用于重組產生藏紅花化合物的方法和物質的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了重組微生物、植物和植物細胞，其被改造成單獨地或與編碼UDP-糖基轉移酶(UGT)的重組基因相組合地表達玉米黃素切割雙加氧酶(zeaxanthin?cleavage?dioxygenase)。這樣的微生物、植物或植物細胞可產生來自藏紅花的化合物，例如藏紅花酸、藏紅花酸二醛、藏紅花苷或藏紅花苦苷。
【專利說明】用于重組產生藏紅花化合物的方法和物質
[0001]本申請要求2011年8月8日提交的美國臨時申請N0.61 / 521171，2011年12月16日提交的美國臨時申請N0.61 / 576460和2012年2月6日提交的美國臨時申請N0.61 /595450的優(yōu)先權。
【技術領域】
[0002]本發(fā)明涉及用于重組產生來自藏紅花(Crocus sativus)這一藏紅花植物的化合物的方法和物質，并且更特別地涉及用于在重組宿主中重組產生來自藏紅花植物的調味劑(fIavorant)、芳香劑(aromatant)和著色劑化合物的方法和物質。
【背景技術】
[0003]藏紅花(saffron)是通過從藏紅花(Crocus sativus L.)花朵的柱頭進行提取而制備的干燥香料，并且認為已被使用了超過3500年。該香料在歷史上用于多種藥用目的，但是在最近主要利用其著色劑特性。藏紅花的主要成分之一藏紅花酸具有與相關類胡蘿卜素型分子相似的抗氧化性質，并且是著色劑。藏紅花的主要色素是藏紅花苷，其是賦予淡黃紅色的糖苷混合物。藏紅花苷的主要成分是a-藏紅花苷，其顏色為黃色。藏紅花醛被認為是干燥過程的產物并且也具有香味劑(odorant)特性，可用于食品制備。藏紅花醛為藏紅花提取物的苦味部分藏紅花苦苷的糖苷配基形式，其是無色的。因此，藏紅花提取物被用于多個目的，被用作著色劑或調味劑，或者利用其香味劑特性。
[0004]許多國家(包括意大利、法國、印度、西班牙、希臘、摩洛哥、土耳其、瑞士、以色列、巴基斯坦、阿塞拜疆、中國、埃及、阿拉伯聯(lián)合酋長國、日本、澳大利亞和伊朗)都商業(yè)種植藏紅花植物。伊朗生產藏紅花世界年總產量的約80% (估計剛超過200噸)。據報道，Ikg產物需要超過150，000朵花 。導致不育植物的植物基因組三倍性使得增加產率的植物培育努力變得復雜。此外，植物開花自十月中期或后期開始僅維持約15天。通常，生產包括從花朵手動移除柱頭，這也是低效的過程。賣價通常超過$1000 / kg藏紅花。一種吸引人的替代方式是藏紅花組分的生物轉化或從頭生物合成。

【發(fā)明內容】

[0005]本公開基于對以下的發(fā)現(xiàn):用于改善重組宿主中來自藏紅花植物之化合物的產生的方法和材料，以及可用于建立產生化合物(例如藏紅花苦苷、藏紅花醛、藏紅花苷、藏紅花酸或藏紅花酸酯)之重組途徑的核苷酸和多肽。本公開內容還涉及包含藏紅花酸和藏紅花酸酯的組合物?？蓡为毜厣a產物并針對在食品體系中的最佳特征或醫(yī)藥用補劑而重新組合。在另一些實施方案中，化合物可作為混合物產生。在一些實施方案中，宿主株是重組酵母。在另一些實施方案中，本文所述的核苷酸可用于植物遺傳學并且作為標志物在植物培育策略中提供幫助。
[0006]在一個方面中，本文件的特征在于重組的類胡蘿卜素產生宿主(例如,微生物)，其包含編碼玉米黃素切割雙加氧酶(zeaxanthin cleavage dioxygenase, ZO))的外源核酸。所述宿主可產生可檢測量的藏紅花酸(crocetin)和/或藏紅花酸二醒(crocetindialdehyde)和 / 或羥基-(6-環(huán)朽1 樣醒(hydroxyl-0-cyclocitral,HBC)。ZCD 可以是藏紅花ZCD。
[0007]所述宿主可包含編碼物牛兒基物牛兒基焦磷酸合酶(geranylgeranyldiphosphate synthase, GGPPS)、八氫番爺紅素(phytoene)合酶、八氫番爺紅素脫氫酶和3 -胡蘿卜素(0-carotene)合酶的內源基因。
[0008]所述宿主還可包含編碼GGPPS、八氫番茄紅素合酶、八氫番茄紅素脫氫酶和P -胡蘿卜素合酶的至少一個外源核酸。
[0009]本文件的特征還在于這樣的重組宿主，其包含編碼GGPPS、八氫番茄紅素合酶、八氫番茄紅素脫氫酶、(6-胡蘿卜素合酶、3 -胡蘿卜素羥化酶和玉米黃素切割雙加氧酶(Z⑶)(例如，藏紅花Z⑶)的至少一個外源核酸。所述至少一個外源核酸的表達可在宿主中產生可檢測量的藏紅花酸和/或藏紅花酸二醛。
[0010]任意本文所述宿主還可包含編碼醛脫氫酶的內源基因或編碼醛脫氫酶(ALD)的外源核酸。醒脫氫酶可以是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)醒脫氫酶(例如ALD2-ALD6 或 HFDI)。
[0011]任意本文所述宿主還可包含編碼(6-胡蘿卜素羥化酶的內源基因或編碼(6-胡蘿卜素羥化酶的外源核酸。(6-胡蘿卜素羥化酶可以是法夫酵母(Xanthophyllomycesdendrorhous) P -胡蘿卜素輕化酶。
[0012]任意本文所述宿主還可包含編碼糖苷配基0-糖基尿苷5’- 二磷酸(UDP)糖基轉移酶(0-糖基UGT)的外源核酸。這樣的宿主可產生可檢測量的藏紅花苦苷(picrocrocin)或藏紅花苷(crocin)。糖苷`配基0-糖基UGT可以是UGT85C2、UGT73-EV12或UGI71雜交酶。糖苷配基0-糖基UGT也可以是來自藏紅花的Cs VrUGT2。
[0013]任意本文所述宿主還可包含編碼0-糖基UGT的外源核酸。這樣的宿主可產生可檢測量的藏紅花酸單葡糖基酯和藏紅花酸二葡糖基酯。糖苷配基0-糖基UGT可以是UGI76G1或 UGT71 雜交酶(hybrid enzyme)(例如，71C125571C2 和 / 或 71C125571E1)。
[0014]任意本文所述宿主還可包含編碼催化兩個葡萄糖部分之間之3 -葡糖基連接(例如，^ -1, 6連接)的UGT的外源核酸。這樣的宿主可產生可檢測量的藏紅花酸龍膽二糖基(gentibiosyl)酯。催化兩個葡萄糖部分之間之P _葡糖基連接的UGT可以是UGT71雜交酶，例如 71C125571C2 或 71C125571E1。
[0015]任意本文所述宿主還可包含編碼尿苷-5，- 二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖)-藏紅花酸8，8’ -葡糖基轉移酶的外源核酸。這樣的宿主可產生可檢測量的藏紅花酸單葡糖苷。UDP-葡萄糖-藏紅花酸_8，8’ -葡糖基轉移酶可以是藏紅花屬(Crocus) UDP-葡萄糖-藏紅花酸8，8’ -葡糖基轉移酶。
[0016]任意本文所述宿主還可包含編碼催化兩個葡萄糖部分之間之3 -葡糖基連接(例如，^ -1, 6連接)的UGT的外源核酸。這樣的宿主可產生可檢測量的藏紅花苷。催化兩個葡萄糖部分之間之0 -葡糖基連接的UGT可以是UGI76G1、UN4522或UN1671。
[0017]任意本文所述宿主可以是微生物、植物或植物細胞。微生物可以是產油酵母、酵母菌(如釀酒酵母)或大腸桿菌。植物或植物細胞可以是藏紅花。
[0018]任意本文所述宿主還可包含編碼以下酶中的一種或更多種的外源核酸:脫氧木酮糖5-磷酸合酶(DXS) ,D-1-脫氧木酮糖5-磷酸還原異構酶(DXR)、4_ 二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇合酶(CMS)、4_ 二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇激酶(CMK)、4_ 二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇2，4-環(huán)二磷酸合酶(MCS)、1-羥基-2-甲基-2 (E) - 丁烯基4- 二磷酸合酶(HDS)和1-羥基-2-甲基-2 (E) - 丁烯基4- 二磷酸還原酶(HDR)。
[0019]任意本文所述宿主還可包含編碼以下酶中的一種或更多種的外源核酸:截短的3-羥基-3-甲基-戊二?；?HMG)-CoA還原酶(tHMG)、甲羥戊酸激酶(MK)、磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)和甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶(MPro)。
[0020]在另一個方面中，本文件的特征在于產生藏紅花苦苷的方法。所述方法包括使HBC與糖苷配基0-糖基UGT和UDP-葡萄糖相接觸以產生藏紅花苦苷，其中糖苷配基0-糖基UGT 選自 UGT85C2、UGI73-EV12 或 UGT71 雜交酶。UGT 也可以是 Cs VrUGT2。
[0021]在又一個方面中，本文件的特征在于編碼UGT73多肽的分離核酸。UGT73多肽可與圖3所示UGT73氨基酸序列有至少80%的序列同一性。本文件的特征還在于包含與這種核酸可操作性連接之調節(jié)區(qū)的核酸構建體，以及包含這種核酸或核酸構建體的重組宿主。
[0022]在另一個方面中，本文件的特征在于與圖3所示UGT73氨基酸序列有至少80%序列同一性的分離多肽。所述多肽可與圖3所示UGT73氨基酸序列有至少90%的序列同一性。所述多肽可與圖3所示UGT73氨基酸序列有至少95%的序列同一性。所述多肽可具有圖3所示UGT73氨基酸序列。
[0023]在另一個方面中，本文件的特征在于具有圖9所示氨基酸序列的分離多肽和編碼這種多肽的核酸。
[0024]本文件的特征 還在于產生藏紅花酸的方法。所述方法包括使藏紅花酸二醛與醛脫氫酶相接觸以產生藏紅花酸。
[0025]本發(fā)明的另一個方面是提供編碼如SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的如SEQ IDNO:58所示的合成DNA序列。
[0026]在又一個方面中，本發(fā)明的特征在于編碼如SEQ ID NO:66所示氨基酸序列的如SEQ ID NO:65所示的合成DNA序列。
[0027]除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本發(fā)明所屬領域普通技術人員通常理解的相同的含義。雖然類似于或等同于本文所述方法和物質的方法和物質可用于實踐本發(fā)明，但是在以下描述了合適的方法和物質。本文提到的所有公開、專利申請、專利和其他參考文獻都通過引用整體并入本文。在抵觸的情況下，以本說明書包括定義為準。此外，物質、方法和實例僅是說明性的并且不旨在限制。通過以下的詳細描述，本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將變得顯而易見。根據專利法的標準實踐， 申請人:保留使用連接詞“包含”、“基本由……組成”或“由……組成”替代地要求保護任何所公開發(fā)明的權利。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1是由IPP至P -胡蘿卜素的生物合成途徑的示意圖。
[0029]圖2是藏紅花中的生物合成途徑的示意圖。
[0030]圖3 包括甜葉菊(Stevia rebaudiana) UGT88B1 (SEQ ID NO:1 和 2)、UGT76G1 (SEQID NO:3 和 4)、UGT74G1 (SEQ ID NO:5 和 6)、UGT91D2e (SEQ ID NO:7 和 8)、UGT85C2 (SEQID NO:9 和 10)和 UGT73 (SEQ ID NO:11 和 12)，長春花(Catharanthus roseus) UGT2 (SEQID NO:13 和 14)，擬南芥(Arabidopsis thaliana) UGT75B1 (SEQ ID NO:15 和 16)以及兩種擬南芥雜交體UGT(UGT71雜交酶1:71C125571C2，SEQ ID NO:17和18及UGT71雜交酶2:71C125571E1, SEQ ID N0:19和20)的核苷酸和氨基酸序列。
[0031]圖4 是描繪與已知 UGT91 序列成簇(cluster)的 UN1671、UN3356、UN4522、UN4666、UN6460和UN2281UGT的氨基酸序列的示意圖。
[0032]圖5 包括實施例 4 中鑒定的 UGT (UN6338，SEQ ID NO:21 ；UN4666, SEQ ID NO:22 (DNA)和 23(氨基酸)；UN3356,SEQ ID NO: 24 (DNA)和 25(氨基酸)；UN6428,SEQ ID NO:
26；UN3131, SEQ ID NO:27 ；UN1671, SEQ ID NO:28 (DNA)和 29 (氨基酸)；UN4522, SEQ IDNO:30 (DNA)和 31(氨基酸)；UN6460,SEQ ID N0.32 (DNA)和 33 (氨基酸);UN2281，SEQ IDN0.34 (DNA)和 35(氨基酸);以及 UN2644, SEQ ID NO:36)的序列。
[0033]圖6包括針對在釀酒酵母中表達EUGT1-EUGT19進行密碼子優(yōu)化的核苷酸序列的序列(來源:DNA2.0?，SEQ ID N0.37 至 55。
[0034]圖7包括藏紅花葡糖基轉移酶2 (UGT2) (GenBank登錄號AY262037.1)的核苷酸序列(SEQ ID NO:56)和氨基酸序列(SEQ ID NO:57)，以及密碼子優(yōu)化的核酸序列(SEQ IDNO:58)。
[0035]圖8包括用于實施例6的密碼子優(yōu)化的基因序列(SEQ ID NO:59至64)。小寫字母序列是編碼區(qū)之外的并且用于克隆目的。
[0036]圖9包括用于實施例8的變體藏紅花屬UGT (Cs VrUGT2)的密碼子優(yōu)化核苷酸序列(來源:GenScript) (SEQ ID NO:65)和氨基酸序列(SEQ ID NO:66)。
[0037]圖10包括來自藏紅花的CsUGT2 (GenBank登錄號:AY262037.1)與變體Cs VrUGT2的比對，以及各多肽的氨基酸序列(SEQ ID N0.57和66)。
[0038]圖11包括編碼醛脫氫酶(ALD) 2、ALD3、ALD4、ALD5、ALD6和HFDl (也預測為醛脫氫酶)的核苷酸序列(SEQ ID N0.67至72)。
[0039]不同附圖中的相同符號指示相同元件。
[0040]發(fā)明詳述
[0041]多種藏紅花酸酯是藏紅花提取物的著色劑特性的原因。藏紅花酸是二萜，其由在兩端有2個羧酸基團C18骨架形成。藏紅花酸來源于包含P -胡蘿卜素和玉米黃素的類胡蘿卜素途徑(參見圖2)。藏紅花的主要色素是藏紅花苷——具有兩個龍膽二糖部分的藏紅花酸二酯(二龍膽二糖苷)。藏紅花苷是藏紅花酸酯的主要形式。藏紅花酸(也稱為a -藏紅花酸或藏紅花酸-1)的另一些糖苷形式包括龍膽二糖苷、葡糖苷、gentioglucoside和二葡糖苷。單甲酯或二甲酯形式的Y-藏紅花酸也與13-順式-藏紅花酸和反式藏紅花酸異構體一起存在于藏紅花中。
[0042]無色的藏紅花苦苷是藏紅花苦味的原因。其是由玉米黃素經HBC產生的單萜醛。藏紅花苦苷的脫葡糖基化產生了藏紅花香料的主要芳香組分藏紅花醛(4-羥基-2，4，4-三甲基1-環(huán)己烯-1-甲醛或脫氫-(6-環(huán)檸檬醛)。
[0043]藏紅花提取物還包含蠟和脂肪、蛋白質、精油、花青素、類黃酮、維生素(核黃素和硫胺素)、氨基酸、淀粉、礦物質、樹膠。單萜醛和異佛爾酮相關化合物與藏紅花醛一起是藏紅花的揮發(fā)性組分。
[0044]本文件基于這樣的發(fā)現(xiàn):可開發(fā)這樣的重組宿主例如植物細胞、植物或微生物,其表達可用于來自藏紅花之化合物(例如藏紅花酸、藏紅花酸二醛、藏紅花苦苷、藏紅花苷或藏紅花醛)的生物合成的多肽。這樣的宿主可表達玉米黃素切割雙加氧酶(Z⑶)(也稱為玉米黃素切割加氧酶(ZCO))(例如，來自藏紅花)，并且在一些實施方案中表達一種或更多種尿苷5’-二磷酸(UDP)糖基轉移酶。在多種微生物底架中表達這些生物合成多肽使得能夠由能量和碳源(例如糖、甘油、C02、H2和陽光)以恒定、可重現(xiàn)方式產生來自藏紅花的化合物，例如藏紅花酸、藏紅花酸二醛、藏紅花苦苷、藏紅花苷或藏紅花醛。由重組宿主產生的每種化合物的比例可通過將預先選定的生物合成酶整合到宿主中并以適當水平表達它們來調整。
[0045]至少一個基因是重組基因，具體的重組基因取決于選擇使用的物種或株。另外的基因或生物合成模塊可被包含在內以增加化合物產率，提高能量和碳源轉化為藏紅花化合物的效率和/或增強從細胞培養(yǎng)物或植物的生產力。這些另外的生物合成模塊包含參與萜類前體、異戊烯基二磷酸和二甲基烯丙基二磷酸合成的基因。另外的生物合成模塊包含萜烯合酶和萜烯環(huán)化酶基因，例如編碼櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸合酶的基因和編碼參與類胡蘿卜素合成的酶的基因；這些基因可以是內源基因或重組基因(例如，外源核酸)。
[0046]葡萄糖至IPP
[0047]在一些實施方案中，本文所述的重組宿主表達參與二萜生物合成或萜類前體產生的重組基因，例如，甲基赤蘚糖醇4-磷酸(MEP)或甲羥戊酸(MEV)途徑中的基因。例如，重組宿主可包含編碼參與MEP途徑用于類異戊二烯生物合成之酶的一種或更多種基因。MEP途徑中的酶包括脫氧木酮糖5-磷酸合酶(DXS)、D-1-脫氧木酮糖5-磷酸還原異構酶(DXR)、4- 二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇合酶(CMS)、4- 二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇激酶(CMK)、4_ 二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤蘚糖醇2，4-環(huán)二磷酸合酶(MCS)、1-羥基-2-甲基-2 (E) - 丁烯基4- 二磷酸合酶(HDS)和1-羥基-2-甲基-2 (E) - 丁烯基4- 二磷酸還原酶(HDR)。DXS基因、DXR基因、CMS基因、CMK基因、MCS基因、HDS基因和/或HDR基因中的一個或更多個可整合到重組微生物中。參見Rodriguez_Concepci6n and Boronat,Plant Phvs.130:1079-1089(2002)。
`[0048]編碼DXS、DXR、CMS、CMK、MCS、HDS和/或HDR多肽的合適基因包括由大腸桿菌、擬南芥和聚球藻(Synechococcus Ieopoliensis)產生的那些基因。編碼DXR多肽的核苷酸序列在例如美國專利N0.7，335，815中描述。
[0049]在一些實施方案中，重組宿主包含編碼參與甲羥戊酸途徑用于類異戊二烯生物合成的酶的一種或更多種基因。適合于轉化到宿主中的基因編碼甲羥戊酸途徑中的酶，例如截短的3-羥基-3-甲基-戊二?；?HMG)-CoA還原酶(tHMG)、和/或編碼甲羥戊酸激酶(MK)的基因和/或編碼磷酸甲羥戊酸激酶(PMK)的基因和/或編碼甲羥戊酸焦磷酸脫羧酶(MPPD)的基因。因此，一種或更多種HMG-CoA還原酶基因、MK基因、PMK基因和/或MPI3D基因可整合到重組宿主例如微生物中。
[0050]編碼甲羥戊酸途徑多肽的合適基因是已知的。例如，合適的多肽包括由大腸桿菌、脫氮副球菌(Paracoccus denitrificans)、釀酒酵母、擬南芥、Kitasatospora griseola、人(Homo sapiens)、黑腹果妮(Drosophila melanogaster)、原雞(Gallus gallus)、鏈霉菌屬(Streptomyces sp.)K0_3988、野生煙草(Nicotiana attenuata) > Kitasatosporagriseola、巴西橡膠樹(Hevea brasiliensis)、屎腸球菌(Enterococcus faecium)和雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)產生的那些多肽。參見例如美國專利N0.7，183，089、5，460，949 和 5，306，862。
[0051]IPP至(6-胡蘿卜素
[0052]在一些實施方案中，本文所述的重組宿主表達參與IPP至(6-胡蘿卜素的生物合成途徑的基因(圖1)。所述基因對于宿主可以是內源性的(即，宿主天然產生類胡蘿
卜素)或者可以是外源性的，例如重組基因(即，宿主不天然產生類胡蘿卜素)。IPP至胡蘿卜素的生物合成途徑中的第一步由歸類為EC2.5.1.29的櫳牛兒基櫳牛兒基二磷酸合酶(GGPPS或也稱為GGDPS、GGDP合酶、櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸合成酶或CrtE)催化。在由EC2.5.1.29催化的反應中，反，反-法尼基二磷酸和異戊烯基二磷酸被轉化為二磷酸和櫳牛兒基櫳牛兒基二磷酸。因此，在一些實施方案中，重組宿主包含編碼GGPPS的核酸。合適的GGPPS多肽是已知的。例如，非限制性的合適GGPPS酶包括由甜葉菊、藤倉赤霉(Gibberella fujikuroi)、小家鼠(Mus musculus)、假微型海鏈藻(Thalassiosirapseudonana)、法夫酵母、棒狀鏈霉菌(Streptomyces clavuligerus)、Sulfulobusacidicaldarius、聚球藻屬(Synechococcus sp.)和擬南芥產生的那些。參見GenBank登錄號 ABD92926、CAA75568、AAH69913、XP_002288339、ZP_05004570、BAA43200、ABC98596 和NP_195399。
[0053]圖1途徑中的下一步由歸類為EC2.5.1.32的八氫番茄紅素合酶或CrtB催化。在由EC2.5.1.32催化的反應中，兩個櫳牛兒基櫳牛兒基二磷酸分子反應形成兩個焦磷酸分子和八氫番茄紅素。該步驟也可由稱為八氫番茄紅素-P -胡蘿卜素合酶或CrtYB的酶催化。因此，在一些實施方案中，重組宿主包含編碼八氫番茄紅素合酶的核酸。合適的八氫番茄紅素合酶的非限制性實例包括法夫酵母八氫番茄紅素-胡蘿卜素合酶。
[0054](6-胡蘿卜素生物`合成中的下一步由八氫番茄紅素脫氫酶(也稱為八氫番茄紅素去飽和酶或CrtI)催化。該酶將八氫番茄紅素轉化為番茄紅素。因此，在一些實施方案中，重組宿主包含編碼八氫番茄紅素脫氫酶的核酸。合適的八氫番茄紅素脫氫酶的非限制性實例包括粗糙脈孢霉(Neurospora crassa)八氫番爺紅素去飽和酶(GenBank登錄號XP_964713)。這些酶在植物和藍細菌中也豐富地存在。
[0055](6-胡蘿卜素由番茄紅素通過(6-胡蘿卜素合酶這種酶(也稱為CrtY或CrtL-b)形成。該步驟也可由多功能CrtYB催化。因此，在一些實施方案中，重組宿主包含編碼P -胡蘿卜素合酶的核酸。
[0056]P -胡蘿卜素至玉米黃素和藏紅花化合物
[0057]圖2闡明了 0 -胡蘿卜素至多種藏紅花化合物的途徑。
[0058]在最初的步驟中，0 -胡蘿卜素被轉化為玉米黃素。該轉化由P -胡蘿卜素羥化酶(BCH)催化，其將(6-胡蘿卜素轉化為(6-隱黃素，然后進一步反應形成玉米黃素。該酶也稱為CrtZ。合適的(6-胡蘿卜素輕化酶可得自于法夫酵母、擬南芥、夏側金蓋花(Adonisaestivalis)，以及多種其他產生類胡蘿卜素的微生物。
[0059]玉米黃素通過玉米黃素切割雙加氧酶這種酶(Z⑶)(也稱為玉米黃素切割加氧酶(ZCO))轉化為羥基-P -環(huán)檸檬醛(HBC)和藏紅花酸二醛。合適的Z⑶可得自于藏紅花植物。參見實施例6。圖8包括編碼合適ZCD的密碼子優(yōu)化基因序列。
[0060]HBC通過利用UDP-葡萄糖作為葡萄糖供體的糖苷配基0-糖基UGT酶轉化為藏紅花苦苷。合適的UGT包括來自甜葉菊的UGT85C2 (甜葉菊73-同源物)和兩種UGT家族71雜交體UGT。這些UGT的核苷酸和氨基酸序列(SEQ ID N0.1至20)參見圖3。也可使用變體Cs UGT2(參見圖9和10)。這些酶在圖2中被稱為UGTb。逆反應由未知的葡糖苷酶催化。為了提高藏紅花苦苷生產的產率和效價，可期望的是敲除所選宿主生物體內的葡糖苷酶功能性。
[0061]藏紅花醛在藏紅花加工期間自發(fā)地形成，并不知道其是由于物理轉化還是需要通過一種酶或多種酶催化。不知道HBC是否可通過脫水直接轉化為藏紅花醛或者藏紅花苦苷是否是中間體。
[0062]藏紅花酸二醛可通過醛脫氫酶(ADH)(也稱為醛氧化還原酶)轉化為藏紅花植物中的藏紅花酸。如實施例9所述，釀酒酵母具有可用于將二醛轉化為羧酸形式的多種內源性醛脫氫酶基因而不需引入異源基因。參見實施例9。
[0063]藏紅花苷形成的第二步是向藏紅花酸分子的羧酸末端添加葡萄糖部分。已表明藏紅花UGT2 (CsUGT2)將藏紅花酸轉化為藏紅花酸的單葡糖苷(藏紅花酸單葡糖基酯或藏紅花酸二糖基酯)。該酶歸類為EC2.4.1——尿苷-5’ - 二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖)-藏紅花酸8，8’-葡糖基轉移酶。因此，重組宿主可包含編碼UGT2的核酸。藏紅花UGT2的核酸和氨基酸序列以及密碼子優(yōu)化核酸序列參見圖7。CsUGT2的GenBank登錄號為AY262037.1。
[0064]重組宿主還可包含催化由藏紅花酸形成葡萄糖酯(藏紅花酸單葡糖基酯或藏紅花酸二糖基酯)的藏紅花UGT (Cs VrUGT2)。參見實施例8。圖9中提供了 Cs VrUGT2的氨基酸序列。Cs VrUGT2與Cs UGT2的比對還參見圖10。
[0065]重組宿主還可包含催化兩個葡萄糖部分之間的P葡糖基連接(例如，P -1，6葡糖基連接)的UGT，使得 可由藏紅花酸二醛形成藏紅花苷。該UGT在圖2中稱為UGTa。因此，重組宿主可包含編碼UGT2的核酸。已表明甜葉菊UGT(UGI76G1)能夠與四個葡萄糖部分形成藏紅花酸酯。參見實施例4。異構體表征將確定產物是藏紅花苷還是藏紅花苷類似物。
[0066]已表明三種UGT(來自甜葉菊的UGI76G1以及來自藏紅花屬的兩種UN1761和UN4522)能夠與四個葡萄糖部分形成藏紅花酸酯。參見實施例4。對于甜葉菊UGI76G1，異構體表征將確定產物是藏紅花苷還是藏紅花苷類似物。圖5列出了 UN1761和UN4522各自的氨基酸序列。
[0067]重組宿主還可包含在任一端或在兩個羧基末端催化糖苷配基藏紅花酸的UGT。三種UGT(UGI76G1或UGT71雜交酶(71C125571C2和71C125571E1))顯示出形成單葡糖基酯和二葡糖基酯形式藏紅花酸。參見實施例7。
[0068]重組宿主還可包含催化由藏紅花酸直接形成龍膽二糖基酯的UGT。兩種UGT(UGT71雜交酶(71C125571C2和71C125571E1))顯示出由藏紅花酸形成龍膽二糖基酯。參見實施例7。
[0069]功能同源物
[0070]上述多肽的功能同源物也適合用于在重組宿主中產生藏紅花化合物。功能同源物是與參照多肽具有序列相似性并且攜帶參照多肽的一種或更多種生物化學或生理學功能的多肽。功能同源物和參照多肽可以是天然多肽，并且序列相似性的原因可以是趨同或趨異進化事件。因此，功能同源物有時在文獻中命名為同源物或直系同源物或旁系同源物。天然功能同源物的變體(例如由野生型編碼序列突變體編碼的多肽)自身可以是功能同源物。功能同源物也可通過多肽編碼序列的定點誘變或者通過將來自不同天然多肽編碼序列的結構域組合(“結構域交換(domain swapping)”)來產生。用于修飾編碼本文所述功能性UGT多肽的基因的技術是已知的，并且尤其包括定向進化技術、定點誘變技術和隨機誘變技術，并且可用于以期望方式增加多肽的比活性、改變底物特異性、改變表達水平、改變亞細胞定位或者修飾多肽:多肽相互作用。如此修飾的多肽被認為是功能同源物。術語“功能同源物”有時適用于編碼功能性同源多肽的核酸。
[0071]可通過分析核苷酸和多肽序列比對來鑒定功能同源物。例如，對核苷酸或多肽序列的數(shù)據庫進行查詢可鑒定本文所述多肽的同源物。序列分析可包括非冗余數(shù)據庫的BLAST、交互(Reciprocal) BLAST或PS1-BLAST分析，其使用目的氨基酸序列作為參照序列。在一些情況下，由核苷酸序列推出氨基酸序列。數(shù)據庫中具有大于40%序列同一性的那些多肽是用于進一步評價作為用于合成來自藏紅花之化合物的多肽之適合性的候選物。氨基酸序列相似性允許保守氨基酸替換，例如一個疏水殘基替換為另一個疏水殘基或者一個極性殘基替換為另一個極性殘基。如果期望，則可對這些候選物進行人工檢查以縮小待進行進一步評價的候選物的數(shù)目。人工檢查可通過選擇表現(xiàn)為具有保守功能結構域的那些候選物來進行。
[0072]可通過在本文所述多肽的一級氨基酸序列內定位為重復序列，形成一些二級結構(例如，螺旋和P片層)，建立帶正電或帶負電的結構域，或者代表蛋白質基序或結構域的區(qū)域來鑒定保守區(qū)。參見，例如萬維網sanger.ac.uk / Software / Pfam / and pfam.janelia.0rg /中描述多種蛋白質基序和結構域的共有序列的Pfam網址。Sonnhammer等，Nucl.AcidsRes.,26:320-322(1998) ;Sonnhammer 等，Proteins, 28:405-420(1997)和Bateman 等，Nucl.AcidsRes.,27:260-262(1999)中描述了包括在 Pfam 數(shù)據庫中的信息。保守區(qū)也可通過對來自緊密相關物種的相同或相關多肽的序列進行比對來確定。緊密相關物種優(yōu)選地來自于相同科。在一些實施方案中，來自兩種不同物種的序列的比對是足夠的。
[0073]通常，表現(xiàn)出至少約40%氨基酸序列同一性的多肽可用于鑒定保守區(qū)。相關多肽的保守區(qū)表現(xiàn)出至少45 %的氨基酸序列同一性(例如，至少50 %、至少60 %、至少70 %、至少80%或至少90%的氨基酸序列同一性)。在一些實施方案中，保守區(qū)表現(xiàn)出至少92%、94 %、96 %、98 %或99 %的氨基`酸序列同一性。
[0074]可如下確定任意候選核酸或多肽相對于參照核酸或多肽的百分比同一性。使用計算機程序ClustalWa.83版，默認參數(shù))將參照序列(例如，核酸序列或氨基酸序列)與一種或更多種候選序列進行比對，ClustalW允許在核酸或多肽序列的整個長度上對其進行比對(全局比對)。Chenna 等，NucleicAcids Res.,31(13):3497-500 (2003)。
[0075]Clustalff計算參照序列與一種或更多種候選序列之間的最佳匹配，并且對其進行比對使得可確定同一性、相似性和差異。可將一個或更多個殘基的空位插入到參照序列、候選序列或二者中以使序列比對最大化。對于核酸序列的快速成對比對，使用以下默認參數(shù):字長:2 ;窗口大小:4 ;計分方法:百分比；上對角線(top diagonal)數(shù)目:4 ;和空位罰分:5。對于核酸序列的多重比對,使用以下參數(shù):空位開放罰分:10.0 ;空位延伸罰分:5.0 ；和權重轉換:是。對于蛋白質序列的快速成對比對，使用以下參數(shù):字長:1 ;窗口大小:5 ；計分方法:百分比；上對角線數(shù)目:5 ;空位罰分:3。對于蛋白質序列的多重比對，使用以下參數(shù):權重矩陣:blosum ;空位開放罰分:10.0 ;空位延伸罰分:0.05 ;親水空位:開；親水殘基:Gly、Pro、Ser、Asn、Asp、Gln、Glu、Arg 和 Lys ;殘基特異性空位罰分:開。Clustalff 輸出是反映序列之間關系的序列比對?？衫缭谌f維網的Baylor College of Medicine SearchLauncher 網址(searchlauncher.bcm.tmc.edu / mult1-align / multi_align.html)和萬維網的歐洲生物信息研究所網址(eb1.ac.uk / clustalw)中運行ClustalW。
[0076]為了確定候選核酸或氨基酸序列與參照序列的百分比同一性，使用ClustalW對序列進行比對，用比對中的相同匹配數(shù)目除以參照序列的長度，結果乘以100。應注意，百分比同一性值可四舍五入到最接近的十分位。例如，78.11,78.12,78.13和78.14向下舍為78.1，而 78.15,78.16,78.17,78.18 和 78.19 向上入為 78.2。
[0077]應理解，本文所述的多肽可包含不參與葡糖基化或通過酶進行的其他酶促活性的另外的氨基酸，并因此這樣的多肽可長于其他情況的長度。例如，多肽可包含添加至氨基端或羧基端的純化標簽(例如，HIS標簽或GST標簽)、葉綠體轉運肽、線粒體轉運肽、淀粉體肽、信號肽或分泌標簽。在一些實施方案中，多肽包含起報告子作用的氨基酸序列，例如綠色熒光蛋白或黃色熒光蛋白。
[0078]核酸
[0079]編碼本文所述多肽的重組基因包含所述多肽的編碼序列，所述編碼序列以正義方向與適合于表達多肽的一個或更多個調節(jié)區(qū)可操作性連接。因為許多微生物能夠由多順反子mRNA表達多個基因產物，所以如果期望，可在對于那些微生物的單一調節(jié)區(qū)控制下表達多個多肽。當調節(jié)區(qū)與 編碼序列被定位成使得調節(jié)區(qū)有效地調節(jié)序列的轉錄或翻譯時，則認為編碼序列與調節(jié)區(qū)是可操作性連接的。通常，編碼序列翻譯閱讀框的翻譯起始位點定位在單順反子基因調節(jié)區(qū)下游的一至約五十個核苷酸之間。
[0080]在許多情況下，在除重組宿主外的物種中鑒定到本文所述多肽的編碼序列，即，其是異源核酸。因此，如果重組宿主是微生物，則編碼序列可來自于其他原核或真核微生物、來自于植物或者來自于動物。但是，在一些情況下，編碼序列是對于宿主為本源的并且被再引入該生物體中的序列。通?？赏ㄟ^與外源核酸連接的非天然序列(例如重組核酸構建體中本源序列兩側的非本源調節(jié)序列)的存在來區(qū)分本源(native)序列與天然(naturallyoccurring)序列。此外，穩(wěn)定轉化的外源核酸通常整合在除發(fā)現(xiàn)本源序列的位置之外的位置處。
[0081]“調節(jié)區(qū)”是指具有影響轉錄或翻譯起始和速度以及轉錄或翻譯產物的穩(wěn)定性和/或移動性的核苷酸序列的核酸。調節(jié)區(qū)包括但不限于啟動子序列、增強子序列、應答元件、蛋白質識別位點、可誘導元件、蛋白質結合序列、5’和3’非翻譯區(qū)(UTR)、轉錄起始位點、終止序列、聚腺苷酸化序列、內含子及其組合。調節(jié)區(qū)通常至少包含核心(基礎)啟動子。調節(jié)區(qū)還可包含至少一個控制元件，例如增強子序列、上游元件或上游激活區(qū)(UAR)。通過定位調節(jié)區(qū)和編碼序列從而使調節(jié)區(qū)有效地調節(jié)序列的轉錄或翻譯來將調節(jié)區(qū)與編碼序列可操作性連接。例如，為了使編碼序列與啟動子序列可操作性連接，編碼序列翻譯閱讀框的翻譯起始位點通常定位在啟動子下游的一至約五十個核苷酸之間。但是，調節(jié)區(qū)可定位在翻譯起始位點上游多達約5，000個核苷酸處或轉錄起始位點上游約2，000個核苷酸處。
[0082]待包含在內的調節(jié)區(qū)的選擇取決于幾個因素，包括但不限于效率、選擇能力、可誘導性、期望表達水平和某些培養(yǎng)階段期間的優(yōu)先表達。對于本領域技術人員而言，通過適當選擇并相對于編碼序列定位調節(jié)區(qū)來調控編碼序列的表達的常規(guī)手段。應理解，可存在多于一個的調節(jié)區(qū)，例如內含子、增強子、上游激活區(qū)、轉錄終止子和可誘導元件。
[0083]一個或更多個基因可以以“模塊”組合在重組核酸構建體中用于來自藏紅花之化合物的產生的獨立方面。將多個基因組合在模塊特別是多順反子模塊中有助于將模塊用于多種物種中。例如，玉米黃素切割雙加氧酶或UGT基因簇可組合在多順反子模塊中，使得在插入合適的調節(jié)區(qū)之后模塊可被引入多種物種中。作為另一個實例，可組合UGT基因簇使得每個UGT編碼序列與單獨的調節(jié)區(qū)可操作性連接，以形成UGT模塊。這樣的模塊可用于其中單順反子表達是必需或期望的那些物種。除了可用于產生來自藏紅花的化合物的基因之外，重組構建體通常還包含復制起點，以及用于在適當物種中維持構建體的一種或更多種可選擇標志物。
[0084]本發(fā)明的一個實施方案提供了編碼如SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的如SEQ IDNO:58所示的合成DNA序列。
[0085]本發(fā)明的另一個實施方案提供了編碼如SEQ ID NO:66所示氨基酸序列的如SEQID NO:65所示的合成DNA序列。
[0086]本發(fā)明的另一個實施方案提供了這樣的DNA表達盒，其包含編碼與圖3所示UGI73氨基酸序列有至少80%序列同一性的UGI73多肽的分離核酸或者含有與所述核酸可操作性連接之調節(jié)區(qū)的核酸構建體。
[0087]本發(fā)明的另一個實施方案提供了這樣的DNA表達盒，其包含編碼如SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的如SEQ ID NO:58所示的合成DNA序列，其中分離的核酸或合成的DNA序列與啟動子可操作性連接。
[0088]本發(fā)明的另一個實施方案提供了這樣的DNA表達盒，其包含編碼如SEQ ID NO:66所示氨基酸序列的如SEQ I`D NO:65所示的合成DNA序列，其中分離的核酸或合成的DNA序列與啟動子可操作性連接。
[0089]本發(fā)明的另一個實施方案提供了包含以下DNA表達盒的重組載體，所述DNA表達盒包含編碼與圖3所示UGT73氨基酸序列有至少80%序列同一性的UGT73多肽的分離核酸或者含有與所述核酸可操作性連接之調節(jié)區(qū)的核酸構建體。
[0090]本發(fā)明的另一個實施方案提供了包含以下DNA表達盒的重組載體，所述DNA表達盒包含編碼如SEQ ID NO:57所示氨基酸序列的如SEQ ID NO:58所示的合成DNA序列，其中分離的核酸或合成的DNA序列與啟動子可操作性連接。
[0091]本發(fā)明的另一個實施方案提供了包含以下DNA表達盒的重組載體，所述DNA表達盒包含編碼如SEQ ID NO:66所示氨基酸序列的如SEQ ID NO:65所示的合成DNA序列，其中分離的核酸或合成的DNA序列與啟動子可操作連接。
[0092]本發(fā)明的又一個實施方案提供了包含如本文所公開的DNA表達盒或重組載體的重組細胞。
[0093]本發(fā)明的又一個實施方案涉及選自酵母、大腸桿菌、植物細胞、哺乳動物細胞和昆蟲細胞的重組細胞。
[0094]本發(fā)明的又一個實施方案涉及其中重組細胞為釀酒酵母的重組細胞。
[0095]應理解，由于遺傳密碼子的簡并性，多種核酸可編碼一種特定多肽，即，對于許多氨基酸，有多于一種的核苷酸三聯(lián)體充當所述氨基酸的密碼子。因此，使用對于宿主(例如，微生物)適當?shù)拿艽a子偏好性表格，可對給定多肽的編碼序列中的密碼子進行修飾以使得得到特定宿主中的最佳表達。對于分離的核酸，這些修飾的序列可作為純化的分子存在并且可整合到載體或病毒中用于構建用于重組核酸構建體的模塊。
[0096]重組宿主
[0097]多種原核生物和真核生物適合用于構建本文所述的重組微生物，例如革蘭氏陰性菌、酵母和真菌。首先分析所選的用作產生藏紅花化合物之株系的物種和菌株，以確定哪些生產基因對于該株系是內源性的以及哪些基因是不存在的(例如，類胡蘿卜素基因)。將內源性對應物在株系中不存在的基因裝配在一個或更多個重組構建體中，然后將所述構建體轉化到株系中以提供缺失的功能。
[0098]以下更詳細地描述了示例性的原核生物和真核生物物種。但是，應理解其他些物種可以是合適的。例如，合適的物種可以屬于選自以下的屬:傘菌屬(Agaricus)、曲霉屬(Aspergillus)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、假絲酵母屬(Candida)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)、埃希氏桿菌屬(Escherichia)、鍵刀菌屬 / 赤霉菌屬(Fusarium /Gibberella)、克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)、硫磺菌屬(Laetiporus)、香燕屬(Lentinus)、發(fā)夫酵母屬(Phaffia)、平革菌屬(Phanerochaete)、畢赤酵母屬(Pichia)、小立碗蘇屬(Physcomitrella)、紅酵母屬(Rhodoturula)、酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、癡圓抱屬(Sphaceloma)、法夫酵母屬(Xanthophyllomyces)和耶氏酵母屬(Yarrowia)。來自這些屬的示例性種包括虎皮香燕(Lentinus tigrinus)、硫石黃孔菌(Laetiporus sulphureus)、黃抱原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)、小立碗蘚(Physcomitrella patens)、粘紅酵母32 (Rhodoturula glutinis32)、膠紅酵母(Rhodoturula mucilaginosa)、紅發(fā)夫酵母UBV-AX(Phaffia rhodozyma UBV-AX)、法夫酵母、水稻惡苗病菌/藤倉赤霉(Fusariumfujikuroi / Gibberella fujikuroi)、產I元假絲酵母(Candida utilis)和解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica)。在一些實施方案中，微生物可以是子囊菌(Ascomycete)例如藤倉赤霉、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces Iactis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、黑曲霉(Aspergillus `niger)或釀酒酵母。在一些實施方案中，微生物可以是原核生物，例如大腸桿菌、類球紅細菌(Rhodobacter sphaeroides)或莢膜紅細菌(Rhodobactercapsulatus)。應理解，某些微生物可用于以高通量方式篩選并測試目的基因，并且具有期望生產力或生長特性的另一些微生物可用于大規(guī)模生產來自藏紅花的化合物。
[0099]釀酒酵母
[0100]釀酒酵母是合成生物學中廣泛使用的底架生物體，并且可用作重組微生物平臺。對于釀酒酵母存在可獲得的突變體文庫、質粒、代謝的詳細計算機模型和其他信息，從而允許合理設計多種模塊以增加產物產率。制備重組微生物的方法是已知的。
[0101]本文所述基因可使用多種已知啟動子的任意種在酵母中表達。過度產生萜烯的菌株是已知的并且可用于增加藏紅花化合物生產可獲得的櫳牛兒基櫳牛兒基二磷酸的量。
[0102]也可對釀酒酵母的合適菌株進行修飾以允許增加貯存脂質的積累和/或增加可用前體分子例如乙酰-CoA的量。例如，Kamisaka等(Biochem.J.(2007)408,61-68)證實通過破壞轉錄因子SNF2，過表達植物來源的二?；视王；D移酶I(DGAl)和過表達酵母LEU2使得釀酒酵母中三酰基甘油(TAG)積累多至30%。此外，F(xiàn)roissard等(FEMS YeastRes9 (2009) 428-438)表明酵母中AtClol (植物油體形成蛋白)的表達將促進油體形成并導致貯存脂質的過度積累。這種積累的TAG或脂肪酸可通過例如進一步表達已知能夠由TAG形成乙酰-CoA的酶(POX基因)(例如，解脂耶氏酵母POX基因)來向乙酰-CoA生物合成轉移。
[0103]曲霍菌屬
[0104]曲霉菌屬物種例如米曲霉(A.0ryzae)、黑曲霉(A.niger)和醬油曲霉(A.sojae)是食品生產中廣泛使用的微生物，并且也可用作重組微生物平臺?？色@得構巢曲霉(A.nidulans)、煙曲霉(A.fumigatus)、米曲霉、棒曲霉(A.clavatus)、黃曲霉(A.f Iavus)、黑曲霉和土曲霉(A.terreus)基因組的核苷酸序列，允許合理設計并修飾內源性途徑，從而增強通量和增加產物產率。已為曲霉開發(fā)了代謝模型，并且進行了轉錄組學研究和蛋白質組學研究。培養(yǎng)黑曲霉用于工業(yè)生產多種食品成分例如檸檬酸和葡萄糖酸，因此物種例如黑曲霉一般適合于生產來自藏紅花的化合物。
[0105]大腸桿菌
[0106]大腸桿菌(在合成生物學中廣泛使用的另一種平臺生物體)也可用作重組微生物平臺。與酵母屬類似，對于大腸桿菌存在可獲得的突變體文庫、質粒、代謝的詳細計算機模型和其他信息，從而允許合理設計多種模塊以增加產物產率?？墒褂门c以上對酵母屬描述的那些方法類似的方法制備重組大腸桿菌微生物。
[0107]傘菌屬、赤霉菌屬和平革菌屬
[0108]因為已知傘菌屬、赤霉菌屬和平革菌屬在培養(yǎng)中產生大量的赤霉素，所以它們是可用的。因此，已由內源 基因產生了用于產生大量來自藏紅花之化合物的萜烯前體。因此，可將包含用于生物合成來自藏紅花之化合物的重組基因的模塊引入來自這些屬的物種中，而不需要引入甲羥戊酸或MEP途徑基因。
[0109]紅細菌屬
[0110]紅細菌可用作重組微生物平臺。與大腸桿菌類似，存在可獲得的突變體文庫以及合適質粒載體，允許合理設計多種模塊以增加產物產率。在紅細菌的膜細菌種中已對類異戊二烯途徑進行了改造以增加類胡蘿卜素和CoQlO的產生。參見，美國專利公開N0.20050003474和20040078846?？墒褂门c以上對大腸桿菌描述的那些方法類似的方法可用于制備重組紅細菌微生物。
[0111]小立碗蘚屬
[0112]小立碗蘚屬苔蘚在懸浮培養(yǎng)中生長時具有與酵母或其他真菌培養(yǎng)物類似的性質。該屬正成為用于產生可難以在其他類型細胞中產生的植物次生代謝物的重要細胞類型。
[0113]棺物和棺物細朐
[0114]在一些實施方案中，將本文所述的核酸和多肽引入植物或植物細胞中以產生來自藏紅花的化合物。因此，宿主可以是包含至少一種本文所述重組基因的植物或植物細胞。植物或植物細胞可通過使重組基因整合到其基因組中進行轉化，即可穩(wěn)定轉化。穩(wěn)定轉化的細胞通常隨各細胞分裂保留所引入的核酸。也可對植物或植物細胞進行瞬時轉化使得重組基因不整合到其基因組中。瞬時轉化的細胞通常隨各細胞分裂丟失所有所引入核酸或所引入核酸的一些部分，使得在進行足夠次數(shù)細胞分裂之后在子代細胞中檢測不到所引入核酸。瞬時轉化和穩(wěn)定轉化的轉基因植物和植物細胞均可用于本文所述方法。
[0115]用于本文所述方法的轉基因植物細胞可構成整個植物的一部分或全部。這樣的植物可以以適合于所考慮物種的方式，在生長室、溫室中或在田野中生長。為了特殊目的，例如為了將重組核酸引入其他品系中，將重組核酸轉移至其他物種，或者用于進一步選擇其他的期望性狀，可根據期望對轉基因植物進行育種?；蛘撸瑢τ谀切┛蛇M行無性繁殖技術的物種，可無性繁殖轉基因植物。本文使用的轉基因植物還指原初轉基因植物的后代，前提是后代繼承了轉基因。可培育由轉基因植物產生的種子，然后進行自交(或者雜交和自交)以得到核酸構建體的純合體種子。
[0116]可使轉基因植物在懸浮培養(yǎng)、或者組織或器官培養(yǎng)中生長。為了本發(fā)明的目的，可使用固體和/或液體組織培養(yǎng)技術。當使用固體培養(yǎng)基時，可將轉基因植物細胞直接放置到培養(yǎng)基上，或者可將其放置在濾器上然后使濾器與培養(yǎng)基相接觸。當使用液體培養(yǎng)基時，可將轉基因植物細胞放置到漂浮設備(例如，接觸液體培養(yǎng)基的多孔膜)上。 [0117]當使用經瞬時轉化的植物細胞時，編碼具有報道子活性的報道多肽的報道子序列可被包括在轉化程序中，并且可在轉化之后的合適時間進行報道子活性或表達的測定。進行測定的合適時間通常在轉化后約I至21天，例如，約I至14天、約I至7天或約I至3天。使用瞬時測定對于在不同物種中進行快速分析，或者確定其表達之前在特定受體細胞中沒有被確定的異源性多肽表達尤其方便。
[0118]用于將核酸引入單子葉植物和雙子葉植物的技術在本領域是已知的，并且包括但不限于農桿菌(Agrobacterium)介導的轉化、病毒載體介導的轉化、電穿孔和粒子槍轉化，美國專利N05, 538，880、5，204，253、6，329，571和6,013, 863。如果將細胞或培養(yǎng)的組織用作轉化的受體組織，則如期望可通過本領域技術人員已知的技術由經轉化培養(yǎng)物再生植物。
[0119]可從轉基因植物群體中篩選和/或選擇具有通過表達轉基因所賦予的性狀或表型的那些群體成員。例如，可從單一轉化事件的后代群體中篩選具有期望ZCD或UGT多肽或核酸表達水平的那些植物。物理和生物化學方法可用于鑒定表達水平。這些包括用于檢測多核苷酸的Southern分析或PCR擴增；用于檢測RNA轉錄物的Northern印跡、SlRNA酶保護、引物延伸或RT-PCR擴增；用于檢測多肽和多核苷酸的酶或核酶活性的酶測定；以及檢測多肽的蛋白質凝膠電泳、Western印跡、免疫沉淀和酶聯(lián)免疫測定。另一些技術例如原位雜交、酶染色和免疫染色也可用于檢測多肽和/或核酸的存在或表達。用于進行所有所提及技術的方法是已知的。作為一種替代，可從包含獨立轉化事件的植物群體中篩選具有期望性狀(例如，產生來自藏紅花的化合物)的那些植物。可對一代或更多代和/或在多于一個的地理位置進行選擇和/或篩選。在一些情況下，可在誘導期望表型的條件下或對在轉基因植物中產生期望表型所必需的另外條件下使轉基因植物生長并對其進行選擇。此外，可在預計植物表現(xiàn)出表型的特定發(fā)育階段期間進行選擇和/或篩選?？蛇M行選擇和/或篩選以選擇相對于缺少轉基因的對照植物藏紅花化合物水平具有統(tǒng)計學顯著差異的那些轉基因植物。
[0120]本文所述的核酸、重組基因和構建體可用于轉化多種單子葉和雙子葉植物和植物細胞系統(tǒng)。合適的單子葉植物的非限制性實例包括例如谷物作物，如稻、黑麥、高粱、小米、小麥、玉米和大麥。植物也可以是雙子葉植物，例如大豆、棉花、向日葵、豌豆、天竺葵、菠菜或煙草。在一些情況下，植物可包含用于磷酸苯酯產生的前體途徑例如甲羥戊酸途徑(通常在細胞質和線粒體中存在)。植物質體中更常存在非甲羥戊酸途徑[Dubey等，2003J.Biosc1.28637-646]。本領域技術人員可通過使用前導序列使生物合成多肽的表達祀向適當?shù)募毎鳎沟蒙锖铣砂l(fā)生在植物細胞的期望位置中。本領域技術人員將使用適當?shù)膯幼觼矶ㄏ蚝铣?，例如如果期望的話定向至植物葉片。如果期望的話表達也可發(fā)生在組織培養(yǎng)例如愈傷組織培養(yǎng)或毛狀根培養(yǎng)中。
[0121]以下實施例將對本發(fā)明進行進一步描述本發(fā)明，所述實施例不限制權利要求所述的本發(fā)明范圍。
實施例
[0122]實施例1:在酵母中產生P -胡蘿卜素
[0123]構建產生P -胡蘿卜素的酵母報告菌株，用于設計成發(fā)現(xiàn)藏紅花生物合成基因的最佳組合的eYAC實驗。將粗糙脈孢霉八氫番茄紅素去飽和酶(也稱為八氫番茄紅素脫氫酶)(登錄號XP_964713)和法夫酵母GGDP合酶(也稱為櫳牛兒基櫳牛兒基焦磷酸合成酶或CrtE)(登錄號DQ012943)以及法夫酵母八氫番茄紅素-P -胡蘿卜素合酶CrtYB (登錄號AY177204)基因都插入到表達盒中，并且將這些表達盒整合到實驗室酵母菌株釀酒酵母CEN.PKl 13-11的基因組中。在強組成型GPDl啟動子的控制下過表達八氫番茄紅素去飽和酶和CrtYB，并且使用強組成型TPIl啟動子過表達CrtE。在釀酒酵母ECM3-Y0R093C基因間區(qū)中進行法夫酵母CrtE和粗糙脈孢霉八氫番茄紅素去飽和酶表達盒的染色體整合，并且在釀酒酵母KIN1-1N02基因間區(qū)中進行CrtYB表達盒的整合。
[0124]在SC退出板(dropout plate)上生長的菌落在產生P -胡蘿卜素時表現(xiàn)出橙色形成。通過提取到甲醇中和LC / MS分析來定量(6-胡蘿卜素的存在。
[0125]實施例2:優(yōu)化的HBC和藏紅花酸二醛的酵母生產
[0126]已知藏紅花酸由藏紅花酸二醛形成，并且藏紅花酸二醛和羥基-P -環(huán)檸檬醛(HBC)在用玉米黃素切割雙加氧酶這種酶(ZCD)進行玉米黃素切割后生成。使用實施例1所述的eYAC和產生(6-胡蘿卜素的酵母菌株，將一批基因裝配到eYAC中以建立用于生物合成藏紅花酸二醛和HBC的最佳途徑。
[0127]通過酵母密碼子優(yōu)化合成(DNA2.0)產生了一批用于將P -胡蘿卜素轉化為藏紅花酸二醛的酶的基因類似物，并在多種甲硫氨酸阻遏型基因啟動子下插入eYAC進入載體(Entry Vector)中。Naesby 等，Microb Cell Fact.8:45(2009)描述了 eYAC 技術的使用。使示于表1的用于37種藏紅花生物合成基因的表達盒連接起來(有或沒有UGT基因)并連入到eYAC中。將兩種類型的eYAC轉化到產生P -胡蘿卜素的酵母菌株EFSC301中。該菌株是穩(wěn)定的類胡蘿卜素生產者，其通過將基于GPD / TPI啟動子的CrtYB / CrtE / Nc-A1-1基因表達盒整合在酵母ECM3和KIN13' UTR區(qū)域中來制備。
[0128]使用單一營養(yǎng)缺陷型選擇板得到了約800個菌落/板的酵母轉化效率。然后在雙營養(yǎng)缺陷型選擇板(亮氨酸-、色氨酸-)上重新劃線培養(yǎng)轉化體。使陽性轉化體在SC退出培養(yǎng)基(-亮氨酸、-色氨酸和-甲硫氨酸)中生長。在搖瓶中在30°c使細胞生長24至72小時，并且將無細胞培養(yǎng)液以及細胞提取物提取到有機溶劑中，并分析HBC、藏紅花酸二醛和藏紅花酸的存在。[0129]基于轉化酵母中生物合成的藏紅花酸二醛、藏紅花酸和HBC的含量，鑒定了高、中和低生產者。通過PCR篩選這些轉化體以確定高、中和低生產者的基因組成?；赑CR結果，鑒定了對于藏紅花酸二醛、藏紅花酸和HBC生產必需和非必需的基因，并且可通過以新組合和在新eYAC構建體中添加或缺失基因來進一步改善構建體。
[0130]表1:用于eYAC構建的基因來源
[0131]
【權利要求】
1.產生類胡蘿卜素的重組宿主，其包含編碼玉米黃素切割雙加氧酶(Z⑶)的外源核酸，其中所述ZO)任選地為藏紅花(Crocus sativus)ZO)。
2.權利要求1的宿主,其中所述宿主產生可檢測量的一種或更多種以下物質:藏紅花酸、藏紅花酸二醛或羥基-P -環(huán)檸檬醛(HBC)。
3.權利要求1至2中任一項的宿主，其中所述宿主包含編碼櫳牛兒基櫳牛兒基二磷酸合酶(GGPPS)、八氫番茄紅素合酶、八氫番茄紅素脫氫酶和(6-胡蘿卜素合酶的內源基因，和/或所述宿主包含編碼GGPPS、八氫番茄紅素合酶、八氫番茄紅素脫氫酶和3 -胡蘿卜素合酶的至少一種的外源核酸。
4.權利要求1至3中任一項的宿主，其中所述宿主還包含編碼P-胡蘿卜素羥化酶或醛脫氫酶的內源基因，或者編碼(6-胡蘿卜素羥化酶或醛脫氫酶的外源核酸。
5.重組宿主，其包含編碼GGPPS、八氫番茄紅素合酶、八氫番茄紅素脫氫酶、3-胡蘿卜素合酶、(6-胡蘿卜素羥化酶和玉米黃素切割雙加氧酶(ZCD)的至少一種的外源核酸，其中所述P -胡蘿卜素輕化酶任選地為法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous) P -胡蘿卜素羥化酶， 其中所述Z⑶任選地為藏紅花Z⑶，并且其中所述至少一種的外源核酸的表達產生可檢測量的藏紅花酸和/或藏紅花酸二醛。
6.權利要求1至5中任一項的宿主，所述宿主還包含編碼糖苷配基0-糖基尿苷5’-二磷酸(M)P)糖基轉移酶(0-糖基UGT)的外源核酸。
7.權利要求6的宿主，其中所述宿主產生可檢測量的藏紅花苦苷或藏紅花苷。
8.權利要求6或權利要求7的宿主，其中所述糖苷配基0-糖基UGT為UGT85C2、UGT73-EV12 或 UGT71 雜交酶。
9.權利要求1至8中任一項的宿主，所述宿主還包含編碼尿苷_5’- 二磷酸葡萄糖(UDP-葡萄糖)-藏紅花酸8，8’ -葡糖基轉移酶的外源核酸，其中所述UDP-葡萄糖-藏紅花酸8，8’ -葡糖基轉移酶任選地為藏紅花屬(Cr0cus)UDP-葡萄糖-藏紅花酸8，8’ -葡糖基轉移酶，并且其中所述任選的藏紅花屬UDP-葡萄糖-藏紅花酸8，8’-葡糖基轉移酶可以為 CsVrUGT2。
10.權利要求9的宿主，其中所述宿主產生可檢測量的藏紅花酸單葡糖苷或藏紅花酸二葡糖苷。
11.權利要求1至10中任一項的宿主，所述宿主還包含編碼UGT的外源核酸，所述UGT催化兩個葡萄糖部分之間的3葡糖基連接，其中催化兩個葡萄糖部分之間的所述3葡糖基連接的所述UGT任選地為UGI76G1。
12.產生藏紅花苦苷的方法，所述方法包括使HBC與糖苷配基0-糖基UGT和UDP-葡萄糖相接觸以產生藏紅花苦苷，其中所述糖苷配基0-糖基UGT選自UGT85C2、UGT73-EV12或UGT71雜交酶。
13.分離的核酸或核酸構建體，所述分離的核酸編碼與圖3所示UGT73氨基酸序列有至少80%序列同一性的UGT73多肽，所述核酸構建體包含與所述核酸可操作性連接的調節(jié)區(qū)。
14.分離的多肽，其與圖3所示UGT73氨基酸序列有至少80%的序列同一性或具有圖9所示的氨基酸序列。
15.SEQ ID NO: 58所示的合成的DNA序列，其編碼SEQ ID NO:57所示的氨基酸序列。
16.SEQ ID NO:65所示的合成的DNA序列，其編碼SEQ ID NO:66所示的氨基酸序列。
17.DNA表達盒，其包含權利要求13所述的分離的核酸或者權利要求15或16所述的合成的DNA序列，其中所述分離的核酸或合成的DNA序列與啟動子可操作性連接。
18.重組載體，其包含權利要求17所述的DNA表達盒。
19.重組細胞，其包含權利要求17所述的DNA表達盒或權利要求18所述的重組載體。
20.權利要求19所述的重組細胞，其中所述細胞選自酵母、大腸桿菌(E.coli)、植物細胞、哺乳動物細胞和昆蟲細胞。
21.權利要求20所述的重組細胞，其中所述酵母是釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。
22.產生藏紅花酸的方法，所述方法包括使藏紅花酸二醛與醛脫氫酶相接觸以產生藏紅花酸。
【文檔編號】C12N9/00GK103764818SQ201280038874
【公開日】2014年4月30日 申請日期:2012年8月7日 優(yōu)先權日:2011年8月8日
【發(fā)明者】沙拉姆·拉加萬, 約恩·漢森, 賽倫德拉·松卡爾, 薩西什·庫馬爾, 卡利安·K·庫馬爾, 穆拉利·潘沙佩奇薩, 埃斯本·哈爾克耶爾·漢森, 克拉夫斯·里謝德·漢森 申請人:埃沃爾瓦公司