)增編碼SEQ ID NO:2所示基因的cDNA序列，以及使用SEQ ID N0:12和SEQ ID NO:13所示引物擴(kuò)增編碼SEQ ID N0:3所示基因的cDNA序列； ii)將在步驟Q)中獲得的SEQID NO:1、2和3的擴(kuò)增產(chǎn)物獨(dú)立地克隆入pGEM_T easy載體中；· iii)將來自步驟(ii)中獲得之陽性克隆的質(zhì)粒獨(dú)立地與PCAMBIA1302—起消化，以及進(jìn)一步將消化的基因產(chǎn)物與PCAMBIA1302連接并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌(E.coli)DH5a細(xì)胞中； iv)對(duì)來自步驟(iii)中獲得之陽性菌落的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，確認(rèn)AspAT::pCAMBIA1302 ；GS::pCAMBIA1302 和 PEPCase::pCAMBIA1302 的框內(nèi)克??；
V)使用 SEQ ID NO: 10 和 SEQ ID NO:16 ；SEQ ID NO:14 和 SEQ ID NO: 15 以及 SEQ IDNO:17和SEQ ID NO:18所示引物擴(kuò)增步驟(iv)中獲得的產(chǎn)物； vi)對(duì)擴(kuò)增的GS編碼序列再次獨(dú)立地進(jìn)行克隆、消化、連接和測(cè)序以形成GS+pCAMBIA1302，將其進(jìn)一步被消化并與擴(kuò)增的AspAT編碼序列之陽性克隆的質(zhì)粒連接以形成 AspAT+GS+pCAMBIA1302 表達(dá)盒； vii)將擴(kuò)增的PEPCase編碼序列之陽性克隆的經(jīng)消化質(zhì)粒與目的pCAMBIA1302連接，所述目的PCAMBIA1302預(yù)先克隆有步驟(vi)中獲得的所述AspAT+GS+表達(dá)盒，以使得AspA, GS和PEPCase基因被獨(dú)立的CaMV35S啟動(dòng)子和Nos轉(zhuǎn)錄終止子控制，以形成SEQ IDNO:7所示的單個(gè)植物表達(dá)構(gòu)建體AspAT+GS+PECPase。
7.使用權(quán)利要求1中所述的表達(dá)構(gòu)建體提高植物的碳、氮、生物量和產(chǎn)量的方法，其中所述方法包括以下步驟: a)用權(quán)利要求1所述的表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefacians)菌株; b)用步驟(a)中獲得的重組根瘤農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化外植體；c)選擇步驟(b)的經(jīng)轉(zhuǎn)化外植體以獲得期望的經(jīng)轉(zhuǎn)化植物，其相對(duì)于野生型植物具有提高的植物碳、氮、生物量和產(chǎn)量水平。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述經(jīng)轉(zhuǎn)化植物選自擬南芥、番茄、馬鈴薯、煙草、玉米、小麥、稻、棉花、芥菜、木豆、豇豆、豌豆、甘蔗、大豆和高粱。
9.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述經(jīng)轉(zhuǎn)化植物相對(duì)于野生型表現(xiàn)出約45%至50%的PEPC酶活性增加，至少55%的GS活性增加和55%至60%的AspAT活性增加，從而使得所述植物中碳和氮水平增加。
10.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述經(jīng)轉(zhuǎn)化植物相對(duì)于野生型表現(xiàn)出由種子產(chǎn)量和/或莢果產(chǎn)量增加所表明的產(chǎn)量和/或生物量增加。
11.權(quán)利要求7所述的方法，其中所述經(jīng)轉(zhuǎn)化植物表現(xiàn)出提高的生長特性，所述提高的生長特性的特征在于與野生型或未轉(zhuǎn)化植物相比嫩枝鮮重、嫩枝干重、根鮮重和根干重增加。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK103597081SQ201280027891
【公開日】2014年2月19日 申請(qǐng)日期:2012年4月19日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月19日
【發(fā)明者】阿尼什·卡奇拉, 蘇倫德·庫馬爾·瓦茨, 帕拉姆維爾·辛格·阿胡賈, 桑賈伊·庫馬爾 申請(qǐng)人:科學(xué)與工業(yè)研究會(huì)